专利名称：将多细胞排列约束在稳定的、定态的、和可复制的空间构型中的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学领域，并可用于生物芯片、目标化合物的筛选、诊断学、以及细胞/基因治疗。具体地说，本发明涉及获得具有稳定的、定态的、和可复制的空间构型的多细胞排列的方法和装置。
背景技术：
培养的细胞采用随机的空间组构，在所述空间组构中细胞的定位是不可预见的。 细胞被永久地拉动和推动着。它们因而根据细胞间相互作用的波动而运动。还没有工具能够控制这些多细胞排列中的细胞的位置和形状。有一些工具可使细胞彼此分离开并控制它们的形状微图案化 (micro-patterning)。据此，可以通过将细胞外基质蛋白移植在固体支撑物上来制备粘附性图案(adhesive patterns)。那些蛋白诱导细胞粘附，并促使细胞附着和展平在固体支撑物上。因此，可将细胞约束在正方形、圆形、三角形、或更复杂的几何形状中，几何形状的尺寸与细胞的尺寸相对应。于是所有细胞都具有了相同的形状，甚至可以采用非常可复制的内部组构。在PCT申请WO 2005/026313中已公开了合适的微图案。然而，以此方式受到约束的细胞被隔离开，并不与其它细胞进行直接的接触。因此，为了避免固定在支撑物上的细胞之间的任何接触，通过周围的斥细胞区(cytophobic region)将粘附性图案上的每个细胞与其它细胞隔离开。粘附性图案的尺寸要使得每个单独的细胞都能够辅开。这是这个技术的主要缺点。事实上，通过调节细胞的尺寸、形状、以及位置来控制组织的机械和功能性粘着的生物学机制不仅要依靠细胞与细胞外基质的锚着，还要依靠细胞与邻近细胞的附着。除了它们的机械作用之外，细胞-细胞相互作用还有助于调节与增殖、分化、以及凋亡同样重要的细胞活动的生物化学信号传导途径。为了在细胞培养中复制组织中的细胞条件，因而需要两类接触与细胞外基质的接触、和细胞之间的接触。为了达到对一群来自一种个体细胞的几个细胞的形状控制，最简单的解决方法是使用较大的微图案(micro-pattern) (Nelson 和 Chen，2002，FEBS Letters，514，238-242)。然而，在这一背景下，微图案化技术达到了它的局限。事实上，两个细胞约束在同一个图案上时，它们可以建立两类接触(与粘附性图案的细胞-基质接触，和与邻近细胞的细胞-细胞接触)，但是它们还可以移动，并例如占据另一个细胞的位置。因此，它们倾向于围绕着彼此移动。它们不采用机械平衡来使它们稳定在一个定态的构型中。有专门讲述一对细胞在微图案上的移动的科学文章(Brangwynne等，2000，In Vitro Cell Dev Biol Anim，36，563-5 ；Huang等，2005，Cell Motil Cytoskeleton，61，201-213)。另外，细胞位置、 细胞-细胞接触区的位置和尺寸没有受到控制，所以极性和内部组构也是如此(Nelson和 Chen，2002)。在Huang等，2005中，作者观察到在正方形图案上的两个NIH 3T3细胞没有围绕着彼此移动，并在正方形的对角之间形成了在对角线上延展的直的细胞-细胞边界。
Nelson等人开发了另一个系统来控制细胞的位置和细胞-细胞接触(Nelson和 Chen，2002，同上；Nelson 和 Chen，2003，J Cell Science，116，3571-3581)。细胞被约束在深度为约IOym的琼脂糖微孔中。所述微孔具有领结的形状。琼脂糖阻止了蛋白质吸附和细胞粘附。当有两个细胞存在于微孔中时，每个细胞各自位于领结形状的两个三角形中的一个之中。微孔的深度和它们的琼脂糖组成将细胞约束在三角形中，并且细胞不能跨出移动至另一半的三角形中。然而，在这样的领结状微孔中，肌动蛋白的结构看来没有被很好地控制。另外，细胞间的接触区被收窄到两个三角形之间的瓶颈处，而且为了防止细胞移动至另一半的三角形中，瓶颈必须是窄的。另外，细胞没有处于机械平衡。事实上，是领结状微孔的形状约束了细胞的位置。因此，细胞构型没有基于细胞之间的机械性相互作用。所以， 所述构型是人工制造的，而且没有复制组织中的细胞的生理条件。因此，对于获得具有稳定、定态和可复制的空间构型、并任选具有受控的内部细胞组构的多细胞排列的方法和装置，有强烈的需求。
发明内容
本发明提供了方法和装置以获得多细胞排列内的机械平衡。具体地说，它提供了具有特定几何形状的粘附性图案(adhesive pattern)，以防止细胞的旋转运动并赋予它们可以达到机械平衡以及定态的和可复制的构型的空间粘附条件。事实上，图案的几何形状可以控制细胞-基质锚着点，以防止这些锚着点的移动，以及由此产生的细胞在图案上的迁移。另外，图案的几何形状以稳定的和可复制的方式对细胞-细胞接触进行定向。具体地说，可以使用本发明的方法和装置获得大的细胞-细胞接触。基质与细胞之间以及细胞之间的锚着点的空间分布导致了机械平衡，而且细胞不移动。另外，本发明的方法和装置还可以获得可复制的内部细胞组构。因此，本发明涉及用于以具有机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列粘附至少两个细胞的方法和装置。本发明涉及以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列粘附至少两个相互作用的细胞的装置的应用，其包含-限定了平表面(planesurface)的板；和，-至少两个粘附性图案的组，其中通过基本上无粘附性的居间区域 (intercalating area)将所述至少两个粘附性图案彼此充分地分隔开，以防止第一个粘附性图案上的细胞触及另一个粘附性图案；而且，所述至少两个粘附性图案和居间区域覆盖的区域足以粘附至少两个动物细胞，而且其中至少两个粘附性图案的组由斥细胞的周围区域隔离开。具体地说，本发明还涉及用于或适于以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列粘附至少两个相互作用的细胞的装置，其包含-限定了平表面的板；和，-至少两个粘附性图案的组，其中通过基本上无粘附性的居间区域将所述至少两个粘附性图案彼此充分地分隔开，以防止第一个粘附性图案上的细胞触及另一个粘附性图案；而且，由所述至少两个粘附性图案和居间区域覆盖的区域足以粘附至少两个动物细胞， 而且至少两个粘附性图案的组通过斥细胞的周围区域被隔离开。
