专利名称：双侧植入两种细胞的复合人工皮肤及其构建方法
技术领域：
本发明涉及种人下皮肤，特别是双侧植入成纤维细胞和表皮细胞复合人工皮肤，属医用皮肤创面覆盖物。
本发明还涉及该复合人工皮肤的构建方法。
背景技术：
人工皮肤在临床上用于皮肤损伤的移植治疗，可促进创面愈合，减少疤痕形成，防止感染，尤其是大面积皮肤缺失患者由于缺乏可移植的自体皮肤，只有通过使用创面覆盖物来解决皮肤缺失的早期和晚期问题。
目前，国外在临床应用的皮肤创面覆盖物有表皮移植物、真皮移植物(如异体真皮、去表皮的死真皮、合成网膜、无细胞胶原海绵等)，以及复合皮肤移植物，如胶原凝胶皮肤替代物等。
复合人工皮肤是一种由表皮层和真皮层组成的双层人工皮肤，而表皮层是由表皮细胞分化形成的，真皮层是由成纤维细胞接种于胶原基质中形成的。近年来，人工皮肤在制备方面不断发展进步，如美国发明专利US 5 282 859公布了一项利用牛I、III型胶原构建的人工复合皮，其不足之处是经过戊二醛处理，残存细胞毒性，且强度不够，免疫原性较强，单纯采用I、III型胶原作为支架，缺乏细胞因子的引入；在日本特许公开的JP 97 173 362专利文献中，它是利用甲壳素等为基质，培养哺乳动物皮肤来源的细胞，然后冻干制作出人工皮肤，其缺点是利用氨中和制作胶原凝胶，不适合细胞培养，培养细胞时间短，形成的培养皮肤在组织结构上与天然皮肤有较大差别，胶原凝胶抵抗胶原降解能力差，皮肤脆性大，操作困难，胶原凝胶生产过程复杂。
发明内容
本发明的目的，正是为了克服上述已有技术的缺点与不足，而提供一种含有表皮生长因子的以活性牛胶原皮肤组织工程支架两侧植入成纤维细胞和表皮细胞的复合人工皮肤，从而提高了人工皮肤的性能，促进创面愈合。
本发明还提供了该复合人工皮肤的构建方法。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的双侧植入两种细胞的复合人工皮肤，其特征在于它是以含人表皮生长因子的牛胶原膜为皮肤组织工程支架，在支架的一侧植入成纤维细胞密度为＞106个/cm2，另侧植入表皮细胞密度为＞106个/cm2，内部为生长的成纤维细胞密度为＞106个/cm2。
所述复合人工皮肤的构建方法按下述步骤进行1).含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建a)、将胎牛皮或牛跟腱按常规方法进行脱毛、清洗、冷冻、切薄片，用丙酮脱水，再用石油醚脱脂，真空抽去胎牛皮或牛跟腱切片上的石油醚，加入胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，加入量按干胎牛皮或干牛跟腱重量的1～5％，在20～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动8～12小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液取沉淀用蒸馏水洗涤后，再加入上述干料重量50～150倍的0.5M醋酸溶液，温度0～20℃，振动24～32小时，再加入氯化钠至上述溶液中，氯化钠浓度达到2M，经离心分离，弃上清液取沉淀装入透析袋进行透析3～4次，收集透析后胶原溶液，加入干胎牛皮或干牛跟腱重量1～3％无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，在30～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动4～8小时，去除抗原决定簇；用0.05～0.5M的醋酸溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的无抗原性胶原溶液；b)、再将(a)项的胶原溶液倒入模型中，并在-10～-70℃温度下冷冻4～24小时，再冷冻干燥24～48小时，得到孔径均匀的胶原海绵膜，将胶原海绵膜置于0.5～10％浓度的丙三醇溶液中，吸附膨胀后取出，在105～130℃温度下真空干燥18～32小时；
c)、将肝素溶于0.005～1M醋酸溶液中，肝素与醋酸溶液用量比为W/V0.1～100mg/ml，用100目滤网过滤，得到肝素醋醋溶液；d)、将表皮生长因子溶于三蒸水中，表皮生长因子与三蒸水的用量比为W/V0.1～100mg/ml，得到表皮生长因子水溶液；e)、最后将(c)项的肝素醋酸溶液和(d)项的表皮生长因子水溶液按体积比1∶1～50∶1混合，振动混合48小时后取混合液与5％的丙三醇溶液以体积比0.1～5％混合，用混合液浸润(b)项的胶原海绵膜，润湿后，在-10～-70℃冷冻4～10小时，再真空干燥，得含有表皮生长因子的胶原海绵膜。
