专利名称：可溶性ctla4突变体分子及其应用的制作方法
在本申请中引用了各种出版物。这些出版物的公开内容全部通过引用结合到本申请中，以便更全面地描述本发明涉及的现有技术。
在无共同刺激时的T细胞激活导致失败的或无反应性T细胞应答(Schwartz，R.H.(1992)Cell711065-1068)。一种关键的共同刺激信号通过T细胞表面受体CD28与抗原呈递细胞上B7相关分子(例如也分别称为B7-1和B7-2，或CD80和CD86)之间的相互作用来提供(P.Linsley和J.Ledbetter(1993)Annu.Rev.Immunol.11191-212)。
现在称为CD80(B7-1)的分子最初被描述为人B细胞相关激活抗原(Yokochi，T.等(1981)J.Immunol.128823-827；Freeman，G.J.等(1989)J.Immunol.1432714-2722)，随后被鉴定为相关T细胞分子CD28和CTLA4的反受体(Linsley，P.等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA875031-5035；Linsley，P.S.等(1991a)J.Exp.Med.173721-730；Linsley，P.S.等(1991b)J.Exp.Med.174561-570)。
最近，在抗原呈递细胞上鉴定出CTLA4的另一种反受体(Azuma，N.等，(1993)Nature36676-79；Freeman(1993a)Science262909-911；Freeman，G.J.等，(1993b)J.Exp.Med.1782185-2192；Hathcock，K.L.S.等(1994)J.Exp.Med.180631-640；Lenschow，D.J.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011054-11058；Ravi-Wolf，Z.等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA9011182-11 186；Wu，Y.等，(1993)J.Exp.Med.1781789-1793)。现在称为CD86(Caux，C.等，(1994)J.Exp.Med.1801841-1848)、但也称为B7-0(Azuma等，(1993)，参见上文)或B7-2(Freeman等，(1993a)，参见上文)的这种分子在其胞外区中与CD80享有约25％的序列同一性(Azuma等，(1993)，参见上文；Freeman等，(1993a)，参见上文，(1993b)，参见上文)。CD86转染的细胞触发CD28介导的T细胞应答(Azuma等，(1993)，参见上文；Freeman等，(1993a)，(1993b)，参见上文)。
CD80和CD86表达的比较一直是几项研究的主题(Azuma等，(1993)，参见上文；Hathcock等，(1994)，参见上文；Larsen，C.P.等(1994)J.Immunol.1525208-5219；Stack，R.M.等，(1994)J.Immunol.1525723-5733)。目前的资料表明，CD80和CD86表达的调节不同，提示在免疫应答期间CD86的表达往往先于CD80的表达。
通过将CD28和CTLA4的可变(v)样胞外结构域与免疫球蛋白(Ig)的恒定区融合，产生CD28Ig和CTLA4Ig，构建了可溶形式的CD28和CTLA4。CTLA4Ig比CD28Ig更强地结合CD80阳性细胞和CD86阳性细胞(Linsley，P.等(1994)Immunity1793-80)。许多T细胞依赖性免疫应答在体外和体内都被CTLA4Ig阻断(Linsley等，(1991b)，参见上文；Linsley，P.S.等，1992a)Science257792-795；Linsley等，P.S.等，(1992b)J.Exp.Med.1761595-1604；Lenschow，D.J.等，(1992)，Science257789-792；Tan，P.等，(1992)，J.Exp.Med.177165-173；Turka，L.A.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA8911102-11105)。
Peach等(J.Exp.Med.(1994)1802049-2058)在CTLA4胞外结构域中鉴定出对于与CD80强结合重要的多个区。具体地说，在互补性决定区3(CDR3)样区中的六肽基序(MYPPPY)被鉴定为在所有的CD28和CTLA4家族成员中完全保守。通过CTLA4中的MYPPPY基序和CD28Ig中的选定残基的丙氨酸扫描诱变，降低或消除了与CD80的结合。
也构建了CTLA4和CD28同源区互换的嵌合分子。通过将CTLA4的CDR3样区移植到CD28Ig上，所述CDR3样区也包括一个羧基末端被延伸以包括某些非保守氨基酸残基的部分，构建了分子HS4、HS4-A和HS4-B。这些同源突变体显示出对CD80的结合亲和力高于CD28Ig对CD80的的结合亲和力。
