细胞稳定化的制作方法
【专利说明】细胞稳定化 发明背景
[0001 ]本申请要求于2013年6月13日提交的美国临时申请号61 /834，517的权益，该临时 申请通过引用全文并入本文。
技术领域
[0002] 本发明设及细胞的稳定化。 相关领域的描述
[0003] 有核细胞(例如，真核细胞)的长期储存通常需要在毒性冷冻保护剂DMSO的存在下 超低的溫度。除了由冷藏系统的常见失效导致的损失之外，活细胞从冷冻状态的恢复是有 挑战性的，且通常仅少部分的投入细胞存活。
[0004] 在过去的20年中，已花费数百万美元的研究基金来尝试开发用于在环境溫度下稳 定化真核细胞的替代方法。运些努力背后的动力是环境溫度稳定化的真核细胞储备物用于 生物医学研究、产品开发W及在诊断学、再生医学、治疗学、血液供应物流学和细胞移植中 直接应用的优势。
[000引基于对可在干燥状态下存活多年的极端微生物如缓步动物、轮虫或面虫（brine shrimp)的研究，有人假设可W在真核细胞培养物中开发模拟运一分子现象的技术和方案。 遗憾的是，即使在数十年的研究之后，仍未实现细胞的实用干燥储存稳定化。所描述的最好 的稳定化技术采用海藻糖一一一种非还原糖分子作为干燥介质。载有海藻糖的哺乳动物细 胞可被干燥但需要几乎立即再水化，并且即使那样存活率仍然有限。已经证明，干燥细胞储 存即使持续几分钟也会导致彻底的细胞死亡。
[0006] 因此，存在开发允许细胞在环境溫度下基本干燥储存且再水化时保持活力的制 剂、组合物和方法的需要。
【发明内容】
[0007] 本文所述的制剂、组合物和方法有利地使细胞在基本干燥的条件下储存时维持存 活状态，使得细胞在干燥储存至少一小时，且在某些实施方案中至少一周的时间段后再水 化时保持至少一种功能性质，例如，细胞活力，从而在无需冷冻或冻干的情况下显著增加可 用于运输和储存活细胞的时间。在本发明的一个方面，提供了组合物，其包含在没有冷冻或 任选地没有冻干的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1小时后 再水化时，再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本相同的功 能性质。
[0008] 在某些实施方案中，所述组合物包含至少一种干燥储存稳定剂，该干燥储存稳定 剂优选地选自氨基酸、合成氨基酸、肤、非还原糖、馨合剂、水溶性聚合物和四氨喀晚。在一 个实施方案中，不存在为糖分子（例如，海藻糖）的稳定剂，或者如果存在为糖分子的稳定 剂，则还存在另一种不是糖分子的稳定剂。
[0009] 在某些其他实施方案中，提供了包含至少一种调亡抑制剂、优选可逆调亡抑制剂 的组合物。示例性的调亡抑制剂选自阳服-e IF2-a抑制剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、 JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、IREl抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧 蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0010] 在另一个方面，提供了组合物，其中在脱水之前用包含至少一种调亡抑制剂的预 脱水制剂处理细胞W产生预处理的细胞。在某些实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂选 自PE服-eIF2-a抑制剂、ASKl抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、 IREl抑制剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1 抑制剂。
[0011] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PE服-eIF2-a抑制剂。
[0012] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是ASKl抑制剂。