2).双侧植入两种细胞复合人工皮肤的构建将1)项含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，经Co60γ射线消毒后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l链霉素的D-Hanks液冲洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时，换培养液，将传代培养的成纤维细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％Co2条件下液面培养二周后，用含有表皮细胞生长因子10mg/ml、牛脑垂体提取物200mg/l、氢化可的松0.5mg/l、胰岛素5mg/l、转铁蛋白10mg/l的MCDB153培养液培养1天，反转支架180度，将表皮细胞以3×105个/cm2密度接种于支架另一侧，每天换培养液，培养10天，用不锈钢筛网作支持，并以气液界面培养14天，即构建成双侧植入成纤维和表皮细胞的复合人工皮肤。
本发明的复合人工皮肤及其构建是采用胎牛皮或牛跟腱为基料经过预处理、脱水、脱脂后，用酶进行一次处理，以降解组织纤维之间的共价键，然后再经过透析，进行二次酶处理，可除去抗原决定簇，用醋酸溶解制成含无抗原性胶原膜为支架，经过制模、冷冻、干燥，再用肝素和表皮生长因子的混合液浸润胶原膜，构成含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，在支架两侧植入成纤维细胞和表皮细胞，而内部为生长的成纤维细胞。该人工皮肤具有良好的物理特征，抗感染能力强，移植手术简单，并与周围皮肤能很好融合一体，通过动物实验，证明它是与正常皮肤组织结构相近，又促进创面愈合的人工皮肤。
由于采取上述技术方案，使本发明技术与已有技术相比具有如下优点及效果a)、本发明的人工皮肤具有良好的物理特性，弹性好、柔韧性好、能抵抗一定的拉力，而且能像天然皮肤一样可剪切、缝合、大小和形状可随创面而变、移植手术简单；b)、基质胶原膜支架的收缩率低、抗感染能力高、能够防止微生物的侵袭，并可抵御伤口微生物的感染，移植后换药次数少，术后护理简单；c)、本发明的人工皮肤，经组织学检查，真皮基质为多孔状，孔径略大于成纤维细胞，成纤维细胞在胶原膜基质中生长均匀，而且在中间有生长的成纤维细胞，其密度均＞106个/cm2；d)、本发明的人工皮肤用裸鼠作了动物移植实验，结果表明，移植后的人工皮肤与周围皮肤融合一体，真皮替代物中有大量的血管形成，胶原排列渐趋规则，表皮分化良好。
图1为本发明的复合人工皮肤组织学结构成纤维细胞接种侧(H.E染色×400倍)。
图2为本发明的复合人工皮肤组织学结构表皮细胞接种侧(H.E染色×1000倍)。
具体实施方案实施例1将胎牛皮按常规方法进行脱毛、去筋膜、脂肪和血污，清洗、冷冻、切成厚0.5mm薄片，用丙酮脱水三次，用石油醚脱脂三次，再抽真空除去石油醚，制成脱水脱脂的胎牛皮为原料，取10g原料，用双蒸水洗涤后加入反应器内，加入由0.1g胃酶和100g水配制的水溶液，进行一次酶处理，在20℃、pH＝2条件下，机械振动24小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液、取沉淀，用双蒸水洗涤三次，加入500g的0.5M醋酸水溶液，在0℃温度下，机械振动32小时后，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离、弃上清、取沉淀装入透析袋进行透析三次，收集透析后胶原溶液，加入反应器内，并加入0.3g菠萝酶与100g水配制的水溶液，进行二次酶处理，在30℃、pH＝6条件下，机械振动8小时，除去抗原决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离、弃上清，用0.05M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法测得含有0.4mg/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径100mm的预冷模具中，在-10℃温度下，冷冻24小时，再真空干燥24小时，得到孔径均匀的厚度为0.1mm胶原海绵膜0.15g，然后置入0.5％浓度的7.5ml丙三醇水溶液中吸附膨胀后取出，在150℃温度下，真空干燥32小时，得干胶原海绵膜，取肝素于0.005M醋酸水溶液中，使肝素含量为0.1mg/ml。再将肯皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.01μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液100ml与表皮生长因子水溶液100ml混合，机械振动48小时后，取上述混合液0.1ml与5％浓度丙三醇水溶液100ml，再次混合，并浸润干胶原海绵网，润湿后在-70℃温度下冷冻4小时，再真空干燥，得到构建的含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。取1cm2支架，用Co60γ射线消毒后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg链霉素的D-Hanks液冲洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时，换培养液，将传代的成纤维细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下液面培养二周后，用含有表皮生长因子10μg/ml、牛脑垂体提取物200mg/l、氢化可的松0.5mg/l、胰岛素5mg/l、转铁蛋白10mg/l的MCDB153培养液培养一天，反转支架180度，将表皮细胞以3×105个/cm2密度接种于支架另一侧，每天换培养液，培养10天，用不锈钢筛网作支持，并以气液面培养14天，即构建1cm2双侧植入成纤维细胞和表皮细胞的复合人工皮肤。由图1所示，1-支架，2-成纤维细胞接种侧的成纤维细胞，3-表皮细胞接种侧的表皮细胞，4-内部生长的成纤维细胞。