在另一组嵌合同源突变体中，将在CD28中不保守并且预测在空间上与CDR3样区相邻的CTLA4的CDR1样区，移植到HS4和HS4-A中。这些嵌合同源突变体分子(命名为HS7和HS8)表现出对CD80的结合亲和力甚至高于CD28Ig。
通过将CTLA4的CDR2样区移植到HS7和HS8中，也制备了嵌合同源突变体分子，但这种组合没有进一步改进对CD80的结合亲和力。因此，确定CTLA4和CD28的MYPPPY基序对于与CD80的结合是重要的，但CTLA4的CDR1样区和CDR3样区中的某些非保守氨基酸残基也对CTLA4与CD80结合亲和力的增强产生影响。
表明CTLA4Ig有效阻断CD80相关的T细胞共同刺激，但不如阻断CD86相关应答时有效。构建了可溶性CTLA4突变体分子、尤其是对CD86的亲和力高于野生型CTLA4的那些分子，因为它们可能能够比CTLA4Ig更好地阻断抗原特异性活化细胞的引发(priming)。
仍需要改进的CTLA4分子，以提供比先前已知的可溶形式CTLA4更好的用于免疫抑制和癌症治疗的药用组合物。
CTLA4突变体分子的一个实例是本文所述的L104EA29YIg(图7)。CTLA4突变体分子的另一个实例是本文所述的L104EIg(图8)。L104EA29YIg和L104EIg结合CD80和CD86的亲和力高于CTLA4Ig。
图2A和2B说明了得自FACS测定的数据，显示了L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig与人CD80或CD86转染的CHO细胞的结合，如下文实施例2中所述。
图3A和3B描绘了CD80阳性和CD86阳性CHO细胞增殖的抑制，如下文实施例2中所述。
图4A和4B显示了L104EA29YIg在抑制经初次和二次同种刺激的(allostimulated)T细胞的增殖方面比CTLA4Ig更为有效，如下文实施例2中所述。
图5A-C说明L104EA29YIg在抑制经同种刺激的人T细胞产生细胞因子IL-2(图5A)、IL-4(图5B)和γ-干扰素(图5C)方面比CTLA4Ig更为有效，如下文实施例2中所述。
图6证明L104EA29YIg在抑制经植物凝集素(PHA)刺激的猴T细胞增殖方面比CTLA4Ig更为有效，如下文实施例2中所述。
图7描绘了CTLA4突变体分子(L104EA29YIg)的核苷酸序列和氨基酸序列，L104EA29YIg包含一个信号肽；一个CTLA4的突变型胞外结构域，始于位置+1的甲硫氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸，或始于位置-1的丙氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸；和一个Ig区，如下文实施例1中所述。
图8描绘了CTLA4突变体分子(L104EIg)的核苷酸序列和氨基酸序列，L104EIg包含一个信号肽；一个CTLA4的突变型胞外结构域，始于位置+1的甲硫氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸，或始于位置-1的丙氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸；和一个Ig区，如下文实施例1中所述。
图9描绘了CTLA4Ig的核苷酸序列和氨基酸序列，CTLA4Ig具有一个信号肽；一个CTLA4胞外结构域的野生型氨基酸序列，所述胞外结构域始于位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸，或始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸；和一个Ig区。
图10A-C是CTLA4Ig(1道)、L104EIg(2道)和L104EA29YIg(3A道)的SDS凝胶(图10A)；以及CTLA4Ig(图10B)和L104EA29YIg(图10C)的大小排阻层析分析。
图11A和11B说明了通过NMR光谱法测定的从所述溶液结构产生的CTLA4胞外Ig V样折叠的带状结构图。图11B显示了S25-R33区和MYPPPY区的扩展视野，指示了亲和力增强型突变L104和A29的位置和侧链取向。
图12描绘了具有L104EA29YIg插入片段的载体piLN-LEA29Y的示意图。
发明详述定义本申请中所用的以下词或短语具有所限定的含义。