优选地，两个粘附性图案之间的距离在约2/3D至约4/3D之间，D是具有所述表面 S的圆盘(disk)的直径，优选在约3/4D至约5/4D之间，更优选为约D。优选地，每个细胞被粘附性图案所覆盖的区域小于细胞表面S的80、70、60、或 50%。优选地，基本上无粘附性的居间区域包含单个粘附区，所述粘附区适于不使细胞触及另一个粘附性图案。更优选，所述单个粘附区是位于两个粘附性图案之间的区，且具有小于 1/2D、优选小于1/3D、更优选小于1/4D的宽度。优选地，所述单个粘附区连接两个粘附性图案，从而使两个粘附性图案的组包含连接所述两个粘附性图案的单个粘附区。在优选的实施方案中，两个粘附性图案的组具有下列形状中的一个C、X、H、Ζ、以及Π。具体地说，粘附性图案可以由单个连通的粘附表面和/或由几个不连通的粘附表面构成。优选地，装置包含至少2组的至少两个粘附性图案。或者，装置包含至少4、8、16、或32个粘附性图案的至少2个组。具体地说，每个粘附性图案组可被设计用于两个以上细胞的多细胞排列，并覆盖 2500 μ m2 以上的区域，优选在 2600 和 50000 μ m2 之间，例如 2600、3000、3500、4000、4500、 5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、或 50000 μ τα 的区域。事实上，用于32个细胞的粘附性图案组可以覆盖32000 μ m2的表面，并且对于特殊的细胞类型来说甚至是 50000 μ m2。本发明还涉及使用本发明的装置用于筛选目标化合物、用于鉴别目标基因、或用于细胞机能障碍的诊断学。本发明涉及用于以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列来粘附至少两个相互作用性细胞的方法，其包含-选择要被粘附的细胞；-选择根据本发明的合适的装置；和，-在挑选的装置上培养细胞。优选地，所述方法包含测定细胞在没有任何约束的支撑物上所覆盖的表面，以确定细胞的尺寸，并根据细胞的尺寸来选择装置。本发明还涉及以机械平衡的多细胞排列将至少两个细胞固定在平表面上的方法， 所述方法包含-提供本发明的装置；和，-使板暴露于至少一个细胞足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡的多细胞排列。或者，本发明涉及以机械平衡的多细胞排列将至少两个细胞固定在平面上的方法，所述方法包含-提供本发明的装置；和，-使板暴露于至少两个细胞足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡的多细胞排列。另外，本发明涉及研究在多细胞排列中的细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能的方法，所述方法包含-提供本发明的装置；-使板暴露于至少一个细胞足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡的多细胞排列；或使板对至少两个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡的多细胞排列；-使细胞以多细胞排列生长在粘附性图案组上；和，-观察并测量多细胞排列中的细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、 细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能。本发明还涉及选择生物活性化合物的方法，所述方法包含-提供根据本发明的装置；-使板暴露于至少一个细胞足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡的多细胞排列；或使板对至少两个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡的多细胞排列；-使测试化合物与以多细胞排列的所述细胞接触；-使细胞以多细胞排列生长在粘附性图案上；-观察多细胞排列中所述细胞的形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、整体的内部细胞组构、细胞分化、细胞极性、细胞分裂和/或任何功能。或者，本发明还涉及选择生物活性化合物的方法，所述方法包含-提供根据本发明的装置；-使测试化合物与细胞接触；-使板暴露于至少一个所述细胞足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡的多细胞排列；或使板暴露于至少两个所述细胞足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡的多细胞排列；-使细胞以多细胞排列生长在粘附性图案上；和，-观察多细胞排列中所述细胞的形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、整体的内部细胞组构、细胞分化、细胞极性、细胞分裂和/或任何功能。
图1 具有居间区域(IA)的两个粘附性图案(AP)的组的示意图。灰色表示粘附区域。(d)定义了两个粘附性图案之间的距离(Al)。居间区域(IA)包含粘附区(灰色的)， 且(w)定义了这个粘附区的宽度。必须注意到，这个示意图不是限制性的，它的目的是为了明确定义术语。例如，居间区域(Al)的粘附区可以居中，或在图案的左或右端，并可连接或不连接一个或两个粘附性图案。图2 分裂后的MCFlOA上皮子细胞在正方形粘附性图案上的定时相差显微术 (time-lapse phase contrast microscopy)。细胞一直围绕着彼此移动数小时,直至下一次分裂。图3 分裂后的MCFlOA上皮子细胞在H形粘附性图案上的定时相差显微术。细胞不围绕着彼此移动。它们采用机械平衡，并不移动，直至下一次分裂。图4 在H形纤连蛋白-粘附性图案上处于机械平衡的两个MCFlOA上皮子细胞。细胞-细胞接触一直都位于将H形的中心柱二等分的平面上。细胞核一直都接近于细胞-细胞的相互作用平面。图5 细胞在支撑物上五种不同的示意性行为。(1)细胞在一个方向上围绕着彼此移动，更精确地说在一个方向或另一个方向(顺时针或逆时针)上持久地围绕着彼此移动； (2)细胞在两个方向上围绕着彼此移动(换句话说，细胞没有任何停顿地移动，但可以改变它们的方向)；(3)细胞围绕着彼此移动，停下来并再次开始围绕着彼此移动；(4)细胞在同一个位置周围摆动，并几乎处于平衡；( 细胞在特有的位置周围是稳定的。允许达到平衡的图案是其中大多数的细胞被发现处于(4)和(5)的行为的那些。