实施例2将牛跟腱按实施例1的方法进行脱水脱脂、抽真空除去石油醚，制成脱水脱脂的牛跟腱为原料，取原料10g，用双蒸水洗涤后加入反应容器内，加入由0.3g胰凝乳蛋白酶与100g水配制的水溶液进行一次酶处理，在30℃、pH＝6条件下，机械振动16小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离、弃上清、取沉淀，用双蒸水洗涤四次，加入1000g 0.5M醋酸水溶液，在10℃温度下，机械振动28小时，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，经离心分离、弃上清、取沉淀，装入透析袋进行透析四次，收集透析后，胶原溶液加入反应器内，并加入0.2g木瓜酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在35℃、pH＝7条件下，机械振动6小时，除去抗原性决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清，用0.1M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法测得含有2mg/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径100mm预冷模具中，在-40℃温度下，冷冻10小时，再真空干燥36小时，得到孔径均匀厚度为0.25mm胶原海绵膜0.3g，并置入5％浓度的30ml丙三醇水溶液，吸附膨胀后取出。在120℃温度下，真空干燥20小时，得到干胶原海绵膜，取肝素溶于0.1M的醋酸溶液中，使肝素含量为5mg/ml，再将表皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.01g/ml。取上述肝素醋酸水溶液10ml和表皮生长因子水溶液200ml混合，机械振动48小时后，取上述混合液1ml，与5％浓度丙三醇水溶液100ml再次混合，并浸润干胶原海绵膜，浸润后在-40℃温度下，冷冻6小时，再真空干燥，得到构建的含有表皮因子的皮肤组织工程支架。取1cm2支架，用Co60γ射线消毒后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l链霉素的D-Hanks液冲洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时，换培养液，将传代的成纤维细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下液面培养二周后，用含有表皮生长因子10g/ml、牛脑垂体提取物200mg/l、氢化可的松0.5mg/l、胰岛素5mg/l、转铁蛋白10mg/l的MCDB153培养液培养10天，反转支架180度，将表皮细胞以3×105个/cm2密度接种于支架另一侧，每天换培养液，培养一天，用不锈钢筛网作支持，并以气液面培养14天，即构建1cm2双侧植入成纤维细胞和表皮细胞的复合人工皮肤。
实施例3用实施例2的脱水脱脂的牛跟腱为原料，取原料10g，用双蒸水洗涤后加入反应容器内，加入由0.5g菠萝酶与100g水配制的水溶液进行一次酶处理。在40℃、pH＝8条件下，机械振动8小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清，取沉淀，用双蒸水洗涤四次，加入1500g的0.5M醋酸水溶液中，在20℃温度下，机械振动24小时后，再加入氯化钠，使溶液中氯化钠浓度达2M，沉淀完全后，离心分离、弃上清、取沉淀，装入透析袋进行透析三次，收集透析后，胶原溶液加入反应器内，并加入0.1g胰凝乳蛋白酶与100g水配制的水溶液进行二次酶处理，在40℃、pH＝8条件下，机械振动4小时，除去抗原性决定簇，再按常规方法酶灭活处理，经离心分离，弃上清，取沉淀，用0.5M的醋酸水溶液100g溶解，用失重法测得含有4mg/ml无抗原性胶原溶液，并倒入直径50mm预冷模具中，在-70℃温度下，冷冻4小时，再真空干燥48小时，得到孔径均匀厚度为0.5mm胶原海绵膜0.3g，置入10％浓度的45ml丙三醇水溶液，吸附膨胀后取出，在130℃温度下，真空干燥18小时，得到干胶原海绵膜，取肝素溶于1M的醋酸水溶液中，使肝素含量为10mg/ml，再将表皮生长因子溶于三蒸水中，使表皮生长因子含量为0.1μg/ml，取上述肝素醋酸水溶液50ml与表皮生长因子水溶液150ml混合，机械振动48小时后，取混合液5ml与5％浓度丙三醇水溶液100ml，再次混合，并浸润干胶原海绵膜，润湿后在-10℃温度下冷冻10小时，再真空干燥，得到构建的含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架。