本文所用的“野生型CTLA4”具有天然存在的全长CTLA4(美国专利第5,434,131号、第5,844,095号、第5,851,795号)或其结合CD80和/或CD86和/或干扰CD80和/或CD86结合其配体的胞外结构域的氨基酸序列。在具体实施方案中，野生型CTLA4的胞外结构域始于位置+1的甲硫氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸，或者野生型CTLA4的胞外结构域始于位置-1的丙氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸。野生型CTLA4是一种细胞表面蛋白，具有一个N末端胞外结构域、一个跨膜结构域和一个C末端胞质结构域。胞外结构域与靶抗原例如CD80和CD86结合。在细胞内，天然存在的野生型CTLA4蛋白被翻译为未成熟多肽，它在N末端包括一个信号肽。所述未成熟多肽经历翻译后加工，所述加工包括切割并除去所述信号肽，产生具有新产生的与未成熟形式的N末端不同的N末端的CTLA4切割产物。本领域技术人员会认识到，可能发生额外的翻译后加工，从所述CTLA4切割产物的新产生的N末端除去一个或多个氨基酸。成熟形式的CTLA4分子包括CTLA4的胞外结构域或其与CD80和/或CD86结合的任何部分。
“CTLA4Ig”是一种可溶性融合蛋白，包含与Ig尾连接的一个野生型CTLA4的胞外结构域或其结合CD80和/或CD86的任何部分。一个具体实施方案包括始于位置+1的甲硫氨酸且终止于位置+124的天冬氨酸的野生型CTLA4胞外结构域；或始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸的野生型CTLA4胞外结构域；于位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺；和包括位置+126的谷氨酸至位置+357的赖氨酸的免疫球蛋白部分(图9)。
本文所用的“融合蛋白”定义为用本领域熟知的、如美国专利第5,434,131号或第5,637,481号中描述的方法连接在一起的一个或多个氨基酸序列。从而，所连接的氨基酸序列形成一种融合蛋白。
本文所用的“CTLA4突变体分子”是可以是在CTLA4中(最好是在CTLA4的胞外结构域中)具有一个或多个突变、使得它与野生型CTLA4分子相似但不再相同的全长CTLA4的分子或其部分(衍生物或片段)。CTLA4突变体分子或者结合CD80，或者结合CD86，或者结合CD80和CD86两者。突变型CTLA4分子可以在其中包括或者包括与其连接的具有生物活性或化学活性的非CTLA4分子。所述突变体分子可以是可溶性的(即循环的)或与表面结合。CTLA4突变体分子可以包括CTLA4的完整胞外结构域或其部分，例如片段或衍生物。CTLA4突变体分子可以合成制备或重组制备。
本文所用的术语“突变”是野生型多肽的核苷酸序列或氨基酸序列的改变。在这种情况下，它是野生型CTLA4胞外结构域中的改变。所述改变可以是氨基酸的改变，包括取代、缺失、添加或截短。突变体分子可以具有一个或多个突变。核苷酸序列的突变可能导致或不导致氨基酸序列的突变，这是本领域众所周知的。在该方面，某些核苷酸密码子编码相同的氨基酸。实例包括核苷酸密码子CGU、CGG、CGC和CGA编码氨基酸精氨酸(R)；或密码子GAU和GAC编码氨基酸天冬氨酸(D)。因此，一种蛋白质可以由一种核酸分子或由其具体核苷酸序列不同、但仍编码具有相同序列的蛋白质分子的多种核酸分子编码。氨基酸编码序列如下氨基酸符号单字母密码子符号丙氨酸 Ala A GCU，GCC，GCA，GCG半胱氨酸 Cys C UGU，UGC天冬氨酸 Asp D GAU，GAC谷氨酸 Glu E GAA，GAG苯丙氨酸 Phe F UUU，UUC甘氨酸 Gly G GGU，GGC，GGA，GGG组氨酸 His H CAU，CAC异亮氨酸 Ile I AUU，AUC，AUA赖氨酸 Lys K AAA，AAG亮氨酸 Leu L UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG甲硫氨酸 Met M AUG天冬酰胺 Asn N AAU，AAC脯氨酸 Pro P CCU，CCC，CCA，CCG谷氨酰胺 Gln Q CAA，CAG精氨酸 Arg R CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG丝氨酸 Ser S UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC苏氨酸 Thr T ACU，ACC，ACA，ACG缬氨酸 Val V GUU，GUC，GUA，GUG色氨酸 Trp W UGG酪氨酸 Tyr Y UAU，UAC本文所用的“CTLA4的胞外结构域”是CTLA4中识别并结合CD80和/或CD86的部分。例如，CTLA4的胞外结构域包括位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸(图9)。或者，CTLA4的胞外结构域包括位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸(图9)。所述胞外结构域包括结合CD80和/或CD86的CTLA4的片段或衍生物。
本文所用的“非CTLA4蛋白序列”或“非CTLA4分子”定义为不结合CD80和/或CD86且不干扰CTLA4与其靶结合的任何分子。一个实例包括但不限于免疫球蛋白(Ig)的恒定区或其部分。最好是，所述Ig恒定区是人或猴Ig恒定区，例如人C(γ)1，包括铰链区、CH2区和CH3区。可以将所述Ig恒定区突变，以减弱其效应子功能(美国专利第5,637,481号和第6,132,992号)。
