专利名称：可溶性Fas分子应用于肿瘤耐药性检测及化疗疗效预测的制作方法
技术领域：
本发明涉及可溶性Fas作为肿瘤耐药性评价的血清学标志，应用于肿瘤细胞耐药性的临床评价及化疗疗效判断。
肿瘤细胞的耐药性是临床肿瘤化疗缓解率底复发率高的主要原因，目前尚无理想的耐药逆转药物应用于临床，在这种情况下，及时、准确评价肿瘤耐药性对指导临床合理用药和及时调整治疗方案具有重要的意义，现今运用于临床的耐药评价方法主要有体外药物敏感实验和RT-PCR、免疫组化评价mdrl基因等。目前国内外尚未找到可反映肿瘤耐药性的血清学标志，致使尚未有耐药性的血清学评价方法运用于临床。
本发明是提供一个用于肿瘤细胞耐药性评价及对化疗疗效进行判断的血清学标志目前所知，Fas(CD95)为分子量48KD的跨膜蛋白，在许多正常组织及部分肿瘤组织中表达。人Fas基因共由九个外显子组成[26]，mRNA剪接形式的差异可产生跨膜区及部分胞内区缺失的可溶型分子(Souble Fas，sFas)。sFas可以阻断Fas介导的凋亡。近年研究表明Fas介导的凋亡是化疗药物杀伤肿瘤细胞的重要机制，我们尚未公开的研究结果显示耐药肿瘤细胞系表达sFas，其培养液上清中sFas浓度高于亲本细胞；完全缓解(CR)和部分缓解(PR)的肿瘤病人血清sFas浓度显著低于未缓解(NC)和进展(PD)的病人，这些研究结果尚未见国内外类似文献报道，提示sFas表达水平高低和肿瘤的耐药有关，肿瘤病人血清sFas的浓度水平可反映病人的化疗疗效。由此推断，血清sFas水平可能作为肿瘤耐药性的一种血清学指标用于评价肿瘤的耐药并判断化疗疗效。
双抗体夹心ELISA法测定的肿瘤病人血清sFas，在浓度小于20ng/ml时，反映肿瘤细胞对化疗药物敏感，在大于30ng/m1时基本反映肿瘤细胞对化疗药物抵抗。
本发明的来源1.Fas mRNA在转录后水平上剪接形式差异造成跨膜区及部分胞内区缺失，导致部分N末端结构即sFas释放至细胞外液中，肿瘤病人血清sFas可采用双抗体夹心ELISA法评价。
2.我们尚未公开的研究结果显示耐药肿瘤细胞系其培养液上清中sFas浓度高于亲本细胞；完全缓解(CR)和部分缓解(PR)的肿瘤病人血清sFas浓度显著低于未缓解(NC)和进展(PD)的病人。以下所述的实例详细说明了本发明实施例1实验材料1.细胞系及培养条件。
耐药乳腺癌细胞系MCF-7/Adr，系阿霉素低剂量逐级诱导产生的耐药亚系。MCF-7/Adr和其亲本系MCF-7均于DMEM完全培养基中生长，由本室传代培养。2.主要试剂和器材Tnzol、Tag酶、Fas引物、cDNA合成试剂盒，抗sFas单抗、生物素标记抗sFas单抗，HRP-avidin、sFas标准品、24孔细胞培养板、酶标板。3.主要设备FS-919 PCR仪、TGL-16高速台式离心机、DG3022A酶联免疫评仪。实验方法1.RT-PCR检测sFas mRNA表达Trizol试剂提取MCF-7/Adr和MCF-7细胞总RNA，分别取1μg总RNA进行逆转录PCR检测Fas mRNA转录体表达形式结果显示耐药细胞MCF-7/Adr表达高水平sFas mRNA而亲代敏感细胞MCF-7表达高水平Fas mRNA，sFas mRNA表达水平极低。
2.双抗体夹心ELISA法评价培养液上清sFas浓度2×105/孔MCF-7、MCF-7/Adr接种于24孔板，每孔加入1ml培养基，24小时后，吸取100μl培养液上清。将不同稀释度的标准品或培养液上清100μl加入抗sFas单抗预包被酶标孔，混匀，封孔，37℃ 60分钟，洗板，加入生物素标记抗sFas单抗，37℃ 60分钟，洗板，依次加入酶联物和底物，450nm读取OD值，根据标本OD值可在标准曲线上查出对应浓度。结果MCF-7/Adr sFas浓度为76.4±8.4ng/ml(n＝4)，MCF-7 sFas浓度为9.8±2.1ng/ml(n＝4)，表明耐药系MCF-7/Adr sFas表达明显高于其亲本系。实施例2实验材料1.病例选择乳腺癌病人20例，中位年龄43岁(33-54岁)2.主要试剂抗sFas单抗、生物素标记抗sFas单抗，HRP-avidin、sFas标准品、24孔细胞培养板、酶标板。
