一种构建肿瘤多药耐药细胞模型的方法及通过该法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤生物学领域，具体涉及一种反应氧族单机制造模构建体外肿瘤多 药耐药细胞模型的方法，同时还涉及通过该法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株。
【背景技术】
[0002] 构建体外肿瘤细胞模型是研究肿瘤发生、发展及干预的重要实验基础，造模条件 和造模方法的选择是模型构建的决定因素，是揭示同类肿瘤形成的分子机制及研究肿瘤药 物干预的关键平台。
[0003] 肿瘤多药耐药（multidrugresistance,MDR)是指肿瘤细胞接触抗肿瘤药后产生 抗药性，也对结构不同、机制各异的多种抗肿瘤药物产生交叉耐药的现象。MDR是临床肿瘤 化疗最常见的问题，至今未能解决，其原因或与其核心机制不明、无法进行靶向预防及治疗 有关。因此，开发多药耐药肿瘤的细胞模型对于进一步研究其发生机制、探索其治疗靶点及 筛选、评价相关药物具有重大意义。然而MDR产生的核心机制尚未阐明，研究表明：外排蛋 白的表达及功能上调、细胞解毒系统活力增强、抗肿瘤靶点改变以及凋亡应答失敏等因素 相互联系、互相影响，既是MDR细胞的表型特征，又介导了MDR的形成。因此，寻找连接和主 导以上各机制的核心因素，并利用该因素设计、构建MDR细胞模型，不仅有助于阐明MDR的 病理过程，更将为相应靶点探索、药物筛选提供更为合理、高效的评价对象。
[0004] 由于核心机制不明，国内外构建MDR肿瘤细胞模型的主流方法是：直接选用临床 使用的某种抗肿瘤药物，对化疗敏感的一种肿瘤细胞长期培养，得到该细胞对某抗肿瘤药 的耐药细胞株。该方法所构建的MDR细胞模型是当今研究MDR相关领域的主要工具。此类 细胞株的构建主要包括以下几种类型：药物浓度递增法、大剂量冲击法、大剂量冲击结合浓 度递增法及转基因结合药物筛选法等。这种构建方式可以在一定程度上模拟临床MDR产 生的基本情况，却仍有多方面不足，包括：（1)模型设计难以模拟临床MDR形成的核心机制： 临床抗肿瘤治疗往往使用药物联用，因此，仅选择一种药物建立的MDR模型，其特征虽然可 能具备某些临床MDR的共性，但更会体现该种药物药理作用相关的一系列个性，得到的耐 药细胞株恶性表型具有明显的局限性，因此以该模型为实验对象进行的机制、靶点及药物 研究无法代表其他情况MDR的普遍情况、甚至会忽视多药耐药形成的核心因素，无法满足 科研需求。（2)实验操作相关的缺点：传统构建方法操作繁琐、复杂，培养成本高，构建时间 普遍较长，相应失败率较高，培养条件没有统一标准，所得细胞耐药程度差异大。（3)实用 性方面的限制：MDR细胞模型是研究肿瘤多药耐药机制及药物的常用、必要平台，然而传统 模型建立的种类非常有限，市售常用的MDR细胞株种类少、价格高，无法满足个体化研究需 要。其次，由于每次建模只能得到一种药物诱导的一种细胞株，且所得模型仅对该种药物 有较高的耐药性，而对其他药物耐药程度有限，因此，以其为实验对象所得的结果将与临床 MDR情况出现较大偏差。此外，抗肿瘤药物诱导建立的耐药细胞株生长速度普遍较慢，也大 大限制了研究使用。综上所述，寻找耐药形成的共性、核心机制，探索更有优势的MDR模型 培养方式，将有助于改善本领域的研究平台，促进相关基础研究及药物研究的发展。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的旨在提供一种以反应氧族（reactiveoxygenspecies,R0S)为单一 诱导因素构建体外肿瘤多药耐药细胞模型的方法，同时还涉及依据该法建立的人乳腺癌多 药耐药细胞株MCF-7/R0S。
[0006] 基于上述目的，本发明采取了如下技术方案：一种构建肿瘤多药耐药细胞模型的 方法，包括以R0S为孵育药物对敏感肿瘤细胞进行持续培养、使敏感肿瘤细胞产生多药耐 药的步骤。
[0007]所述rosSh2o2。
[0008] 所述敏感肿瘤细胞为人乳腺癌细胞MCF-7。
[0009] 所述方法的具体步骤是： (1) 细胞培养：选择某种对化疗药物敏感的肿瘤细胞株，调整细胞浓度，分组培养备 用； (2) 筛选培养条件：各组细胞分别使用不同的R0S浓度进行持续培养，4周后在存活细 胞组中选择最高的R0S浓度作为该种耐药模型的最优造模浓度； (3) 构建耐药模型：选用对数生长期的该种肿瘤细胞，调整细胞浓度，使用步骤（2)所 得的最优造模浓度持续培养肿瘤细胞，培养过程中按生长情况传代； (4) 耐药性跟踪指导的循环培养：每隔2-3周对步骤（3)中的R0S培养细胞进行耐药倍 数评价；重复执行步骤（3)的相关操作，直到评价结果提示细胞产生的耐药性符合预期；冻 存细胞。
[0010] 步骤（3)所用R0S为H202，浓度0?liimol/L，培养时间为20周。