本文所用的“CTLA4突变体分子的片段”是CTLA4突变体分子的一部分，最好是CTLA4的胞外结构域或其识别并结合其靶(例如CD80和/或CD86)的部分。
本文所用的“CTLA4突变体分子的衍生物”是与CTLA4的胞外结构域享有至少70％序列相似性并且功能相似、即识别并结合CD80和/或CD86的分子。
本文所用的“CTLA4分子的一部分”包括结合CD80和/或CD86的CTLA4分子的片段和衍生物。
为了使本文描述的本发明可以被更全面地理解，进行以下描述。本发明的组合物本发明提供识别并结合CD80和/或CD86的可溶性CTLA4突变体分子。在某些实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体与CD80和/或CD86的亲和力高于CTLA4Ig。
CTLA4突变体分子的实例包括L104EA29YIg(图7)。L104EA29YIg的氨基酸序列可以始于氨基酸位置-1的丙氨酸且终止于氨基酸位置+357的赖氨酸。或者，L104EA29YIg的氨基酸序列可以始于氨基酸位置+1的甲硫氨酸且终止于氨基酸位置+357的赖氨酸。L104EA29YIg的CTLA4部分包括氨基酸位置+1的甲硫氨酸至氨基酸位置+124的天冬氨酸。L104EA29YIg包括位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺和一个免疫球蛋白部分，所述免疫球蛋白部分包括位置+126的谷氨酸至位置+357的赖氨酸(图7)。L104EA29YIg与CD80的结合亲和力比野生型CTLA4Ig(下文称为CTLA4Ig)的亲和力高约2倍，而与CD86的结合亲和力高约4倍。这种更强的结合导致L104EA29YIg在阻断免疫应答方面比CTLA4Ig更为有效。
CTLA4突变体分子至少包括CTLA4的胞外结构域或其结合CD80和/或CD86的部分。CTLA4突变体分子的胞外部分可以包含始于位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列(图7或8)。或者，所述CTLA4的胞外结构域包含始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列(图7或8)。
在一个实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子是包含CTLA4胞外结构域的融合蛋白，所述CTLA4胞外结构域在始于+25的丝氨酸且终止于+33的精氨酸的氨基酸序列区(S25-R33)中具有一个或多个突变。例如，野生型CTLA4中位置+29的丙氨酸可以被酪氨酸(密码子UAU，UAC)取代。或者，丙氨酸可以被亮氨酸(密码子UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG)、苯丙氨酸(密码子UUU，UUC)、色氨酸(密码子UGG)或苏氨酸(密码子ACU，ACC，ACA，ACG)取代。正如本领域技术人员容易理解的，RNA序列的尿嘧啶(U)核苷酸对应于DNA序列的胸腺嘧啶(T)核苷酸。
在另一实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子是包含CTLA4胞外结构域的融合蛋白，所述CTLA4胞外结构域在始于+97的甲硫氨酸且终止于+107的甘氨酸的氨基酸序列区(M97-G107)中或其附近具有一个或多个突变。例如，野生型CTLA4中位置+104的亮氨酸可以被谷氨酸(密码子GAA，GAG)取代。具有这一取代的CTLA4突变体分子在本文中被称为L104EIg(图8)。
在再一实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子是包含CTLA4胞外结构域的融合蛋白，所述CTLA4胞外结构域在S25-R33区和M97-G107区中具有一个或多个突变。例如，在一个实施方案中，CTLA4突变体分子在位置+29包含酪氨酸而不是丙氨酸；在位置+104包含谷氨酸而不是亮氨酸。具有这些取代的CTLA4突变体分子在本文中被称为L104EA29YIg(图7)。编码L104EA29YIg的核酸分子包含在pD16L104EA29YIg中，并于2000年6月19日保藏于美国典型培养物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)，10801University Blvd.，Manasas，VA 20110-2209(ATCC No.PTA-2104)。pD16L104EA29YIg载体是pcDNA3载体(INVITROGEN)的一种衍生物。
本发明还提供可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含图7或8中所示的CTLA4突变体的胞外结构域或其部分和一个改变所述CTLA4突变体分子的溶解性、亲和性和/或效价的部分。