[0013] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是NRF2-KEAP1抑制剂。
[0014] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是GSK3抑制剂。
[0015] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是MEK抑制剂。
[0016] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂。
[0017] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是JNK抑制剂和P38MAP激酶抑制 剂。
[0018] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是PI3K抑制剂。
[0019] 在一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是IRE-I抑制剂。
[0020] 在另一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是巧蛋白酶抑制剂。
[0021] 在又一个实施方案中，所述至少一种调亡抑制剂是脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0022] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种邸蛋白 伴侣诱导剂。
[0023] 在某些其他实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种自 隧诱导剂。
[0024] 在又一个实施方案中，所述预脱水制剂包含至少一种调亡抑制剂和至少一种存活 蛋白。
[0025] 在本发明的另一个方面，提供了包含再水化的细胞的组合物，其中该再水化的细 胞是在没有冷冻或冻干的情况下基本干燥储存的细胞，其中该细胞在基本干燥储存至少1 小时后再水化时，该再水化的细胞表现出至少一种与脱水和基本干燥储存之前的细胞基本 相同的功能性质。
[0026] 在某些实施方案中，所述细胞的再水化在再水化制剂的存在下发生，并且优选地 该再水化制剂包含至少一种调亡抑制剂。
[0027] 在某些其他实施方案中，所述再水化缓冲液中的至少一种调亡抑制剂选自PEW-e I F2-a抑制剂、ASK1抑制剂、NRF2-KEAP1抑制剂、JNK抑制剂、P38MAP激酶抑制剂、I RE 1抑制 剂、GSK3抑制剂、MEK抑制剂、PI3K通路抑制剂、巧蛋白酶抑制剂W及脫天蛋白酶-1抑制剂。
[0028] 在其他实施方案中，所述再水化制剂包含调亡抑制剂W及选自ER蛋白伴侣诱导 剂、自隧诱导剂和存活蛋白中的一种或多种。
[0029] 在一个实施方案中，再水化后的至少一种功能性质包括代谢活性。
[0030] 在某些实施方案中，所述代谢活性通过测定ATP含量或脫天蛋白酶测定试验来度 量。
[0031] 在某些其他实施方案中，再水化后的代谢活性在细胞再水化后24小时、细胞再水 化后48小时、细胞再水化后72小时或细胞再水化后一周测量。
[0032] 在其他实施方案中，所述组合物在再水化前W脱水形式稳定化至少24小时，在再 水化前W脱水形式稳定化至少48小时，在再水化前W脱水形式稳定化至少72小时，或在再 水化前W脱水形式稳定化至少一周。
[0033] 在其他方面，提供了脱水制剂，其包含抑缓冲液;合成氨基酸、水溶性聚合物；W及 第一氨基酸或肤。在某些实施方案中，所述脱水制剂进一步包含非还原糖、至少一种调亡抑 制剂或第二氨基酸。
[0034] 在又一个方面，提供了在没有冻干的情况下将一种或多种细胞在环境溫度下基本 干燥储存的方法，该方法包括:将一种或多种细胞在脱水制剂中溫育，W及在脱水制剂的存 在下使该一种或多种预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。在其他 方面，提供了在没有冻干的情况下将一种或多种细胞在环境溫度下基本干燥储存的方法， 该方法包括:将所述一种或多种细胞与包含调亡抑制剂的预脱水制剂一起溫育W产生一种 或多种预处理的细胞，去除所述预脱水制剂；W及在脱水制剂的存在下使所述一种或多种 预处理的细胞脱水，W产生一种或多种基本干燥储存的细胞。