[0011] 所述方法中，各步骤所用培养基为含10%小牛血清的RPMI1640培养基。
[0012] 步骤（2)及步骤（3)培养细胞过程中隔天随更换培养基更换R0S。
[0013] 根据所述方法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株，细胞株命名为MCF-7/R0S，所用 R0S为H202，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072;保藏日 期：2015年1月28日；保藏编号为CCTCC-C201520。
[0014] 本发明首次使用R0S作为造模药物进行单因素造模，以恒定剂量长期、定向诱导 细胞，模拟临床肿瘤耐药的形成过程。与现有技术相比，该法具有如下技术优势： (1)实验过程简单，造模条件稳定，可显著降低造模成本。
[0015] (2)所建立的耐药细胞株对多种抗肿瘤药物均有交叉耐药，同时具有细胞增殖快 的优点，可有助于提_相关研究的效率。
[0016] (3)具有广泛的适用性：实验表明，以R0S为造模药物建立的模型具有与 临床多药耐药肿瘤相似的多种重要表型，包括：多药耐药相关蛋白1(multidrug resistance-associatedprotein1,MRP1)和P_ 糖蛋白（P-glycoprotein,P_gp)表达 增高；与耐药机制密切相关的核转录因子Nrf2、HIF-1a等过度激活；解毒系统代表酶系 GST高度上调；多药耐药特异性功能分子PKCa、c-Myc表达增加等。
[0017] 同时，发明人在前期研究中也发现：多种商售肿瘤耐药细胞中R0S含量均高于其 敏感株，其中某商售人乳腺癌耐药细胞MCF-7/ADM的R0S含量为其敏感株的2. 77±0. 21 倍。这表明，ROS可能是多药耐药形成的核心因素，通过调控P-gp或其他功能分子促进耐 药产生。本发明选用R0S造模成功，为"R0S可诱导肿瘤多药耐药形成"提供了重要证据，同 时，其耐药机理也决定了R0S诱导肿瘤细胞形成多药耐药具有广泛适用性。此外，试验也证 实，除MCF-7外，以类似条件培养K562细胞，也可诱导其产生耐药性。
[0018] 根据本发明提供的造模方法建立的人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/R0S，对阿霉 素、紫杉醇、顺钼、氟尿嘧啶和长春新碱的耐药指数分别达13. 99、4. 61、5. 32、1. 73、8. 80,具 有多药耐药特性，可为研究相关机制、靶点探索和新药筛选提供了更为合理的实验模型。
【附图说明】
[0019] 图1为阿霉素（ADM)和紫杉醇（Taxol)对各组细胞的IC5(I对比图，图中：林表示产 < 0? 01ks空白对照；##表示/^< 0? 01ks0? 1iimol/L阿霉素组； 图2为本发明人乳腺癌多药耐药细胞株MCF-7/R0S的显微图； 图3为MCF-7和MCF-7/R0S的细胞生长曲线； 图4为MRP1在MCF-7细胞中的表达及定位，其中图4-a为MCF-7细胞的DAPI核染图像 (蓝色)，图4-b为MCF-7细胞的MRP1染色图像(绿色)，图4-c为MCF-7细胞的DAPI与MRP1 染色叠加图像 图5为MRP1在MCF-7/R0S细胞中的表达及定位，其中图5-a为MCF-7/R0S细胞的DAPI核染图像(蓝色)，图5-b为MCF-7/R0S细胞的MRP1染色图像(绿色)，图5-c为MCF-7/R0S细 胞的DAPI与MRP1染色叠加图像； 图6为P-gp在MCF-7细胞中的表达及定位，其中图6-a为MCF-7/细胞的DAPI核染 图像(蓝色)，图6-b为MCF-7细胞的P-gp染色图像(绿色)，图6-c为MCF-7细胞的DAPI与 P-gp染色叠加图像； 图7为P-gp在MCF-7/R0S细胞中的表达及定位，其中图7-a为MCF-7/R0S细胞的DAPI核染图像(蓝色)，图7-b为MCF-7/R0S细胞的P-gp染色图像(绿色)，图7-c为MCF-7/R0S细 胞的DAPI与P-gp染色叠加图像； 图8为HIF-1a在MCF-7细胞中的表达及定位；其中图8-a为MCF-7细胞的DAPI核染 图像(蓝色)，图8-b为MCF-7细胞的HIF-1a染色图像(绿色)，图8-c为MCF-7细胞的DAPI 与HIF-la染色叠加图像； 图9为HIF-1a在MCF-7/R0S细胞中的表达及定位；其中图9-a为MCF-7/R0S细胞 的DAPI核染图像(蓝色)，图9-b为MCF-7/R0S细胞的HIF-1a染色图像(绿色)，图9-c为 MCF-7/R0S细胞的DAPI与HIF-1a染色叠加图像； 图10为Nrf2在MCF-7细胞中的表达及定位，其中图10-a为MCF-7细胞的DAPI核染 图像(蓝色)，图l〇-b为MCF-7细胞的Nrf2染色图像(绿色)，图10-c为MCF-7细胞的DAP