按照本发明的实施，所述部分可以是免疫球蛋白的恒定区或其部分。对于体内应用，最好是所述免疫球蛋白的恒定区在所述受治疗者体内不引发有害的免疫应答。例如，在临床方案中，可能最好是所述突变体分子包括人或猴免疫球蛋白的恒定区。合适的免疫球蛋白区的一个实例是人C(γ)1，它包含铰链区、CH2区和CH3区。其它同种型是可行的。此外，其它免疫球蛋白的恒定区也是可以接受的(最好是其它弱免疫原性或非免疫原性免疫球蛋白的恒定区)。
其它部分包括多肽标志。合适标志的实例包括但不限于p97分子、env gp120分子、E7分子和ova分子(Dash，B.等(1994)J.Gen.Virol.751389-97；Ikeda，T.等(1994)Gene138193-6；Falk，K.等(1993)Cell.Immunol.150447-52；Fujisaka，K.等(1994)Virology204789-93)。用作标志的其它分子是可行的(Gerard，C.等(1994)Neuroscience62721-739；Byrn，R.等J.Virol.(1989)634370-4375；Smith，D.等(1987)Science2381704-1707；Lasky，L.，(1996)Science233209-212)。
本发明还提供与野生型CTLA4相比更优先与CD80和/或CD86抗原反应的可溶性突变型CTLA4Ig融合蛋白。一个实例是图7所示的L104EA29YIg。
在另一实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子包括一个接点氨基酸残基，该残基位于所述CTLA4部分和免疫球蛋白部分之间。所述接点氨基酸可以是任何氨基酸，包括谷氨酰胺。所述接点氨基酸可以通过本领域已知的分子方法或化学合成方法引入。
在另一实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子包括免疫球蛋白的部分(例如铰链区、CH2区和CH3区)，其中所述免疫球蛋白部分的铰链区中任何或所有的半胱氨酸残基被丝氨酸取代，例如位置+130、+136或+139的半胱氨酸(图7或8)。所述突变体分子也可以包括位置+148的脯氨酸被丝氨酸取代，如图7或8中所示。
所述可溶性CTLA4突变体分子可以包括一个与所述突变体分子CTLA4部分的胞外结构域N末端连接的信号肽序列。所述信号肽可以是允许所述突变体分子分泌的任何序列，包括得自制癌蛋白M(Malik等(1989)Molec.Cell.Biol.92847-2853)或CD5(Jones，N.H.等，(1986)Nature323346-349)的信号肽、或得自任何胞外蛋白的信号肽。
所述突变体分子可以包括在CTLA4胞外结构域N末端连接的制癌蛋白M信号肽、和与CTLA4胞外结构域C末端连接的人免疫球蛋白分子(例如铰链区、CH2区和CH3区)。这种分子包括制癌蛋白M的信号肽，包括具有位置-26的甲硫氨酸至位置-1的丙氨酸的氨基酸序列；CTLA4部分，包括具有位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列；位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，包括具有位置+126的谷氨酸至位置+357的赖氨酸的氨基酸序列。
本发明的可溶性CTLA4突变体分子可以通过分子方法或化学合成法获得。所述分子方法可以包括下述步骤将表达并编码所述可溶性CTLA4突变体分子的核酸分子导入合适宿主细胞中；在允许所述宿主细胞表达所述突变体分子的条件下培养如此导入的宿主细胞；并且分离所述表达的突变体分子。所述突变体分子的信号肽部分使得所述蛋白分子可以在细胞表面表达，并且被所述宿主细胞分泌。已翻译的突变体分子可以经历翻译后修饰，包括切割所述信号肽，产生具有所述CTLA4和所述免疫球蛋白部分的成熟蛋白。所述切割可以在位置+1的丙氨酸之后进行，产生在位置+1具有甲硫氨酸作为第一个氨基酸的成熟突变体分子(图7或8)。或者，所述切割可以在位置-2的甲硫氨酸之后进行，产生在位置-1具有丙氨酸作为第一个氨基酸的成熟突变体分子。
一个优选实施方案是具有与整个或部分人免疫球蛋白分子(例如铰链区、CH2区和CH3区)连接的人CTLA4胞外结构域的可溶性CTLA4突变体分子。这种优选分子包括所述可溶性分子的CTLA4部分，包括具有位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列；位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，包括位置+126的谷氨酸至位置+357的赖氨酸。将具有CTLA4胞外结构域的部分突变，使得位置+29的丙氨酸被酪氨酸取代，且位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。可以将所述突变体分子的免疫球蛋白部分突变，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被丝氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被丝氨酸取代。这种突变体分子在本文中被命名为L104EA29YIg(图7)。