[0035] 在一个实施方案中，所述方法中使用的脱水制剂包含至少一种干燥储存稳定剂， 并且在没有使用预脱水制剂时可进一步包含至少一种调亡抑制剂(在一个实施方案中其为 可逆调亡抑制剂）。
[0036] 在另一个实施方案中，所述方法进一步包括在将一种或多种细胞与所述预脱水制 剂一起溫育之前将所述一种或多种细胞固定至固体支持体上。
[0037] 在又一个实施方案中，所述方法进一步包括采用包含至少一种调亡抑制剂的再水 化制剂将所述一种或多种基本干燥储存的细胞再水化，W产生再水化的细胞。
[0038] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂中的至少一种调亡抑制剂与所述再水化制剂 中的至少一种调亡抑制剂相同，而在其他实施方案中，所述预脱水制剂中的至少一种调亡 抑制剂与所述再水化制剂中的至少一种调亡抑制剂不同。
【附图说明】
[0039] 图1是ER应激通路的S种近端ER跨膜传感器的示意图，（A)GRP78结合的失活状态， (B)GRP78的释放导致激活IREl。
[0040] 图2是邸应激通路(A)、由调亡抑制剂抑制的ER应激通路的阻断步骤和祀标(B)的 示意图。
[0041] 图3示出了采用本文所述的制剂和方法基本干燥储存的间充质干细胞(MSC)保持 在再水化时分化成脂肪细胞(B图）、骨细胞(C图）和软骨细胞(D图）的能力。
[0042] 图4示出了化La细胞在脱水和室溫下储存5小时后的长期活力。（A)干燥5小时并随 后进行五天的再水化后的细胞活力。(B)每毫升的活细胞数目。将细胞接种到新鲜的细胞培 养板中，并采用根据本文公开的一个实施方案的组合物对各组进行处理。
[0043] 图5示出了相对于未处理的对照的脫天蛋白酶3/7活化。脫天蛋白酶活化计算为在 标准组织培养条件下培养的测试样品中的活性与未处理的细胞的活性之比。使测试的细胞 脱水并在室溫下干燥储存5小时，随后进行5天的再水化。
[0044] 图6示出了细胞在脱水、干燥状态储存7小时并且储存后再水化后的存活。在重新 接种后3天W及再水化后共7天评价细胞活力。不同的稳定化制剂影响细胞存活W及细胞增 殖。未受到保护的对照和海藻糖稳定化的细胞没有产生任何存活的细胞。 发明详述
[0045] 不希望受任何理论的限制，预期本文所述的某些实施方案的制剂和组合物稳定化 细胞膜和细胞的细胞器的完整性，同时还阻断调亡(例如，通过在脱水前的限定阶段和在再 水化时阻断特定ER应激通路），W提供在环境溫度下储存至少一个小时的基本干燥的细胞， 该基本干燥的细胞在被再水化至少一小时的时间段后保持至少一种功能性质。在某些实施 方案中，采用调亡抑制剂阻断特定m?应激通路。在其他实施方案中，采用调亡抑制剂结合ER 蛋白伴侣诱导剂来阻断特定ER应激通路，W驱使ER应激通路朝向适应性反应而非调亡。
[0046] 在某些实施方案中，采用脱水制剂使细胞脱水，该脱水制剂优选地包含至少一种 干燥储存稳定剂和至少一种调亡抑制剂。
[0047] 在某些其他实施方案中，在将细胞在脱水制剂的存在下脱水W产生基本干燥储存 的细胞之前，采用包含调亡抑制剂的预脱水制剂预处理细胞预定的一段时间，例如1小时。 将基本干燥储存的细胞在再水化制剂的存在下再水化，该再水化制剂优选地包含调亡抑制 剂，该调亡抑制剂可与预脱水制剂中的调亡抑制剂相同或不同。在特定的一段时间，例如1 小时之后，去除再水化制剂，并且可根据预期的最终用途，将细胞在生长培养基或其他合适 的溶液和缓冲液中再水化。 定义
[0048] 除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的技术 人员通常理解的含义相同的含义。本文引用的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全 文并入本文。
