G6pd过表达型achn稳转细胞株及其构建方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医学分子生物学相关技术，尤其是采用siRNA干扰技术构建细胞研究 模型。
【背景技术】
[0002] 葡萄糖 _6_ 憐酸脱氧酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase,G6PD)广泛存在 于生物体的各组织细胞中，是戊糖磷酸途径（pentose-phosphatepathway,PPP)的关键酶。 G6H)基因定位于Xq2. 8 (NM_000402)，全长18kb，由13个外显子和12个内含子组成，其mRNA 全长2395bp，cDNA为1548bp，编码515个氨基酸，单个亚基分子量为59kDa，有活性的G6H) 以二聚体或四聚体状态存在。G6PD在催化葡萄糖6-磷酸（glucose-6-phophte，G-6-P)脱氢 生成6-磷酸葡萄糖酸内酯的同时产生还原型烟酰胺腺噪呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adeninedinucleotidephosphate,NADPH)。NADPH可维持细胞内还原型谷胱甘肤 (glutathione，GSH)水平，在体内自由基和过氧化物清除过程中发挥着重要作用。PPP的另 一重要产物为核糖5-磷酸（ribose-5-phosphate,R-5-P)，是合成核酸的基本原料。PPP其 他中间产物，如果糖6-磷酸和甘油醛3-磷酸则可进入糖酵解（glycolysis)及三羧酸循环 (tricarboxylicacidcycle,TAC)，继续氧化供能。
[0003] 越来越多的研究表明，G6H)表达或者活性与多种肿瘤的发生发展关系密切。F0hl 等发现，G6H)基因在正常组织与膀胱癌组织细胞的转录存在明显差异，而且其mRNA的高 低与肿瘤的恶性程度相关。YKekec以及JWang等的研究均表明，G6H)在胃癌组织中高表 达，并且G6H)活性与肿瘤的恶性程度呈正相关。白血病患者的红细胞中G6H)呈现高表达 和高活性。Wei-yingK等报道，G6H)高表达的NIH3T3细胞呈现升高的NADPH和GSH，伴 随着细胞增殖异常、诱发裸鼠成瘤能力增强等特点。联合运用G6H)抑制剂2-脱氧-D-葡 萄糖（deoxy-D-glucose，2_DG)和 6-氨基烟醜胺（6-aminonicotinamide，6-AN)可增加人 神经胶质瘤及鳞状细胞癌细胞系对放射性治疗的敏感性，改善疗效。我们先前的研究亦表 明，G6H)过表达在人恶性黑色素瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。应用siRNA-慢病 毒载体靶向敲低人皮肤黑色素瘤A375细胞内源性G6H)表达，构建G6H)缺陷的A375细胞 (A375-G6H)A)，并发现A375-G6H)A细胞呈现生长增殖抑制，肿瘤形成能力降低，凋亡率 升高，对巯基氧化剂二酰胺诱导的氧化应激更敏感。然而，迄今为止，G6H)在肿瘤发生、发 展过程中的分子机制尚未阐明，有待进一步研究。
[0004] 肾癌又称肾细胞癌，是泌尿系统中恶性程度较高的肿瘤，约占成人肾脏恶性肿瘤 的80%?90%，占成人恶性肿瘤的2%?3%。世界范围内各国或各地区的发病率各不相 同，总体上发达国家发病率高于发展中国家，城市高于农村，男性多于女性，男女患者比例 约为2:1，发病年龄可见于各年龄段，高发年龄50?70岁。据统计，目前我国肾癌发病率正 呈逐年上升趋势，且肾癌的病因未明。虽然外科手术是公认的肾癌治疗手段，但约有1/3肾 细胞癌患者在初诊时已有远处转移，术后约有1/2病人在一定时间内将出现转移。此外，肾 细胞癌对绝大部分放化疗以及生物治疗十分不敏感。因此，明确肾细胞的发病机制，寻找有 效的化学、免疫等辅助疗法对改善肾细胞癌的预后，成为亟待解决的问题。
[0005] 本发明人采用免疫组化方法已经证实，G6H)在人肾细胞腺癌组织中表达量比癌旁 正常组织高，差异有统计学意义。但是G6ro表达或者活性变化与肾细胞癌发生发展的关系 及其机制又是怎样的呢？目前国内外尚无相关报道。
【发明内容】
[0006] 本发明旨在提供一种G6H)过表达型ACHN稳转细胞株，作为细胞模型用于研究 G6ro与肾细胞癌的相关性及其作用机制。
[0007] 本发明所述的G6TO过表达型ACHN稳转细胞株是一种G6TO过表达型ACHN稳 转细胞株，是将pBABE-pur〇-G6ro转染人肾细胞腺癌细胞株ACHN，经嘌呤霉素加压筛选， Real-timePCR、Westernblot验证，以及反复传代、冻存复苏所得的G6H)表达量稳定增加 40倍以上的细胞株。
[0008] 本发明所述的G6H)过表达型ACHN稳转细胞株的构建方法包括以下步骤：
[0009]一、G6PD基因的克隆