L104EA29YIg的另一个实施方案是具有下述氨基酸序列的突变体分子具有位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸、位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺、和在位置+126包含谷氨酸(例如+126至位置+357的赖氨酸)的免疫球蛋白部分。将具有CTLA4胞外结构域的部分突变，使得位置+29的丙氨酸被酪氨酸取代，且位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。将所述突变体分子的免疫球蛋白部分突变，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被丝氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被丝氨酸取代。这种突变体分子在本文中被命名为L104EA29YIg(图7)。在信号序列被切割后，L104EA29YIg或者可以始于位置+1的甲硫氨酸，或者可以始于位置-1的丙氨酸。
本发明的另一种突变体分子是具有与人免疫球蛋白分子(例如铰链区、CH2区和CH3区)连接的人CTLA4胞外结构域的可溶性CTLA4突变体分子。该分子包括一个编码CTLA4始于位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列部分、位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺、和包括具有位置+126的谷氨酸至位置+357的赖氨酸的氨基酸序列的免疫球蛋白部分。将具有CTLA4胞外结构域的部分突变，使得位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。将所述突变体分子的铰链区部分突变，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被丝氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被丝氨酸取代。这种突变体分子在本文中被命名为L104EIg(图8)。
或者，L104EIg的一个实施方案是具有与人免疫球蛋白分子(例如铰链区、CH2区和CH3区)连接的人CTLA4胞外结构域的可溶性CTLA4突变体分子。这种优选分子包括一个包括始于位置-1的丙氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4部分、位置+125的一个接点氨基酸残基谷氨酰胺、和包含位置+126的谷氨酸至位置+357的赖氨酸的免疫球蛋白部分。将具有CTLA4胞外结构域的部分突变，使得位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。将所述突变体分子的铰链区部分突变，使得位置+130、+136和+139的半胱氨酸被丝氨酸取代，且位置+148的脯氨酸被丝氨酸取代。这种突变体分子在本文中被命名为L104EIg(图8)。
此外，本发明提供一种可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子具有(a)一个阻断T细胞增殖的膜糖蛋白(例如CD28、CD86、CD80、CD40和gp39)的第一氨基酸序列，该氨基酸序列与第二氨基酸融合；(b)所述第二氨基酸序列，该氨基酸序列为阻断T细胞增殖的突变型CTLA4胞外结构域的片段，例如包含位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸分子(图7或图8)；和(c)一个第三氨基酸序列，该氨基酸序列用作鉴定标志或增强所述分子的溶解性。例如，所述第三氨基酸序列可以基本上由非免疫原性免疫球蛋白分子的铰链区、CH2区和CH3区的氨基酸残基组成。合适免疫球蛋白分子的实例包括但不限于人或猴免疫球蛋白，例如C(γ)1。其它同种型也是可行的。
本发明还提供核酸分子，所述核酸分子包含编码对应于本发明可溶性CTLA4突变体分子的氨基酸序列的核苷酸序列。在一个实施方案中，所述核酸分子是DNA(例如cDNA)或其杂交体。或者，所述核酸分子是RNA或其杂交体。
另外，本发明提供包含本发明核苷酸序列的载体。也提供宿主载体系统。所述宿主载体系统包括在合适宿主细胞中的本发明载体。合适宿主细胞的实例包括但不限于原核细胞和真核细胞。