[0049] 如本文所用的，术语"真核细胞"是指在真核生物(优选人类)的真核细胞发育的任 何给定阶段(包括受精的卵母细胞、母细胞W及其他胚胎阶段、胎儿或成人）的体液或组织 中存在的至少一种有核细胞。可采用本发明的制剂、组合物和方法在环境溫度下基本干燥 储存的示例性细胞包括但不限于成纤维细胞、角质形成细胞、软骨细胞、黑素细胞、成骨细 胞、骨细胞、肌细胞、屯、肌细胞、神经元、雪旺细胞、胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、 T细胞、B细胞、记忆细胞、网织红细胞、单核细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细 胞、巨隧细胞、巨核细胞、树突细胞、脂肪细胞、膜岛细胞、卵母细胞、精母细胞、胎盘厮带血 细胞、母细胞、合子、上皮细胞(例如，乳腺细胞、子宫内膜细胞、膜腺腺泡细胞、杯状细胞、朗 格汉斯细胞、成釉细胞和帕内特细胞）、牙细胞(odontocytes)、肝细胞、脂细胞、壁细胞、肺 细胞、内皮细胞、肿瘤细胞、循环肿瘤细胞、视网膜光感受器和色素细胞、晶状体细胞W及干 细胞(包括多能或全能胚胎干细胞、胎儿干细胞、iPS细胞和间充质干细胞)或其混合物。干 细胞可WW未分化或部分分化状态在环境溫度下基本干燥储存。
[0050] 如本文所用的，术语"预处理的细胞"是指在脱水之前已经用包含至少一种调亡抑 制剂的预脱水制剂处理过的细胞。预处理的细胞预先载有调亡抑制剂，W允许采用含有或 缺少调亡抑制剂的脱水制剂在没有m?应激通路活化的情况下基本干燥储存预处理的细胞。 在某些实施方案中，在添加脱水制剂之前，将包含调亡抑制剂的预脱水制剂从预处理的细 胞中去除，但细胞内调亡抑制剂的浓度足W在没有邸应激通路活化的情况下基本干燥储存 细胞。
[0051 ]如本文所用的，术语"在环境溫度下基本干燥储存"或"在环境溫度下基本干燥储 存的"是指采用本发明的制剂、组合物和方法，在没有冷冻或冻干的情况下将细胞在环境溫 度下储存，同时使细胞在再水化状态下保持至少一种功能性质的能力。基本干燥储存的细 胞不一定需要消除所有的内部自由水，但优选去除至少45%、至少50%、至少60%、至少 70%、至少80%、至少90%、至少95%或最多98%的内部自由水。根据待干燥储存的细胞的 类型、所使用的预脱水和/或脱水制剂W及基本干燥储存的细胞的预期用途，可将基本干燥 储存的细胞在环境溫度下储存不同的时间段。可将细胞W脱水状态储存W下的时间段：1) 数小时，例如，1、2、6、12或18小时；2)数天，例如，1天、2天、4天或6天;3)数周，例如，1周、2周 或3周;4)数月，例如，1个月、2个月、4个月、6个月、8个月或11个月；W及5)甚至数年，例如，1 年、2年、5年、10年、20年或更多年。
[0052] 如本文所用的，术语"固定的"是指粘附于固体表面或与固体表面直接接触的基本 干燥储存的细胞。可将细胞在添加脱水制剂和干燥之前固定，或可在预脱水步骤之前固定 并在整个脱水过程中保持固定。合适的固体表面包括但不限于:载玻片、珠子、忍片、膜、片、 网、柱、亲和树脂、海绵、塑料(包括96孔板）、培养皿和烧瓶、管、容器、器皿、天然基质(诸如 但不限于胶原和藻酸盐水凝胶)或细胞可W借其生长的任何其他基层。
[0053] 如本文所用的，"调亡抑制剂"是指能够下调、减少、抑制或W其他方式调节所期望 的酶的量和/或活性或通路(优选地在ER应激通路中的步骤)W防止诱导细胞调亡的任何化 合物或试剂，包括ER蛋白伴侣诱导剂、自隧诱导剂W及内源或外源性存活蛋白。对运些酶或 通路的抑制可通过本领域已知的多种机制中的任何机制来实现，该机制包括但不限于:直 接与酶结合(优选W可逆的方式），或者短暂地抑制编码酶或祀标的基因的表达(例如，转录 成mRNA，翻译成新生多肤，和/或最终多肤修饰成成熟蛋白质）。调亡抑制剂包括本文所述的 具体的调亡抑制剂。
[0054] 如本文所用的，术语"抑制"是指化合物或试剂下调、减少、降低、抑制、灭活或至少 部分地抑制酶的活性或者酶或蛋白质的表达的能力。优选地，该抑制是可逆的。 ER应激通路
[0055] 在某些实施方案中，所述预脱水制剂、脱水制剂和/或再水化制剂包含至少一种调 亡抑制剂，该调亡抑制剂阻断ER应激通路中的至少一个必要步骤。