[0010] 用Primer5. 0软件设计针对人G6PD基因的PCR正向引物5'-GGAAITCATGGCAGAG CAGGTGGCCCTG-3' 和反向引物 5' -ACGCGTCGACTCAGAGCTTGTGGGGGITCAC-3'，分别引入EcoR I和SalI酶切位点，以pMD19-Tsimple-G6PD-WT质粒DNA为模板，通过PCR扩增出G6PD 的编码序列1548bp，纯化PCR产物，获得G6H)基因的cDNA;
[0011] 二、pBABE-puro-GGH)重组表达载体的构建
[0012] 上述G6PD基因cDNA的PCR纯化产物和pBABE-puro载体分别用EcoRI和Sal I进行酶切，用TaKaRa的T4DNA连接酶进行连接，转化E.coliDH5a，涂布平板，过夜培 养；随机挑取2个单菌落进行扩增培养，提取质粒后进行EcoRI和SalI双酶切鉴定；对 于酶切鉴定正确的质粒进行测序及序列的分析比对；扩增培养测序正确的阳性克隆，提取 其不含内毒素的pBABE-pur〇-G6ro重组质粒；
[0013] 三、ACHN细胞株的转染
[0014] 复苏培养ACHN细胞至状态良好，转染前一天传代细胞至6孔板，每孔加入2 X105 细胞，次日观察其汇合度为70 %?80%时进行细胞转染；转染采用Lipofectamine 2000转 染试剂和〇pti-MEM培养基；6孔板每孔的转染量为4 ii g质粒稀释到250 ii L Opti-MEM培养 基，得到A液，取10 ii L Lipofectamine 2000溶解于250 ii L Opti-MEM培养基，得到B液， 室温孵育5min后将A液和B液混合，室温孵育20min后加入弃培养基的细胞中；孵育6? 8hr后更换为新鲜不含抗生素的完全培养基；
[0015] 四、ACHN-G6PD稳定细胞株的筛选及鉴定
[0016]细胞转染换液24hr后，更换完全培养基为含0. 25yg/mL嘌呤霉素的筛选培养 基，压力筛选一周，中间换一次液；一周后在倒置显微镜下观察，把单独每一个细胞群圈出， 用0. 25%胰酶消化画圈的细胞群，每一团细胞收集到新的24孔板的一个孔培养；继续用 0. 25yg/mL的嘌呤霉素压力筛选一周；倒置显微镜下观察，进行亚克隆筛选，挑选出正常 生长细胞群传代，逐步放大培养；应用Real-timePCR、Westernblot分别在mRNA和蛋白水 平检测转染细胞株G6H)的表达水平，用紫外分光光度法在340nm检测G6H)酶活性；将稳转 细胞株反复传代、冻存及复苏，观察其G6H)表达是否稳定；ACHN-G6H)细胞株已在体外传代 20次以上，其G6ro表达量稳定增加40倍以上，G6ro酶活性增加2. 2倍，表明G6ro过表达 型ACHN稳转细胞株构建成功。
[0017] 本申请是用PCR技术从pMD19-Tsimple-G6PD-WT质粒中扩增得到人G6H)基因 (NM_001042351. 2)的cDNA，分别用EcoRI和SalI双酶切扩增产物cDNA和pBABE-puro 表达质粒后，用T4DNA连接酶将cDNA克隆入pBABE-puro质粒，构建pBABE-pur〇-G6ro重 组表达载体。该载体具有嘌呤霉素（puromycin)抗性基因，可用嘌呤霉素进行筛选以建立 稳定细胞系。经嘌呤霉素加压筛选后，pBABE-pur〇-G6ro载体可稳定整合入ACHN细胞的基 因组中，从而使G6H)基因可在ACHN细胞中持续过表达。应用Real-timePCR和Western blot进行检测，结果显示ACHN-G6H)细胞株的G6H)表达量可稳定增加40倍以上，G6H)酶 活性升高2. 2倍，表明G6H)过表达型肾细胞癌细胞系构建成功。
[0018] 上述ACHN细胞株为现有技术，购自中国科学院细胞库。它来源于一位22岁白种 男性广泛转移的肾细胞腺癌患者的胸腔积液，由TFHogan等人于1979年建系。该细胞贴 壁生长，属上皮细胞，具有致瘤性（接种该细胞至免疫抑制的裸鼠，可在21d内100%长出侵 袭性肾癌基本特征的肿瘤）。干扰素可抑制该细胞的生长，因此，ACHN多用于干扰素及其诱 导剂的抗增殖研究。经细胞遗传学分析，该细胞DNA上的短串联重复序列（shorttandem r印eat,STR)包括：Amelogenin:X;CSF1P0:11 ;D13S317:12 ;D16S539:12, 13 ;D5S818:12 ; D7S820:9, 11 ;TH01:8 ;TP0X:8, 11 ;vWA:16, 17。本发明所述的G6PD过表达型ACHN稳转细 胞株是将人G6H)的cDNA双链片段插入pBABE-puro表达载体，再转入ACHN细胞株，经阳性 细胞克隆筛选，得到G6H)表达量达稳定增加40倍以上的稳转ACHN-G6H)细胞株。
[0019]pMD19-Tsimple-G6PD-WT质粒DNA是含有正常人G6PD基因cDNA双链的克隆载 体。EcoRI和Sa