获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞株的方法及应用的制作方法

获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞株的方法及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种获得适用于灌流发酵生产工艺的高产稳定表达细胞株的方法。本发明的方法由五个阶段组成：高产稳定表达细胞株的获得、工业规模细胞株生产力的评价、纯化的单克隆抗体的特性分析、不同工业规模的产品特性评价、不同发酵时期的产品特性评价。这种方法的细胞株是从重组NS0骨髓瘤细胞系中获得的，该重组NS0骨髓瘤细胞系用于生产治疗癌症的抗EGFR单克隆抗体。这种方法获得的细胞株在不同的发酵规模、不同发酵运行时间的条件下保持了本身的生长特性、高表达特性和表达产物特征的一致性，适用于不同的工业规模下商业化生产治疗性抗体。本发明的方法克服了哺乳动物细胞系在灌流发酵工艺中产量降低的问题。
【专利说明】获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞株的方法及应用

【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种获得高产稳定表达细胞株的方法，该方 法获得的细胞株在灌流发酵工艺中具有优越生产性能，可在不同的工业规模中生产治疗性 抗体。

【背景技术】
[0002] 目前治疗性抗体药物是生物制药的一个重要类别，一些治疗性抗体已经被批准 注册用于治疗癌症、自身免疫性疾病和其他慢性疾病，几十种重组抗体正处于临床开发的 不同阶段（Reichert JM, MAbs 2012，May-June, 4(3) :413_5; Reichert JM, Dhimolea E, Drug Discovery Today 2012, Sept, 17(17-18): 954-63; Biologic Medicines in Development, Phrma Report 2013, www.phrma.com)。通常患者每次剂量需要数百毫克的 治疗性抗体，因此目前的产能需求巨大。
[0003] 重组治疗性抗体是一种复杂的糖蛋白，不得不通过哺乳动物细胞培养生 产（Wurm FM. Nat Biotechnology 2004， 22:1393-1398; Barnes L， Dickson A， CurrOpinBiotechnol 2006，17:381-386)。对生物制药行业来说哺乳动物细胞的大 规模培养遭遇了诸多挑战，虽然重组抗体在理化特性方面已经取得了巨大的进步， 但是治疗性抗体分子的特性由工艺过程决定的观念仍然被普遍接受。生产工艺的 任何变化，例如发酵规模、细胞培养基、细胞传代次数等，都可能会影响产品的性能 (Demonstration of comparability of human biological products, including therapeutic biotechnology-derived products, Center for Biologies Evaluation and Research (CBER), Center for Drug Evaluation and Research (CDER) April 1996. www. fda.gov ; EU Guideline on Comparability of Medicinal Products containing Biotechnology-derived Proteins as Active Substances: Quality issues (CPMP December 2003) www. emea. europa. eu ; ICH Q5E: Comparability of Biotechnological/Biological Products Subject to Changes in their Manufacturing Process. EU: Adopted by CMPM, December 1, 2004, CPMP/ICH/5721/03, date for coming into operation: June 2005; MHLff: Adopted 26 April 2005, PFSB/ELD Notification No. 0426001; FDA: Published in the Federal Register, Vol. 70, No. 125，June 30，2005; 37861-2. www.ich.org)。
[0004] 哺乳动物细胞大规模培养生产治疗性抗体必须在无血清培养基中进行。无蛋白培 养基已经用于生物制品的生产，例如生产重组抗体的NS0细胞株已成功地在无蛋白培养基 PFHMII中生长（W0 2004/038010 A1)。然而，适应无血清培养基和在无血清培养基中长时 间发酵通常伴随着细胞系生产力的损失（Barnes L, et al·，Biotechnol Bioeng 2004， 81: 631-639)。灌流发酵生产工艺具有高密度培养及获得高浓度抗体收获液的潜能，然而 这种长时间的高密度细胞培养需要稳定的高表达细胞株来真正地优化抗体的生产。
[0005] 专利ZL95118826. 7描述了一种获得针对表皮生长因子受体（EGFR)的嵌合抗体和 人源化抗体的方法，及其在诊断和治疗由这些受体表达的肿瘤疾病中的应用。在本发明中， 我们在专利ZL95118826. 7中小鼠骨髓瘤NSO细胞的转染克隆基础上，建立了一种获得适用 于灌流发酵生产工艺的稳定高表达细胞株的方法。这种方法得到的细胞株是从重组NSO骨 髓瘤细胞系中获得的，该重组NSO骨髓瘤细胞系用于生产治疗癌症的抗EGFR单克隆抗体。 这种稳定的高表达细胞株在不同的工业规模、不同发酵时间的条件下保持了本身的生长性 能、高表达特性和表达产物特征的一致性，适用于不同工业规模下化生产治疗性抗体。