[0056] 如图IA所示，高等真核生物的未折叠蛋白质反应(UPR)信号传导通过S个近端邸 跨膜传感器一阳服、激酶/RNA酶IRE巧日转录因子ATF6来引发(例如，参见Kaufman RJ(2002) J Clin Invest HO:1389-1398.doi:10.1172/jci0216886；Mori K(2000)Cell 101:451-454.doi:10.1016/s0092-8674(00)80855-7;Ron D，Walter P(2007)化t Rev Mol Cell Biol 8:519-529.(1〇1:10.1038/11^11219)。阳服的活化通过61的〇(〇翻译起始因子）的憐酸化 导致蛋白质翻译在整体范围内的抑制（图lB;Harding等人，（2000)1〇10611 5:897-904.(1〇1:10.1016/31097-2765(00)80330-5)。与此相伴，阳服通过增加转录因子41。4的翻 译促进UPR特异性基因的转录。IRE1通过从XBP1 mRNA上切除内含子产生选择性剪接的更有 效形式的XBPl (例如，参见Calfon等人（2002)化ture 415:92-96. doi : 10.1038/415092a)。 第SUPR传感器一ATF6，是一种ER跨膜蛋白质，在其胞质侧上具有转录激活结构域。
[0057] 如图2A所示，在邸应激事件中，ATF6经历蛋白质水解，由此从邸膜释放其胞质反式 激活结构域。一旦被释放，该胞质反式激活结构域即进入细胞核化aze等人，（1999)Mol Biol Cell 10:3787-3799.doi :10.1091/mbc. 10.11.3787)并启动另外的UPR基因的转录。 由UPR引起的ER应激的近端传感器的活化导致复杂的基因调节模式。因此IPR信号旨在通过 上调邸蛋白伴侣如BiP、GRP94、巧网蛋白和化dj4提高蛋白质折叠能力来减轻和减少邸中高 水平的错折叠蛋白质（例如，参见Okada等人，（2002)Biochem J 366:585-594.doi: 10.1042/bj20020391;Yoshida等人，（1998)J Biol Chem 273:33741-33749.doi :10.1074/ jbc. 273.50.33741)。然而，在邸中的正确蛋白质折叠无法得到恢复的事件中，基因如CHOP 被上调并可导致调亡通路的激活。 l.GRP78/BiP
[0058] GRP78/BiP是内质网完整性和应激诱导的自隧所需的分子蛋白伴侣HSP家族的成 员。GRP78在调节未折叠蛋白质反应化PR)中起核屯、作用，并且是真核细胞中自隧的专性组 分，并可在细胞适应和致癌存活中发挥重要作用。GRP78的一种客户蛋白质是蛋白质双链 RNA激活的蛋白样内质网激酶(PE服），并且其与阳服的结合阻止阳服寡聚。GRP78还与客户 蛋白质IREl和ATF6结合W防止IREl的寡聚和ATF6的活化。GRP78在促进邸内部多聚体蛋白 质复合物的组装中发挥作用。 2.IREl
[0059] 需要肌醇的酶I(IREl)是一种具有核酸内切酶活性的ser/thr蛋白质激酶。IREl在 作为对基于内质网的应激信号的响应而改变基因表达方面是重要的，并且通过其N末端结 构域感测内质网的网眼中的未折叠蛋白质，从而导致酶的自活化。活性的核糖核酸内切酶 结构域对XBPlmRNA进行剪接W产生新的C末端，从而将其转化成有效的未折叠蛋白质反应 转录激活因子并触发生长停滞和调亡。激酶结构域通过反式自憐酸化而得到激活，并且激 酶活性对于核糖核酸内切酶结构域的活化是必需的。IREl被广泛表达且在膜腺组织中观察 到其高水平。IREl是二硫键连接的同二聚体，且二聚体形成由N末端腔结构域内的疏水作用 驱动并通过二硫键而稳定化。IREl还与HSPA5(未折叠蛋白质反应的负调节物)结合。该相互 作用可破坏同二聚体化作用并阻止IREl的激活。 3. 阳服
[0060] 真核生物翻译起始因子2-a激酶3，也称为P服R样内质网激酶或蛋白质激酶R(PKR) 样内质网激酶(PE服），是一种在人类中由EIF2AK3基因编码的酶。PE服对真核生物翻译起始 因子2化IF2)的a亚基进行憐酸化，导致其失活，并由此导致翻译引发的快速减少和对总体 蛋白质合成的抑制。它是位于内质网化R)中的I型膜蛋白，在内质网中它通过由错折叠蛋白 质导致的ER应激而得到诱导。 4. ATF6
[0061] 运种基因编码在内质网化R)应激过程中激活未折叠蛋白质反应(UPR)的祀基因的 转录因子。虽然它是转录因子，但运种蛋白质是不常见的，因为它作为嵌入ER中的跨膜蛋白 质而合成。它起到邸应激传感器/转导器的作用