本发明包括用于治疗免疫系统疾病的药用组合物，所述药用组合物包含药用有效量的可溶性CTLA4突变体分子。在某些实施方案中，所述免疫系统疾病由CD28和/或CTLA4阳性细胞与CD80和/或CD86阳性细胞的相互作用所介导。所述可溶性CTLA4突变体分子最好是在CTLA4胞外结构域中具有一个或多个突变的CTLA4分子。所述药用组合物可以包含可溶性CTLA4突变蛋白分子和/或核酸分子和/或编码所述分子的载体。在优选实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子具有或者图7或者图8中所示的CTLA4胞外结构域的氨基酸序列(分别为L104EA29Y或L104E)。甚至更优选所述可溶性CTLA4突变体分子是本文公开的L104EA29YIg。所述组合物可以还包含其它治疗药，包括但不限于药物毒素、酶、抗体或缀合物。
所述药用组合物也最好包括合适的载体和辅料，包括与本发明的分子(例如可溶性CTLA4突变体分子，例如L104EA29Y或L104E)混合时仍保留所述分子活性、且不与所述受治疗者免疫系统反应的任何物质。合适载体和辅料的实例包括但不限于人血清白蛋白；离子交换剂；氧化铝；卵磷脂；缓冲物质，例如磷酸盐；甘氨酸；山梨酸；山梨酸钾；盐或电解质，例如硫酸鱼精蛋白。其它实例包括任何标准药用载体，例如磷酸缓冲盐溶液；水；乳液，例如水包油乳液；和各种类型的润湿剂。其它载体也可以包括无菌溶液；片剂，包括包衣片剂和胶囊剂。通常，这类载体包含赋形剂，例如淀粉、乳、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐、硬脂酸镁或硬脂酸钙、滑石粉、植物油脂、树胶、二醇类或其它已知的赋形剂。这类载体也可以包括香料和颜色添加剂或其它组分。通过众所周知的常规方法配制包含这类载体的组合物。这类组合物也可以用各种脂质组合物(例如脂质体)以及在各种聚合组合物(例如聚合物微球)中配制。
本发明的药用组合物可以采用常规给药模式给予所述受治疗者，所述给药模式包括但不限于静脉内(i.V.)给药、腹膜内(i.p.)给药、肌内(i.m.)给药、皮下给药、口服给药、作为栓剂给药或作为局部接触剂给药、或者植入缓释装置例如微渗透泵。
本发明的药用组合物可以为各种各样的剂型，包括但不限于液体溶液剂或混悬剂、片剂、丸剂、散剂、栓剂、聚合微囊或微囊泡(microvesicles)、脂质体和注射液或输液。优选的形式取决于给药模式和治疗应用。
本发明组合物的最有效的给药模式和给药方案取决于疾病的严重程度和病程、所述患者的健康状况和对治疗的反应以及治疗医师的判断。因此，所述组合物的剂量应该针对各个患者来确定(titrate)。
可以给予受治疗者所述可溶性CTLA4突变体分子，其给药量和给药时间(例如时间长度和/或多次)应足以在所述受治疗者体内阻断内源B7(例如CD80和/或CD86)分子结合其相应的配体。阻断内源B7/配体结合，从而抑制B7阳性细胞(例如CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞)与CD28阳性细胞和/或CTLA4阳性细胞的相互作用。治疗药的剂量取决于许多因素，包括但不限于受影响的组织类型、所治疗的自身免疫病的类型、所述疾病的严重程度、受治疗者的健康状况和受治疗者对采用所述药物治疗的反应。因此，所述药物的剂量可以根据受治疗者和给药模式而变化。所述可溶性CTLA4突变体分子的给药量可以为0.1-20.0mg/kg患者体重/天，最好是0.5-10.0mg/kg/天。可以在各种时间内给予本发明的药用组合物。在一个实施方案中，可以给予本发明的药用组合物达1小时或1小时以上。另外，根据疾病的严重程度以及本领域了解的其它因素，可以重复所述给药。
本发明还提供生产蛋白质的方法，所述方法包括培养本发明的宿主载体系统，以便在所述宿主中产生所述蛋白质，并且回收如此产生的蛋白质。
另外，本发明提供调节功能性CTLA4阳性和CD28阳性T细胞与CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞的相互作用的方法。所述方法包括使所述CD80阳性和/或CD86阳性细胞与本发明的可溶性CTLA4突变体分子接触，以形成突变型CTLA4/CD80和/或突变型CTLA4/CD86复合体，所述复合体干扰内源CTLA4抗原与CD80和/或CD86的反应，和/或所述复合体干扰内源CD28抗原与CD80和/或CD86的反应。在本发明的一个实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子是含有突变型CTLA4的胞外结构域的至少一部分的融合蛋白。在另一实施方案中，所述可溶性CTLA4突变体分子包含一个第一氨基酸序列，它包括得自具有位置+1的甲硫氨酸至位置+124的天冬氨酸的氨基酸序列的CTLA4胞外结构域，包括至少一个突变；和一个第二氨基酸序列，它包括人免疫球蛋白γ1分子的铰链区、CH2区和CH3区(图7或8)。
按照本发明的实施，使所述CD80阳性细胞或CD86阳性细胞与本发明可溶性CTLA4突变体分子的片段或衍生物接触。或者，所述可溶性CTLA4突变体分子是CD28Ig/CTLA4Ig融合蛋白，所述融合蛋白具有与一个第二氨基酸序列融合的一个第一氨基酸序列以及一个第三氨基酸序列，所述第一氨基酸序列对应于CD28受体胞外结构域的一部分，所述第二氨基酸序列对应于CTLA4突变体受体的胞外结构域的一部分，而所述第三氨基酸序列对应于人免疫球蛋白C-γ-1的铰链区、CH2区和CH3区。
