一种稳定高效包装病毒的293t 细胞株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种稳定高效包装病毒的293T细胞株及其应用。
【背景技术】
[0002]293细胞是转染腺病毒ElA基因的人肾上皮细胞系，293T细胞由293细胞派生，同时表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区的质粒可以复制。用磷酸钙法转染，293T细胞转染效率可高达50% ;蛋白表达水平高。主要用于病毒包装或瞬时转染来过表达各种外源目标蛋白。
[0003]目前，美国细胞培养库(AmericanType Culture Collect1n, ATCC)已将该细胞系开发成商业化，并广泛用于体外检测和生产重组蛋白质和病毒。然而，目前使用的293T细胞转染效率仍不能达到生产要求，其包装病毒的病毒滴度不高。因此，筛选高转染效率和高出毒滴度的293T细胞成为本领域中需要克服和解决的重要问题。
[0004]利用病毒载体传送外源基因组进入细胞，进行包装感染，该分子机制可将遗传物质带入细胞。可发生于完整活体或是细胞培养中，用于基础研宄、基因疗法或疫苗。可供利用的病毒载体可分为逆转录病毒载体、慢病毒载体与腺病毒载体。病毒载体已成为当前基因治疗载体研宄的热点。
[0005]慢病毒的类型有人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、马传染性贫血EIA等。具有可以感染非分裂期细胞、容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种稳定高效包装病毒的293T细胞株及其应用。
[0007]本发明的第一方面，提供了一种293T细胞株，所述细胞株为保藏号为CCTCCC2015110的人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株、或所述GC-293T细胞株的衍生细胞株。
[0008]在另一优选例中，所述GC-293T细胞株的病毒转染效率比商品化的ATCC 293T细胞株(货号为ATCC CRL-3216?)的病毒转染效率高，优选地高10%以上。
[0009]在另一优选例中，针对同种病毒，所述GC-293T细胞株包装病毒滴度比ATCC293T细胞株包装病毒滴度高，优选地高出5倍以上，更优选地高出10倍以上。
[0010]在另一优选例中，所述GC-293T细胞株包装病毒滴度在3.0E+8TU/ml以上，优选地在 1.0E+9TU/ml 以上。
[0011]在另一优选例中，所述GC-293T细胞株包装的病毒的细胞毒性低于ATCC 293T细胞株包装的病毒的细胞毒性。
[0012]本发明的第二方面，提供了如本发明第一方面所述的293T细胞株，在病毒包装中的应用。
[0013]在另一优选例中，所述病毒选自下组:逆转录病毒、慢病毒、和腺病毒。
[0014]在另一优选例中，所述慢病毒选自:人免疫缺陷型病毒HIV、猴免疫缺陷型病毒SIV、猫免疫缺陷型病毒FIV、和马传染性贫血EIA。
[0015]本发明的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞为基因工程化的本发明第一方面所述的293T细胞株。
[0016]在另一优选例中，所述宿主细胞中含有外源的基因。
[0017]在另一优选例中，所述宿主细胞表达外源的蛋白。
[0018]应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【附图说明】
[0019]图1为实施例1-3中4个载体质粒的图谱信息；
[0020]图2为实施例1中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株质粒转染后细胞照片和转染效率比较；
[0021]图3为实施例1中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株所包装病毒的病毒滴度和细胞毒性比较；
[0022]图4为实施例2中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株质粒转染后细胞照片和转染效率比较；
[0023]图5为实施例2中GC-293T细胞株和ATCC 293T细胞株所包装病毒的病毒滴度和细胞毒性比较；
[0024]图6为实施例3中不同代次的GC-293T细胞株转染后细胞照片和转染效率比较；
[0025]图7为实施例3中不同代次GC-293T细胞株所包装病毒的病毒滴度和细胞毒性比较。
【具体实施方式】
[0026]本发明人通过广泛而深入的研宄，意外地获得一株GC-293T细胞株，保藏号为CCTCC C2015110，保藏时间为2015年7月7日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武汉大学校内。实验结果表明，与商业化的293T细胞株相比，该GC-293T细胞株的病毒感染效率、包装病毒滴度有显著提高，并且所包装的病毒具有较低的细胞毒性。
[0027]在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
[0028]除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
[0029]虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。
[0030]本发明提供了一种用于包装病毒的293T细胞株及其应用，该细胞株具有比商品化293T细胞株更高的转染效率和病毒包装稳定性，而且该细胞株转染效率和包装的病毒滴度较商品化293T细胞株高，包装的病毒细胞毒性较商品化293T细胞株低。
[0031]本发明的目的是提供一种稳定高效包装病毒的293T细胞株。该细胞株出毒效率、转染效率和病毒滴度高，且病毒包装效果稳定；能够解决现有生产中的问题，提高病毒包装效果。
[0032]本发明还提供了上述293T细胞株的驯化方法。
[0033]本发明另一个目的是将这种293T细胞株用于包装慢病毒。
[0034]本发明还比较了上述293T细胞株和商品化293T细胞的转染情况和病毒包装情况。
[0035]本发明提供的人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株，保藏号为CCTCC C2015110,以下称为GC-293T细胞(中国典型培养物保藏中心，地址:湖北省武汉市武汉大学校内；邮编:430072培养物名称:人胚肾上皮细胞GC-293T ；2015年7月7日保藏)。
[0036]该GC-293T细胞属于人胚肾上皮细胞，培养方法为:DMEM培养基(血清含量10% ) ,5% C02，37°C培养。
[0037]在本发明较佳的实施方式中，本发明还提供了该GC-293T细胞株的衍生细胞株，所述衍生细胞株可以是GC-293T细胞株经传代获得的，或者经改造(包括但不限于基因改造)获得的。
[0038]上述人胚肾上皮细胞GC-293T细胞株的驯化方法，包括如下步骤:
[0039](I)取对数生长期的人胚肾上皮细胞293T细胞进行去支原体操作；
[0040](2)去除支原体后的293T细胞稀释(每个细胞培养孔内一个细胞)后进行贴壁培养，使其形成单克隆；
[0041](3)形成单克隆后，进行扩大培养，筛选长势好的单克隆进行进一步扩大培养；
[0042](4)将单克隆细胞株进行磷酸钙-DNA转染，挑选转染效率高，出毒效率高；包装病毒滴度高，对细胞毒性小的单克隆细胞株，即获得了 GC-293T细胞株。
[0043]上述GC-293T细胞株传代12次后，仍保持稳定的转染与病毒包装效果(包括病毒滴度和细胞毒性)。
[0044]本发明的主要优点在于:
[0045](1)GC-293T细胞株转染效率高达80%以上；
[0046](2)包装病毒的病毒滴度可以达到1.0E+9TU/ml以上，并且传代多次后，病毒包装效果稳定可靠；
[0047](3)GC-293T细胞株所包装的病毒具有较低的细胞毒性。
[0048]下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人，分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。