【发明内容】

[0006] 本发明的生产过程弥补了灌流发酵工艺中哺乳动物细胞系产量降低的缺陷。本发 明的方法由以下五个阶段组成： 1、 稳定高表达细胞株的重新筛选； 2、 工业规模细胞株生产力的评价； 3、 纯化的单克隆抗体的特性分析； 4、 不同工业规模的产品特性评价； 5、 不同发酵时期的产物产品特性评价。
[0007] 第一步是采用有限稀释方法获得细胞克隆后（Freshney，R. Ian (2010). Culture of animal cells: (6th ed. ). Hoboken, N. J. : ffiley-Blackwell. pp. 208 - 211. ISBN 9780470528129 ; Davis, edited by John M (2011). Oxford: Wiley-Blackwell. pp. 239 - 240. ISBN 978047066658-6)，采用抗人 IgG 抗体偶联 FITC 进行细胞内免疫球蛋白的染色并经流式细胞术检测（Pluschke et al.，BMC Proceedings 2011，5 (Suppl 8) :P97)，分别在连续细胞培养10天和90天后测定每个克隆的平均荧 光强度（MFI)和阳性细胞百分比。在转瓶中利用动力学试验进行进一步特性分析，条件为 100rpm，37° C，5% 0)2细胞培养。细胞克隆显示出均一的表达抗体的细胞群，平均荧光强 度高于1〇3,目标产品比生产速率值（QP)高于3Χ1(Τ μ g/cell/h，选择较好性能的细胞克 隆在工业生产中进行了生产率评价。
[0008] 在1000L和2500L发酵罐中，采用预先选好的细胞克隆进行发酵生产。灌流发酵 工艺中采用90%以上活力的细胞接种。运行参数为37°C，5% C02，恒定的氧分压和葡萄糖 浓度，细胞灌流浓度保持在（10-20) X 106cell/mL，灌流速率升高到0. 8WD，细胞培养90天 后终止灌流工艺。发酵运行过程中监测存活细胞数和抗体浓度。目标抗体浓度为200 μ g/ ml以上。
[0009] 发酵的下游工艺是通过基于两个主要分离色谱步骤的标准纯化步骤来进行的：蛋 白A亲和层析与离子交换色谱。抗体纯化工艺的目标平均产量大约为200 mg/L -300mg/L， 纯度大于95%。
[0010] 采用的参考品来自于纯化的抗体，经如下的分析技术进行进一步的特性分析：

【权利要求】
1. 一种获得高产稳定表达重组抗体的骨髓瘤细胞的方法，所述方法用于工业规模中生 产治疗抗体，其特征在于，所述的方法包括五个阶段： (1) 1?广稳定表达细胞株的获得； (2) 工业规模上细胞克隆产量的评价； (3) 纯化的单克隆抗体的特性分析； (4) 不同工业规模上产品特性的评价； (5) 不同发酵时间的产物产品特性的评价。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（1)中包括以下步骤： (1) 选择细胞内免疫球蛋白染色呈现单峰的细胞克隆，且平均荧光强度大于1〇3 ; (2) 转瓶内进一步动力学研究，选择比生产率高于3X 1(Γ7μ g /cell/h细胞克隆。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（2)包括以下步骤： (1) 在1000L工业规模灌流发酵运行90天，通过测量90 %以上活力的活细胞浓度和最 大值高于200 μ g /ml时免疫球蛋白浓度评价所选克隆的生产能力； (2) 在2500L工业规模灌流发酵运行90天，通过测量90%以上活力的活细胞浓度和最 大值高于200 μ g /ml时免疫球蛋白浓度评价所选克隆的生产能力。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（3)包括以下步骤： (1) 采用蛋白A-亲和层析和离子交换层析从发酵收获液中纯化抗体，所述抗体的平均 产量为200 mg/L - 300mg/L，纯度大于95% ; (2) 使用下列分析技术对参考品进行特性分析：质谱法测定氨基酸序列及翻译后修饰， 质谱法检测分子量，高压液相法分析肽图图谱及糖基化组成，弱阳离子交换色谱法测定电 荷异质性，表面等离子体共振法测定亲和性，分析超速离心法分析沉降系数及分子量。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（4)包括以下步骤： (1) 评价1000L和2500L发酵规模的产品样品的肽图图谱、电荷异质性和糖基化修饰； (2) 与参考品进行可比性分析，显示无显著差异。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阶段（5)包括以下步骤： (1) 随着发酵的运行，评价不同细胞培养时期产物的分子量质谱数据、肽图谱、弱阳离 子交换色谱法测定的电荷异质性、糖基化组成、分析超速离心法分析的沉降系数和分子量、 表面等离子体共振法测定的亲和性； (2) 与参考品进行可比性分析，显示无显著差异。
7. 根据权利要求1-6任一项所述的方法，所述的骨髓瘤细胞系为NS0细胞系。
8. 根据权利要求7所述的方法，所述NS0细胞系生产抗EGFR hR3抗体。
9. 根据权利要求8所述的方法，选择使用NSO细胞系中稳定高表达的细胞克隆，命名 为2025/M031212,所述细胞克隆2025/M031212可制备以治疗为目的的人源化单克隆抗体 hR3。
10. -种人源化单克隆抗体hR3的制备方法，所述方法包括使用权利要求9所述的细胞 克隆2025/M031212在不同工业规模进行灌流发酵工艺。
11. 一种包含人源化单克隆抗体hR3的药物活性成分，所述药物活性成分利用权利要 求10所述的方法制备。
【文档编号】C12R1/91GK104152415SQ201410395389
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月13日 优先权日:2014年8月13日
【发明者】路明, 喻志爱, 何伟, 蔡杨柳, 米盖尔, 林峰, 美林, 胡里奥, 罗兰多 申请人:百泰生物药业有限公司, 分子免疫中心