取1cm2支架，用Co60γ射线消毒后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg/lm链霉素的D-Hanks液冲洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时，换培养液，将传代的成纤维细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％CO2条件下液面培养二周后，用含有表皮生长因子10μg/ml、牛脑垂体提取物200mg/l、氢化可的松0.5mg/l、胰岛素5mg/l、转铁蛋白10mg/l的MCDB153培养液培养一天，反转支架180度，将表皮细胞以3×105个/cm2密度接种于支架另一侧，每天换培养液，培养10天，用不锈钢筛网作支持，并以气液面培养14天，即构建1cm2双侧植入成纤维细胞和表皮细胞的复合人工皮肤。
权利要求
1.双侧植入两种细胞的复合人工皮肤，其特征在于它是以含人表皮生长因子的牛胶原膜为皮肤组织工程支架，在支架的一侧植入成纤维细胞密度为＞106个/cm2，另侧植入表皮细胞密度为＞106个/cm2，内部为生长的成纤维细胞密度为＞106个/cm2。
2.如权利要求1所述的复合人工皮肤的构建方法，其特征在于它按下述步骤进行1).含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架的构建a)、将胎牛皮或牛跟腱按常规方法进行脱毛、清洗、冷冻、切薄片，用丙酮脱水，再用石油醚脱脂，真空抽去胎牛皮或牛跟腱切片上的石油醚，加入胃酶或无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，加入量按干胎牛皮或干牛跟腱重量的1～5％，在20～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动8～12小时，降解组织纤维间的共价键，经离心分离，弃上清液取沉淀用蒸馏水洗涤后，再加入上述干料重量50～150倍的0.5M醋酸溶液，温度0～20℃，振动24～32小时，再加入氯化钠至上述溶液中，氯化钠浓度达到2M，经离心分离，弃上清液取沉淀装入透析袋进行透析3～4次，收集透析后胶原溶液，加入干胎牛皮或干牛跟腱重量1～3％无花果酶或木瓜酶或胰凝乳蛋白酶或菠萝酶，在30～40℃、pH＝2～8条件下、机械振动4～8小时，去除抗原决定簇；用0.05～0.5M的醋酸溶液溶解，得到酸溶性0.5～4mg/ml的无抗原性胶原溶液；b)、再将(a)项的胶原溶液倒入模型中，并在-10～-70℃温度下冷冻4～24小时，再冷冻干燥24～48小时，得到孔径均匀的胶原海绵膜，将胶原海绵膜置于0.5～10％浓度的丙三醇溶液中，吸附膨胀后取出，在105～130℃温度下真空干燥18～32小时；c)、将肝素溶于0.005～1M醋酸溶液中，肝素与醋酸溶液用量比为W/V0.1～100mg/ml，用100目滤网过滤，得到肝素醋醋溶液；d)、将表皮生长因子溶于三蒸水中，表皮生长因子与三蒸水的用量比为W/V0.1～100mg/ml，得到表皮生长因子水溶液；e)、最后将(c)项的肝素醋酸溶液和(d)项的表皮生长因子水溶液按体积比1∶1～50∶1混合，振动混合48小时后取混合液与5％的丙三醇溶液以体积比0.1～5％混合，用混合液浸润(b)项的胶原海绵膜，润湿后，在-10～-70℃冷冻4～10小时，再真空干燥，得含有表皮生长因子的胶原海绵膜。2).双侧植入两种细胞复合人工皮肤的构建将1)项含有表皮生长因子的皮肤组织工程支架，经Co60γ射线消毒后，用含有1×105μg/l青霉素与100mg/l链霉素的D-Hanks液冲洗后，再加入含有10％胎牛血清的DMEM培养液浸泡24小时，换培养液，将传代培养的成纤维细胞以3×105个/cm2密度接种于支架一侧，在37℃、5％Co2条件下液面培养二周后，用含有表皮细胞生长因子10μg/ml、牛脑垂体提取物200mg/l、氢化可的松0.5mg/l、胰岛素5mg/l、转铁蛋白10mg/l的MCDB153培养液培养1天，反转支架180度，将表皮细胞以3×105个/cm2密度接种于支架另一侧，每天换培养液，培养10天，用不锈钢筛网作支u持，并以气液界面培养14天，即构建成双侧植入成纤维和表皮细胞的复合人工皮肤。
全文摘要
本发明涉及一种双侧植入两种细胞的复合人工皮肤及其构建方法，它以含有表皮生长因子的牛胶原膜为支架，双侧植入成纤维细胞和表皮细胞，中部为生长的成纤维细胞，其密度均＞10
文档编号A61L27/00GK1511594SQ0215953
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月30日 优先权日2002年12月30日
发明者刘杰, 王德文, 崔雪梅, 张燕, 杨颖颙, 于淑贤, 刘 杰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所, 中国皮革和制鞋工业研究院, 中国人民解放军军事医学科学院放射医