不允许达到平衡的图案是其中大多数的细胞被发现处于(1)和O)的行为的那些，优选大多数被发现处于(1)、 O)、以及⑶的行为的那些。通过相差显微术监测两个MCFlOA上皮子细胞对于不同形状的粘附性图案的行为。图6 用于多个细胞排列的粘附性图案的例子。图7 通过相差显微术监测MDCK和MCFlOA上皮子细胞中的任何一种对于两种不同形状的粘附性图案的行为。细胞在支撑物上五种图示行为的含义公开在图5的图例中。 MCFlOA和MDCK细胞在两种图案上的行为遵照相同的趋势在H上稳定，在“框架”上失稳定。图8 图像图示说明了，如在WO 2005/026313中公开的两个子Hela细胞在L粘附性图案上的行为。使培养的Hela细胞同步化，以便处于G2期。然后将细胞胰蛋白酶化，辅板在微图案上，并用视频以10分钟的时帧(time-frame)记录30小时。在每个图案上，细胞迅速地进入有丝分裂。分裂后，看到两个子细胞围绕着彼此移动，没有达到稳定的多细胞平衡。所示的22个图像是从整个时间序列中选择和提取出来的，以便简明地对细胞分裂和分裂后的细胞运动进行图示说明。为了说明这些运动的可复制性，以及在细胞对中不存在稳定状态，显示了两个例子。
具体实施例方式定义“凸封(convex envelop) ”是指含有粘附性图案的最小的凸面多边形。“由凸封限定的区域”是指包含在凸封中的区所覆盖的区域。“S”是指真核细胞在没有任何约束的支撑物上所覆盖的表面(例如皮氏培养皿(Petri dish)或盖玻片上的细胞)。“D”是指具有所述表面S的圆盘的直径。“两个粘附性图案之间的距离”是指两个粘附性图案的两个靠近的点之间的距离。“约”是指大于或小于5%的值。“机械平衡”或“机械上稳定的”是指细胞在同一个位置周围摆动，且几乎处于平衡 (如在图5和实施例中定义的行为4)，以及细胞在特有的位置周围是稳定的(如在图5和实施例中定义的行为5)。具体地说，在一个细胞分裂期如(例如约对-48小时)期间，可以每5分钟记录一次细胞的行为。或者，“机械平衡”或“机械上稳定的”还可被定义为比率为80%的细胞，它们连接两个所考虑细胞的核的轴线相对于微图案上的固定的参比轴线来说，变化小于45°，优选小于40°、35°、30°、或20°。这些测量优选在用于被考虑的细胞的培养温度、例如在37°C下进行。“可复制的构象”是指细胞在对于所考虑的图案组，在多细胞排列上采用相同的构象这一事实。对于以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列来粘附至少两个细胞的装置来说，本发明人提供了允许该装置的设计的原则。以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列来粘附几个细胞的装置的设计是个新的概念。所述原则如下，并已从实验数据、特别是图5中显示的那些中推断出一个粘附性图案用于多细胞排列的每个细胞。所述至少两个粘附性图案之间的区被称为居间区域。通过基本上无粘附性的居间区域将粘附性图案彼此充分地分隔开，以防止第一个粘附性图案上的细胞触及另一个粘附性图案。当然，粘附性图案还一定要充分地接近，以允许细胞之间的相互作用。已经确定了，居间区域为细胞表面的约一个直径(D)。粘附性图案优选小于细胞的表面积(S)。这些小的粘附性图案是重要的，因为它们为细胞提供了充分的自由度(通过无粘附性区域)，以使它们靠着彼此楔入一个粘附性图案。那两种约束(粘附性图案以及另一个相互作用性细胞)之间的平衡稳定了相互作用性细胞，并允许它们采用天然的状态，因此是稳定的和可复制的。为了向细胞提供充分的自由度，居间区域基本是无粘附性的。然而，居间区域可以包含粘附性区域，更优选是单个的粘附性区域，从而有助于使细胞彼此相遇，并建立相互作用接触。居间区的这个粘附区域的宽度必须是窄的(小于细胞直径的1/2)。事实上，如果这个区域太大的话，它可使细胞触及另一个粘附性图案。两个粘附性图案以及居间区的面积要足以粘附两个动物细胞。当然，为了避免周围细胞(未参与多细胞排列)对多细胞排列的干扰，每个图案组都要被斥细胞区围绕。本发明的装置包含限定了表面表面的板和至少两个粘附性图案的组，所述至少两个粘附性图案通过基本上无粘附性的居间区域彼此充分地分隔开，以防止第一个粘附性图案上的细胞触及另一个粘附性图案，而且所述至少两个粘附性图案与居间区的面积要足以粘附两个动物细胞。换句话说，由所述至少两个粘附性图案与居间区覆盖的面积要足以粘附两个动物细胞，而且每个细胞都附着在一个单个粘附性图案上。具体地说，所述板限定了平表面。具体地说，由所述至少两个粘附性图案和居间区覆盖的面积对于由单个细胞覆盖的面积来说是太大了。因此，这个面积远远大于1S，而且对于χ个细胞的多细胞排列来说， 这个面积为约xS。例如，对于2个细胞的多细胞排列来说，这个面积将是约2S。由每个粘附性图案的凸封限定的面积在约1/2S和约3/2S之间，S是没有任何约束的细胞覆盖的面积。在优选的实施方案中，由每个粘附性图案的凸封限定的面积在约3/4S 和约5/4S之间，更优选约S。例如，S可以在1和2，500 μ m2之间，更优选在1和1，000 μ m2 之间，还更优选在1和500 μ m2之间或500至900 μ m2。S可以取决于细胞的类型。然而，由每个粘附性图案的凸封限定的面积包含了高百分比的无粘附性区域，例如至少20、30、40、 或50 %，优选在20-70 %、30-60 %、或40-50 %之间的无粘附性区域。或者，由每个细胞的粘附性图案覆盖的面积小于细胞表面S的80、70、60、或50%。例如，每个粘附性图案的面积在细胞表面S的30-80%、40-70%、或50-60%之间。还可将这个面积定义为一旦达到了机械平衡，则为由一个细胞覆盖的表面。每个粘附性图案的凸封可以具有任何种类的形状(例如圆盘、正方形、长方形、梯形、圆盘碎片(disk fragment)、椭圆形等)。在这个凸封上，可以确定长轴和短轴。粘附性图案可以由单个连通的粘附表面和/或由几个不连通的粘附表面构成。“单个连通的粘附表面”优选是指实线或曲线。“不连通的粘附表面”优选是指点线或虚线或曲线，或离散的点或区域。在优选的实施方案中，粘附性图案由选自直线、曲线、以及点的粘附元素的组合构成。粘附性点、直线、曲线、或边的宽度优选在0. 1至100 μ m之间，更优选在 1至50 μ m之间，还更优选约8 μ m。在优选的实施方案中，两个粘附性图案之间的距离在约2/3D和约4/3D之间。在优选的实施方案中，两个粘附性图案由约3/4D至约5/4D之间的、更优选约D的距离分隔开。在优选的实施方案中，基本上无粘附性的居间区域包含单个的粘附区。