3.主要器材DG3022A酶联免疫评价仪实验方法1.化疗方案和疗效判断化疗方案Taxol+CDDP疗效判断按照WHO制定的评价标准进行疗效判断，20例病人中完全缓解(CR)4例、部分缓解(PR)9例、未缓解(NC)+进展(PD)7例。
2.血清sFas浓度评价分离病人血清，如实施例1所述方法测定sFas浓度。分析不同化疗疗效病人sFas浓度的差异，结果如表1(下页)，NC+PD病人血清sFas浓度显著高于CR和PR病人(P＜0.01)，而CR和PR病人之间血清sFas浓度无明显差异，表明化疗疗效差的乳腺癌病人血清sFas的浓度水平显著高于疗效较好的乳腺癌病人。提示血清sFas的浓度水平可反映乳腺癌的化疗疗效，由此推测血清sFas水平可作为一种评价乳腺癌耐药性的血清学指标，判断乳腺癌的化疗疗效。
表一.不同疗效乳腺癌病人血清sFas浓度疗效例数 浓度(ng/ml)CR 4 14.3±2.43PR 9 17.7±2.21NC+PD 7 34.7±5.84****P＜0.01，和CR、PR比较实施例3实验方法1.化疗方案和疗效判断化疗方案IFO+DDP+VDS疗效判断按照WHO制定的评价标准进行疗效判断，18例病人中完全缓解(CR)1例、部分缓解(PR)6例、未缓解(NC)+进展(PD)11例。
2.血清sFas浓度评价如实施例2所述方法。结果如表2，NC+PD肺腺癌病人血清sFas浓度显著高于CR和PR病人(P＜0.01)，而CR和PR病人之间血清sFas浓度无明显差异表明化疗疗效差的肺腺癌病人血清sFas的浓度水平显著高于疗效较好的肺腺癌病人。提示血清sFas的浓度水平可反映肺腺癌的化疗疗效，由此推测血清sFas水平可能作为一种评价肺腺癌耐药性的血清学指标，判断肺腺癌的化疗疗效。
表2不同疗效肺腺癌病人血清sFas浓度疗效判断例数浓度(ng/ml)CR 1 10.7PR 6 13.2±1.02NC+PD 11 38.6±0.92****P＜0.01，和CR、PR比较
权利要求
1.可溶性Fas应用于肿瘤耐药性评价，其特征在于(1)Fas mRNA转录后剪接形式差异造成跨膜区及部分胞内区缺失，导致部分N末端结构即可溶性Fas释放至血清中，采用双抗体夹心ELISA法可评价肿瘤细胞培养液上清或肿瘤病人血清可溶性Fas的浓度。(2)我们尚未公开的研究结果显示血清可溶性Fas可作为肿瘤耐药性的血清学标志。
2.按照权利要求1所述用于肿瘤耐药性评价的肿瘤病人血清可溶性Fas，其特征在于浓度小于20ng/ml时，可反映肿瘤细胞对化疗药物敏感。
3.按照权利要求1所述用于肿瘤耐药性评价的肿瘤病人血清可溶性Fas，其特征在于浓度大于30ng/ml时可反映肿瘤细胞对化疗药物抵抗。
4.按照权利要求1至3所述，血清可溶性Fas作为肿瘤耐药性的血清学标志，运用于肿瘤细胞耐药性的评价及化疗疗效判断。
全文摘要
本发明公开了肿瘤耐药的一种血清学标志－sFas。运用双抗体夹心ELISA法评价sFas发现耐药肿瘤细胞培养液上清中sFas浓度高于亲本细胞;完全缓解和部分缓解的肿瘤病人血清sFas浓度显著低于未缓解和进展的病人,提示血清sFas水平可能作为一种反映耐药发生和程度的血清学指标,并可反映化疗疗效。因此血清sFas可用于肿瘤细胞耐药性的临床评价及判断肿瘤的化疗疗效。
文档编号G01N33/53GK1250163SQ99116289
公开日2000年4月12日 申请日期1999年7月19日 优先权日1999年7月19日
发明者张积仁, 陈俊 申请人:第一军医大学珠江医院