所述单个的粘附区适于不使细胞触及另一个粘附性图案。这就是说，这个单个的粘附区一定要窄。事实上，与粘附性图案的长轴平行的长和细的粘附线不合适，因为它可使细胞触及另一个粘附性图案。例如，粘附区是位于两个粘附性图案之间的区，且具有小于D、优选小于1/2D、优选小于1/3D、更优选小于1/4D的宽度。在一个实施方案中，粘附区可以连接两个粘附性图案，例如作为直线或曲线。在另一个实施方案中，粘附区可以在两个粘附性图案之间，且与它们没有任何连接。虽然不希望受到理论的制约，但是据认为这个粘附区有助于使两个细胞建立细胞-细胞相互作用。在优选的实施方案中，基本上无粘附性的居间区域的50%、更优选60、75、80、85、或90%是无粘附性的。所述单个的粘附区可以由形成粘附区的单个连通的粘附表面和/或几个不连通的粘附表面构成。在最优选的实施方案中，本发明的装置是这样的两个粘附性图案之间的距离在约2/3D和约4/3D之间、优选在约3/4D和约5/4D之间、更优选约D ；基本上无粘附性的居间区域包含单个的粘附区，所述单个的粘附区位于两个粘附性图案之间，并具有小于D、优选小于1/2D、优选小于1/3D、更优选小于1/4D的宽度；以及，由每个细胞的粘附性图案覆盖的面积小于细胞表面S的80、70、60、或50%。在特定的实施方案中，两个粘附性图案的组可以采用下列形状C、X、H、Z、以及门。 事实上，目前的实验(图5)证实了这些形状很适合于达到机械平衡。本发明还仔细考虑了具有超过两个粘附性图案的装置。为两个细胞的排列所确立的原则同样适用于具有超过两个细胞的多细胞排列。在这种情况下，图案组的轮廓由粘附和无粘附性区域交替构成，这样可将细胞定位在粘附区域上，并在无粘附性区域上建立与邻近细胞的接触。通过基本上无粘附性的区域将每个粘附性图案与其它的粘附性图案分隔开。两个粘附性图案之间的距离在约2/3D和约4/3D之间。在优选的实施方案中，两个粘附性图案由约3/4D至约5/4D之间的、更优选约D的距离分隔开。然而，基本上无粘附性的居间区域包含单个的粘附区。例如，粘附区是位于两个粘附性图案之间的区，且具有小于D、 优选小于1/2D、优选小于1/3D、更优选小于1/4D的宽度。在一个实施方案中，粘附区可以连接两个粘附性图案，例如作为直线或曲线。具体地说，所述装置可以具有采用如下相同原则的4、8、16、或32个粘附性图案的组在每个粘附性图案与每对粘附性图案之间任选的单个窄粘附区之间有距离。图6示意性说明了 4、8、16、或32个粘附性图案的组。这样的粘附性图案组被设计用于超过两个细胞的多细胞排列，其覆盖的面积大于2500 μ m2，优选在沈00 和 50000 μ τα 之间，例如 2600、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、 20000、30000、40000、或 50000 μ m2。优选地，所述装置包含多个至少两个粘附性图案的组，所述粘附性图案组通过细胞不会附着的斥细胞区彼此隔离开。更具体地说，所述装置包含至少2组的至少两个粘附性图案，优选至少5、10、100、1000、10000、或100000组的至少两个粘附性图案。在优选的实施方案中，所述装置包含5至25000个组的至少两个粘附性图案/cm2，更优选5000至10000 组的至少两个粘附性图案/cm2，还更优选约7500组的至少两个粘附性图案/cm2。粘附性图案或区包含促进细胞粘附的分子。这些分子可以是非特异性的，如氧化的聚苯乙烯，例如在经组织培养处理的聚苯乙烯培养皿中。所述分子还可以是特异性的粘附分子，例如本技术领域中的普通专业人员所公知的那些，且包括抗原、抗体、细胞粘附分子、细胞外基质分子如层粘连蛋白、纤连蛋白、合成肽、碳水化合物等。优选地，所述粘附性图案包含细胞外基质分子，更优选为纤连蛋白。无粘附性的表面是惰性表面。合适的惰性表面是由聚(乙二醇)的衍生物覆盖的表面。板是方便用于共焦、光学、和/或荧光显微镜的支撑物。在更优选的实施方案中， 板是可能覆盖了一薄层氧化聚苯乙烯的玻璃。例如，根据本发明的便捷的板是盖玻片或载玻片。它还可以是经组织培养处理的皮氏培养皿。应理解在本发明中，板是指没有任何孔的平表面。根据本发明的装置可以在同一个板上包含彼此分隔开的几群粘附性图案组，这样每群都可以在不同的培养基中温育。例如，可将一群粘附性图案组与测试化合物接触，并可将另一群与另一种测试化合物接触或没有任何测试化合物。可以通过物理屏障如特氟龙密封提供这种分隔。例如，参见SPI Supplies的SPI Teflon 、Aname的印刷有iTeflor^W 载玻片。通过微图案形成来形成具有粘附性图案和区、以及斥细胞区的根据本发明的装置。可以使用微接触印刷或UV图案形成。标准的方法是本技术领域中的专业人员所公知的。为了回顾起见，参见 Whitesides 等(Annu. Rev. Biomed. Eng.，2001，p. 3；35_373，更具体地p. 341-345)。具体地说，可以通过包含如下步骤的方法来制备所述装置-制备具有至少一个粘附性图案的主模板；-从所述主模板制备印方(stamp)；-使用促进细胞粘附的分子来对所述印方进行印染(inking)；-将印染好的印方与板接触；-将板的未印刷表面制成斥细胞性的。优选地，主模板是在包被了光致抗蚀剂层的硅晶片上，用UV照射穿过在上面设计了粘附性图案的掩模来制备的。印方优选为聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)或其它的硅氧烷基聚合物。优选地，通过用惰性材料如聚乙二醇的衍生物进行温育，将板的所述未印刷表面制成斥细胞性的。制备根据本发明的板的具体实施例在实施例部分进行详细描述。微图案化可以在微米规模下精确地控制细胞位置。使用不含任何金或其它金属涂层的玻璃盖玻片适合于每一种光学成像技术，且尤其适合用于视频显微术的倒置显微镜上的落射荧光。许多4D获取(定时中的3D)的自动操作是非常容易的使用机动化的XY台， 人们只需记录第一个细胞的XY位置即可，因为所有其它的都可以通过已知的迭代平移从第一个中推导出来；在陶瓷压电装置上的IOOx物镜使3D叠获取(3D stack acquisition) 非常迅速。玻璃盖玻片和微图案化使人们可以使用落射荧光和透射光在高放大倍数下进行高通过量的3D细胞筛选。当细胞在接种前被同步化时，通过对所需的许多细胞的观察结果进行总结，人们可以获得对“平均细胞”的描述。它提供了对细胞组构或行为非常准确的描述，因为细胞即使不是完全相同的，也是十分相似的。从这样的“平均细胞”描述，人们可以设置适当的阈值用于筛选针对特定细胞功能的活性药物或者在失活状态下会损害该功能的基因。根据本发明的装置可用于在基础和应用两种研究领域中的各种各样的细胞生物学应用，包括细胞培养、组织工程、细胞计数、毒理学、药物筛选、细胞的固定、细胞治疗、以及活组织检查的细胞诊断法。具体地说，本发明的装置可用作控制或约束具有可复制的排列或构型的细胞群的装置。它们还可以在类似组织的细胞培养装置中用于组织或控制细胞的位置。事实上，所述装置可以控制单个细胞在培养的细胞群或多细胞排列内的位置。 它们可以在培养的多细胞岛内获得可复制的细胞定位和组构，特别是完全控制在多细胞排列/细胞群内细胞-细胞外基质和细胞-细胞粘附的空间定位。本发明的装置在应用研究领域中引起关注，因为它们允许以可复制的方式使培养中的细胞群内的细胞定位规范化 (normalization) 0更具体地说，使用这样的装置可以在多细胞构象内获得受控的和定向的细胞极性。因此，可以使用本发明的装置获得具有细胞-细胞连接的控制定位的(large array of)可复制多细胞群的大型阵列。在不同的3D多细胞排列中，所述装置适合于在看上去像“平面的胚状体”的平面多细胞内进行规则和可复制的细胞定位。本发明涉及以机械上稳定和可复制的构象的多细胞排列来粘附至少两个相互作用性细胞的方法，其包含-选择要被粘附的细胞；-选择本发明的合适的装置；和，-在挑选的装置上培养细胞。所述方法可以包含测定细胞在没有任何约束的支撑物上所覆盖的表面，以确定细胞的尺寸，并根据细胞的尺寸来选择装置。对于X个细胞的多细胞排列，要选择合适的装置，以便使X个粘附性图案与居间区的面积足以粘附X个细胞。因此，本发明涉及在表面上或在表面上的培养基中培养至少两个细胞的方法，所述方法包含-提供根据本发明的限定了表面的板和至少两个粘附性图案，优选为根据本发明的装置；和，-在所述粘附性图案组上或在所述粘附性图案上的培养基中培养细胞。所述培养基可以是便于细胞培养的任何培养基。例如，所述培养基可以是含有 10%的小牛血清、50 μ g/mL青霉素和链霉素、以及2mM谷氨酰胺的Dulbecco Modified Eagle培养基。本发明还涉及将至少两个处于机械平衡中的相互作用细胞固定在表面上的方法， 所述方法包含-提供根据本发明的限定了表面的板和至少两个粘附性图案，优选为根据本发明的装置；和，-使所述板对至少一个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡；
或者，本发明还涉及将至少两个处于机械平衡中的相互作用细胞固定在表面上的方法，所述方法包含-提供根据本发明的限定了表面的板和至少两个粘附性图案，优选为根据本发明的装置；和，-使所述板对至少两个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡。本发明还涉及研究细胞的形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或任何功能的方法，所述方法包含-提供根据本发明的限定了表面的板和至少两个粘附性图案，优选为根据本发明的装置；-使所述板对至少一个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡；或使板对至少两个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡；-使细胞在粘附性图案上生长；和，-观察细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能。在特定的实施方案中，通过、但不限于观察中心体和初级纤毛的位置、细胞核的位置、高尔基体的结构(即CGN和TGN)、细胞粘附的定位(例如钙粘蛋白和整合素)、肌动蛋白网络(例如肌动蛋白丝的空间分布)、和/或微管蛋白、和/或中间丝、分子的内部运输途径，来评价整体的细胞组构和细胞极性。在另一个实施方案中，通过随后的细胞核移动和细胞-细胞接触面的移位来对细胞迁移进行量化。在另一个实施方案中，通过使用免疫组化来分析蛋白质组成(例如钙粘蛋白或 β-联蛋白)和细胞-细胞接触的位置来量化细胞-细胞相互作用。在另一个实施方案中，通过测量细胞骨架元素如肌动蛋白纤维、微管、以及中间丝的尺寸和位置来描述细胞结构。在另一个实施方案中，通过检测下列物质的存在来评估细胞分化特异性决定簇如细胞核中的转录因子、或细胞质中或细胞表面上可以影响细胞分化的信使RNA或微小 RNA或特异性受体。在另一个实施方案中，通过对如下进行量化来分析细胞分裂有丝分裂纺锤体极的数量、在纺锤体形成期间纺锤体极的运动、有丝分裂纺锤体的尺寸、相对于细胞-细胞和细胞-细胞外基质粘附来说纺锤体极的定向、细胞膜中影响纺锤体极定位的特异性蛋白质的局部化、子细胞相对于微图案的最终位置或子细胞各自的尺寸和可能不等的蛋白质含量。在另一个实施方案中，方法包含使用含有特异性软件的图像分析仪，利用为该分析设计的运算法则来对所述细胞进行自动化分析。更具体地说，所述特异性软件允许进行上述的自动化方法。
可以在本发明中使用任何种类的动物细胞。细胞可以来自动物、哺乳动物、或人类。细胞可以是例如成纤维细胞、内皮和上皮细胞。在优选的实施方案中，细胞是上皮细胞。 细胞可以来源于健康的或病理的组织或生物体。细胞可以是野生型或修饰的细胞。在特定的实例中，细胞可以是肿瘤细胞。例如，基因可以被灭活，而且这些方法可以对参与细胞形状、细胞骨架结构、细胞迁移、细胞粘附、分子的细胞内部运输、整体的内部组构、区室化、纺锤体的形成或定向、分化等的基因进行鉴定。本发明涉及使用根据本发明的装置来筛选改变细胞形状、细胞运动和迁移、细胞结构、细胞的整体内部组构、细胞极性、有丝分裂或细胞分裂、细胞分化、细胞-细胞相互作用、或细胞的任何功能的目标化合物。本发明还涉及使用根据本发明的装置来鉴别参与细胞形状、细胞骨架结构、细胞迁移、细胞粘附、细胞的整体内部组构、有丝分裂、细胞分化、细胞-细胞相互作用、或细胞的任何功能的目标基因。本发明还涉及使用根据本发明的装置来筛选目标化合物的方法。事实上，这个装置允许高通量筛选，因为细胞具有定态的和可复制的构象、机械平衡与任选的受控的细胞整体内部组构。这个装置可以观察测试化合物在细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能上的作用。更具体地说，本发明涉及选择生物活性化合物的方法，所述方法包含-提供根据本发明的装置；-使板对至少一个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡；或使板对至少两个细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平-使测试化合物与所述细胞接触；-使细胞在粘附性图案上生长；和，-观察细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能。在筛选方法的供选实施方案中，可使细胞在粘附性图案上生长，然后再将其与测试化合物接触。因此，有可能评价化合物对现有的形状、现有的细胞-细胞接触、以及细胞组构的作用。在另一个可选实施方案中，细胞在粘附到板上之前与测试化合物进行接触。因此， 所述方法包含-提供根据本发明的装置；-使测试化合物与细胞接触；-使板对至少一个所述细胞暴露足够长的一段时间，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上和达到机械平衡；或使板暴露于至少两个所述细胞足够长的一段时间，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并达到机械平衡；-使细胞在粘附性图案上生长；和，-观察所述细胞的形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、整体的内部细胞组构、细胞分化、细胞极性、细胞分裂、和/或任何功能。
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优选地，所述方法包含另外的步骤与没有被所述测试化合物接触的细胞比较细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能。任选地，可以将所述对照细胞与具有已知作用的参比化合物进行接触。测试化合物可以具有各种不同的来源、性质、以及组成。它可以是任何有机或无机的物质，例如分离的或与其它物质混合的脂类、肽、多肽、核酸、小分子等。例如，测试化合物可以是抗体、反义寡核苷酸、或RNAi。例如，所述化合物可以是产品组合文库的全部或一部分。当然，在上述方法中，细胞处于多细胞排列，尤其是机械平衡。事实上，根据本发明的装置的目标是为了能够在相互作用细胞的背景下研究或筛选细胞，而且为了适于高通量数据获取和高采样，需要机械平衡和可复制性。本发明的其它方面和优点将公开在下面的实验部分中，实验部分应看作是示例性的，并没有限制本申请的范围。实施例可以采用几种图案形成方法来制作本发明中描述的微图案。微接触印刷或UV图案形成，这两种主要的方法是适合的。微接触印刷法依靠使用印方来使粘附分子沉积，并使用斥细胞组分进行回填。UV图案形成法依靠使用斥细胞组分来包被基板，并使用激光或光学掩模，用UV光在特定图案中进一步氧化所述斥细胞组分。在此，对微接触印刷法进行详细的描述。微接触印制法使用的方法基于使用具有微观特征的弹性体印方来将蛋白质印在挑选的基板上。 整个工艺可以细分为三个主要部分。第一个部分描述了将要被用于制造印方的硅主模板的制作。第二部分描述了聚二甲硅氧烷(PDMS)印方的制作和使用。使用细胞外基质蛋白对印方进行印染，并使其变干。然后再将蛋白质印在组织培养聚苯乙烯培养皿或覆盖了一薄层聚苯乙烯(PQ的玻璃载玻片上。使用聚-L-赖氨酸-聚-乙二醇(PLL-PEG)对未印刷的区域进行回填。I主模板制作材料试剂丙酮显影剂LDD26W(Shipley，Coventry, UK)三甲基氯硅烷(Sigma-Aldrich,Saint Quentin Fallavier，法国)光学掩模(Deltamask，荷兰)光致抗蚀剂SPR22O-7. 0 (Shipley)硅晶片100mm(MEMC Spa，意大利，ref GPHVXB6F)方法包被光致抗蚀剂层1.通过在丙酮中进行10分钟的超声处理来清洁硅晶片，并使用过滤的气流或氮气流对其进行干燥。
2.将硅晶片放置在旋涂器上。使用光致抗蚀剂覆盖2/3的表面。然后在2000转 /分钟下旋涂光致抗蚀剂1分钟。3.在115°C下，将晶片和光致抗蚀剂层在热板上烘烤3分钟。将晶片在试验台上放置15分钟，以使其回复至室温。这三个步骤导致在硅晶片上形成了 9微米厚的光致抗蚀剂层。光致抗蚀剂光刻法4.将光致抗蚀剂层和光学掩模在掩模对准器上进行接触，并用UV灯(UV光源 405nm, UV 功率 6mW/cm2)照射 45 秒钟。5.将光致抗蚀剂在纯的显影剂中显影2分钟，并转移至蒸馏水浴中冲洗，并停止显示。被照射的区域溶解在显影剂中(因为挑选的光致抗蚀剂是正性的，负性的抗蚀剂将给出相反的结果)。这产生了微观特征。然后用过滤的气流对所得的光致抗蚀剂主模板进行干燥。包被光致抗蚀剂主模板的表面6.为了在印方的制作期间防止PDMS的强粘附，要对抗蚀剂主模板进行硅烷化。将抗蚀剂主模板放入与含有几滴三甲基氯硅烷的小烧杯靠近的真空干燥器中。制造真空30 分钟以帮助形成三甲基氯硅烷蒸汽。然后关上干燥器，并将抗蚀剂主模板在蒸汽的存在下放置过夜。7.将抗蚀剂主模板放置在烤箱中，100°C下30分钟，以完成主模板表面上的硅烷组构。II微图案化基板的制作现有用于微图案形成的两种基板玻璃载玻片，其确保了最佳的光学性质，和经组织培养处理的聚苯乙烯(TCPQ培养皿。因为蛋白质在氧化的PS上的粘附要比在玻璃上好得多，所以必须要将玻璃载玻片包被一薄层PS。材料试剂聚-二甲基硅氧烷(PDMS)(Sylgard 184 试剂盒，lkg, Dow Corning)纤连蛋白(Fl141，Sigma)AP6000聚苯乙烯(Acros)甲苯玻璃载玻片TCPS自制的抗蚀剂主模板(参见前面的部分)，或定制的商业主模板(Biotray，Lyon, 法国)。水Falcon f=PLL-g-PEG(SurfaceSolutions，瑞士 )封口膜方法
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印方制作1.将PDMS和固化剂(二者都包含在Sylard试剂盒184中)以10/1的比率在塑料烧杯中进行混合。这导致了气泡的形成。2.将PDMS混合物在真空下脱气以除去气泡。持续的时间视真空而定。3.将2mm厚的脱气PDMS混合物流延在抗蚀剂主模板上，并在60°C的烤箱中固化 2小时。4.轻轻剥下PDMS层。5.含有挑选的微图案几何形状的目标区域能够看得见，可将其放置在具有透射光的单式显微镜上。用解剖刀手工切下约Icm2的印方。必须将印方存放在紧密的包装中以远离灰尘。它们在使用前可保存数月。基板制备本文中所述的基板是一定要用聚苯乙烯(PQ覆盖的载玻片。所提供的TCPS培养皿可以原样使用。6.用乙醇洗涤玻璃载玻片。任选可将它在乙醇中进行超声处理以最佳除尘。使用经过过滤的气流将其干燥，或在通风橱(hood)下使其变干。7.将玻璃载玻片放置在旋涂器上。将几滴粘附增进剂AP6000放置在玻璃上，并在 IOOrmp下旋涂IOs (以覆盖载玻片)，然后在IOOOrpm下20s (以形成薄层)。在旋涂后，使 AP6000层变干。8.将几滴甲苯中的PS溶液)放置在用AP6000覆盖的玻璃上，并在IOOrmp 下旋涂IOs (以覆盖载玻片)，然后在IOOOrpm下20s (以形成薄层)。在旋涂后，使AP6000
层变干。微接触印刷9.将一滴20 μ L的50 μ g/mL在PBS中的纤连蛋白放置在Icm2印方的微结构表面上。PDMS是疏水的，所以必须要用自动移液器的尖端将液滴移向印方的每个角以迫使液滴展开。可以轻触印方表面。印染持续30分钟以使纤连蛋白吸附在PDMS上(这一持续时间有可能被缩短)。10.本步骤可以在步骤9的蛋白质吸附期间进行。使用具有PS层的玻璃载玻片作为基板将载玻片放置在等离子清洗机中。打开泵以在舱内制造真空。打开弱氧气流。在 30W下使用振荡电场10s。使用TCPS培养皿作为基板培养皿不需要完全地等离子氧化，并可以用原样提供的进行印刷，但是按照所述用于玻璃载玻片的相同的等离子处理会大大提高印刷和钝化的效率。11.在步骤9后，对纤连蛋白滴进行吸取，并在变干前在表面上添加一大滴PBSt^f 该步骤重复两次以除去未吸附的纤连蛋白。12.吸取PBS滴，并在通风橱的气流下将印方干燥几秒至一分钟。当表面在其上的反射光下看上去是干燥的时候，印方就可用于印刷了。13. 一旦变干，就用镊子夹住印方并将其倒置以使微结构的表面与基板(TCPS培养皿或具有PS层的玻璃)接触。用镊子在它上面施加短而轻的压力，以确保印方与基板之间有良好的接触。将印方与基板接触1分钟。14.除去印方，并将其浸在!^lcon管内的水中。
15.将印好的基板在PH为7. 4的0. lmg/mL PLL-PEG在IOmM Hepes中的溶液中浸泡30分钟。为了使PLL-PEG的量最小化，可在基板上放置100 μ L的液滴，并用一片封口膜覆盖。16.在PLL-Peg的移植期间，清洁印方。将含有印方的管子在60°C下加热，并在超声浴中超声处理15分钟。然后将印方在纯酒精中超声处理15分钟。17.将干净的印方在通风橱下干燥1小时，并存放回它的包装中。18.使用PBS将移植了 PLL-PEG的基板用2和10分钟洗涤两遍。这样基板便可用于细胞沉积了。它可在4°C下干燥存放(且如果可能，在氩气下) 至少一周。III细胞沉积材料试剂PBS胰蛋白酶-EDTADMEM 或 DMEM-F12SVF青霉素链霉素方法1.将粘附细胞在PBS中洗涤，并用胰蛋白酶-EDTA将它们从烧瓶上脱落。2.向烧瓶中加入完全培养基(DMEM或DMEM-F12+10% SVF+1%青霉素和链霉素)， 并将收集的细胞在1500rpm下离心3分钟。3.除去上清液，并使细胞以50000细胞/mL重新悬浮在培养基中。4.在微图案化的基板(玻璃载玻片或TCPS培养皿)上添加细胞溶液。最终的密度应是约10000细胞/cm2。将整体放置在培养箱中。5.在根据细胞性而异的给定时间后(对于Hela-B和MDCK来说是一小时)，在显微镜下检查到有足够大比例的细胞已经粘附在微图案上。6.将培养基流添加至培养皿的一侧，并在另一侧进行抽吸，以除去未粘附的细胞。7.将粘附的细胞放回培养箱中以使它们完全辅展开。8. 一小时后，可对细胞进行固定或视频记录。结果将乳腺上皮细胞MCFlOA细胞从培养它们的烧瓶上脱落下来，并铺在微图案的阵列上。已对微图案的各种几何形状进行了测试。将其上粘附了细胞的微图案化的基板放置在倒置电动显微镜上，所述倒置电动显微镜被关闭在培养箱中以将细胞保持在37°C。挑选单个的细胞并记录它们的位置。通过每5分钟拍摄相差影像，对细胞的行为进行视频记录。 在细胞分裂后，观察子细胞的行为。目的是为了鉴别细胞在哪种几何形状上采用稳定的和可复制的组构，并测量细胞接触面相对于下面的微图案的定向。细胞的行为在限定的图案上非常有复制性。在正方形的微图案上子细胞永远围绕着彼此移动(图幻。在H形的微图案上，子细胞不迁移，并采取稳定的构型(图幻。在这一情况下，在无粘附性区域上方的相同位置处，可复制地建立了细胞-细胞接触。在_20°C下将H形微图案上的细胞对固定在甲醇中，并用针对上皮性钙粘蛋白(e-cadherin)的抗体进行标记以显示细胞-细胞粘附，并用针对肌动蛋白丝和DNA的两种荧光染料进行标记(图 4)。本发明人定义了任意的类别来区分5种行为，以进一步量化微图案上细胞排列的稳定性。(1)细胞在一个方向上围绕着彼此移动；( 细胞在两个方向上围绕着彼此移动； (3)细胞围绕着彼此移动，停下来并再次开始围绕着彼此移动；(4)细胞围绕同一个位置摆动，并几乎处于平衡；( 细胞围绕特有的位置是稳定的。允许达到平衡的图案是其中大多数的细胞被发现处于(4)和(5)的行为的那些。不允许达到平衡的图案是其中大多数的细胞被发现处于(1)和O)的行为的那些。对数百个影片进行了视觉分析，并根据所述5类进行分类。一些几何形状如圆形、圆盘形、正方形、以及三角形似乎能促进细胞迁移与成对物(doublets)的不稳定性。在其它的形状如U、C、V、X、或H上，(4)和(5)的行为占优势， 这些形状似乎能稳定细胞对(cell doublets)，并促进机械平衡(图5)。图 6 显示了 MDCK 细胞(马-达二氏犬肾细胞(Madin-Darby Canine Kidney Cells)，其是肾脏上皮细胞)的行为。图7图示说明了，如在WO 2005/026313中定义的，Hela细胞在L形粘附性图案上的行为。可以观察到两个细胞围绕着彼此转动。事实上，这个文献限定了设计用于允许单细胞粘附的粘附性图案。即使细胞能够在这个图案上进行分裂，它也不适合于达到机械平衡的多细胞排列，因为它太小了。
权利要求
1.装置的应用，所述装置以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列来粘附至少两个相互作用细胞，所述装置包含-限定平表面的板；和，-至少两个粘附性图案的组，其中所述至少两个粘附性图案通过基本上无粘附性的居间区域彼此充分地分隔开，以防止第一个粘附性图案上的细胞触及另一个粘附性图案；而且，由所述至少两个粘附性图案和所述居间区域覆盖的区域足以粘附至少两个动物细胞， 而且其中所述至少两个粘附性图案的组通过斥细胞的周围区域被隔离开。
2.装置，所述装置以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列来粘附至少两个相互作用细胞，所述装置包含-限定平表面的板；和，-至少两个粘附性图案的组，其中所述至少两个粘附性图案通过基本上无粘附性的居间区域彼此充分地分隔开，以防止第一个粘附性图案上的细胞触及另一个粘附性图案；而且，由所述至少两个粘附性图案和所述居间区域覆盖的区域足以粘附至少两个动物细胞， 而且其中所述至少两个粘附性图案的组通过斥细胞的周围区域被隔离开。
3.根据权利要求1的应用或根据权利要求2的装置，其中两个粘附性图案之间的距离在约2/3D至约4/3D之间，D是具有表面S的圆盘的直径，优选在约3/4D至约5/4D之间， 更优选为约D。
4.根据权利要求1-3任一项的应用或装置，其中由用于每个细胞的粘附性图案覆盖的面积小于细胞表面S的80、70、60、或50%。
5.根据权利要求1-4任一项的应用或装置，其中基本上无粘附性的居间区域包含适合于不使细胞触及另一个粘附性图案的单个粘附区。
6.根据权利要求5的应用或装置，其中单个粘附区是位于两个粘附性图案之间的区， 且具有小于1/2D、优选小于1/3D、更优选小于1/4D的宽度。
7.根据权利要求6的应用或装置，其中所述单个粘附区将两个粘附性图案连接。
8.根据权利要求1-7任一项的应用或装置，其中所述两个粘附性图案的组具有下列形状中的一种c、x、H、z、W&n。
9.根据权利要求1-8任一项的应用或装置，其中粘附性图案由单个连接的粘附表面和 /或几个不连接的粘附表面形成。
10.根据权利要求1-9任一项的应用或装置，其中所述装置包含至少2组的至少两个粘附性图案。
11.根据权利要求1-9任一项的应用或装置，其中所述装置包含至少2组的至少4、8、 16、或32个粘附性图案。
12.根据权利要求11的应用或装置，其中每组粘附性图案被设计成用于超过两个细胞的多细胞排列，并覆盖大于2500 μ m2，优选在2600至50000 μ m2之间，例如2600,3000, 3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、或50000口1112 的区域。
13.根据权利要求2-12任一项的装置在筛选目标化合物、鉴别目标基因、或诊断细胞机能障碍中的应用。
14.方法，所述方法以机械上稳定的和可复制的构象的多细胞排列来粘附至少两个相互作用细胞，所述方法包含 -选择要被粘附的细胞；-选择根据权利要求2-12任一项的合适的装置；和， -在选择的装置上培养细胞。
15.根据权利要求14的方法，其中所述方法包含测定在没有任何约束的支撑物上细胞所覆盖的表面，以确定细胞的尺寸，并根据细胞的尺寸来选择装置。
16.方法，所述方法以机械平衡的多细胞排列将至少两个细胞固定在平表面上，所述方法包含-提供根据权利要求2-12任一项的装置；-使板暴露于至少一个细胞足够长的时间段，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上以及实现机械平衡的多细胞排列。
17.方法，所述方法以机械平衡的多细胞排列将至少两个细胞固定在平表面上，所述方法包含-提供根据权利要求2-12任一项的装置；-使板对暴露于至少两个细胞足够长的时间段，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并实现机械平衡的多细胞排列。
18.方法，所述方法用于研究多细胞排列的细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能，所述方法包含-提供根据权利要求2-12任一项的装置；-使板暴露于至少一个细胞足够长的时间段，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上并实现机械平衡的多细胞排列；或使板暴露于至少两个细胞足够长的时间段，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并实现机械平衡的多细胞排列；-使细胞以多细胞排列生长在所述粘附性图案组上；和，-观察并测量多细胞排列的细胞形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、细胞分化、细胞极性、整体的内部细胞组构、细胞分裂、和/或细胞的任何功能。
19.选择生物活性化合物的方法，所述方法包含 -提供根据权利要求2-12任一项的装置；-使板暴露于至少一个细胞足够长的时间段，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上并实现机械平衡的多细胞排列；或使板暴露于至少两个细胞足够长的时间段，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并实现机械平衡的多细胞排列；-使测试化合物与以多细胞排列的所述细胞接触； -使细胞以多细胞排列生长在粘附性图案上；和，-观察多细胞排列的所述细胞的形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、整体的内部细胞组构、细胞分化、细胞极性、细胞分裂、和/或任何功能。
20.选择生物活性化合物的方法，所述方法包含 -提供根据权利要求2-12任一项的装置；-使测试化合物与细胞接触；-使板暴露于至少一个所述细胞足够长的时间段，以使细胞在所述粘附性图案组上分裂成至少两个细胞，并附着在每个所述粘附性图案上并实现机械平衡的多细胞排列；或使板暴露于至少两个所述细胞足够长的时间段，以使细胞附着在每个所述粘附性图案上，并实现机械平衡的多细胞排列；-使细胞以多细胞排列生长在粘附性图案上；和，-观察多细胞排列的所述细胞的形状、细胞运动和迁移、细胞-细胞相互作用、细胞结构、整体的内部细胞组构、细胞分化、细胞极性、细胞分裂、和/或任何功能。
全文摘要
本发明涉及获得多细胞排列的方法和装置，所述多细胞排列具有稳定的、定态的、和可复制的空间构型、并任选具有受控的内部细胞组构；用于制备这种装置的方法；用于研究细胞形状、细胞结构、细胞的机械平衡、细胞-细胞相互作用、细胞运动和迁移、细胞分化、整体的内部细胞组构、细胞极性和分裂、和/或细胞的任何功能的方法；用于筛选增强或抑制特定的细胞功能的目标化合物的方法。
文档编号G01N33/50GK102203239SQ200980142235
公开日2011年9月28日 申请日期2009年10月23日 优先权日2008年10月23日
发明者马纽尔·泰利 申请人:原子能及替代能源委员会