预期所述可溶性CTLA4突变体分子在体内表现出抑制特性。在由于T细胞和APC细胞之间接触而发生T细胞/APC细胞相互作用例如T细胞/B细胞相互作用的条件下，所导入的CTLA4突变体分子结合以与CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞(例如B细胞)反应，可能干扰(即抑制)所述T细胞/APC细胞相互作用，导致调节免疫应答。
本发明提供负调节免疫应答的方法。用可溶性CTLA4突变体分子负调节免疫应答，可以例如抑制或阻断已经在进行之中的免疫应答，或者可能包括防止诱导免疫应答。本发明的可溶性CTLA4分子可以通过抑制T细胞应答或通过在T细胞中诱导特异性耐受或通过这两种途径，抑制活化T细胞的功能，例如T淋巴细胞增殖和细胞因子分泌。
本发明还提供治疗免疫系统疾病和耐受诱导的方法。在具体实施方案中，所述免疫系统疾病由于CD28阳性细胞和/或CTLA4阳性细胞与CD80/CD86阳性细胞相互作用而介导。在另一实施方案中，T细胞相互作用被抑制。免疫系统疾病包括但不限于自身免疫病、免疫增生病和移植相关疾病。这些方法包括将本发明的可溶性CTLA4突变体分子给予受治疗者，以调节T细胞与所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞的相互作用。或者，可以给予具有与CTLA4突变体分子连接的膜糖蛋白的CTLA4突变杂种。移植相关疾病的实例包括移植物抗宿主病(GVHD)(例如可能因骨髓移植而产生，或导致耐受诱导)、与移植排斥、慢性排斥和组织或细胞同种或异种移植物(包括实体器官、皮肤、胰岛、肌肉、肝细胞、神经元)相关的免疫疾病。免疫增生病的实例包括但不限于牛皮癣；T细胞淋巴瘤；急性T细胞淋巴母细胞性白血病；睾丸血管中心T细胞淋巴瘤；良性淋巴细胞性脉管炎；和自身免疫病，例如狼疮(例如红斑狼疮、狼疮性肾炎)、桥本甲状腺炎、原发性粘液水肿、格雷夫斯病、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、艾迪生病、糖尿病(例如胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病)、good pasture综合征、重症肌无力、天疱疮、局限性回肠炎、交感性眼炎、自身免疫性眼色素层炎、多发性硬化、自身免疫性出血性贫血、特发性血小板减少、原发性胆汁性肝硬变、慢性活动性肝炎、溃疡性结肠炎、斯耶格伦综合征、风湿病(例如类风湿性关节炎)、多肌炎、硬皮病和混合型结缔组织病。
本发明还提供抑制受治疗者的实体器官和/或组织移植排斥的方法，所述受治疗者是移植组织的受体。通常，在组织移植物中，由于T细胞将移植物识别为外来的，然后免疫应答破坏所述移植物，而启动移植排斥。本发明的可溶性CTLA4突变体分子通过抑制T淋巴细胞增殖和/或细胞因子分泌，可能导致组织破坏减小，而抗原特异性T细胞无应答性的诱导，可能导致长期接受移植物，而无需普遍性的免疫抑制。此外。本发明的可溶性CTLA4突变体分子可以与其它药物一起给予，所述其它药物包括但不限于皮质类固醇、环孢菌素、雷帕霉素、麦考酚酸mofetil、硫唑嘌呤、tacrolismus、basiliximab和/或其它生物制剂。
本发明也提供抑制受治疗者体内移植物抗宿主病的方法。所述方法包括将本发明的可溶性CTLA4突变体分子单独地或与同IL-2、IL-4或γ-干扰素反应的其它额外配体一起给予所述受治疗者。例如，可以将本发明的可溶性CTLA4突变体分子给予骨髓移植受体，以抑制供体T细胞的同种反应性。或者，可以在移植之前，使骨髓移植物内的供体T细胞离体对受体的同种抗原耐受。
可溶性CTLA4突变体分子对T细胞应答的抑制也可以用于治疗自身免疫病。许多自身免疫病因对自身抗原具有反应性的T细胞的不当活化、并且促使涉及所述疾病病理学的细胞因子和自身抗体产生而引起。将可溶性CTLA4突变体分子给予患有自身免疫病或易感自身免疫病的受治疗者体内，可以防止自身反应性T细胞的活化，并且可以减轻或消除病症。这种方法也可以包括将本发明的可溶性CTLA4突变体分子单独或与同IL-2、IL-4或γ-干扰素具有反应性的其它额外配体一起给予所述受治疗者。
本发明还包括所述可溶性CTLA4突变体分子与其它免疫抑制药例如环孢菌素(参见Mathiesen，“Prolonged Survival and Vascularizationof Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous Systemof Cyclosporm A-Treated Rats(在环孢菌素治疗的大鼠中枢神经系统中异种移植的人成胶质细胞瘤细胞的存活延长和血管形成)”(1989)Cancer Lett.，44151-156)、泼尼松、硫唑嘌呤和氨甲蝶呤(R.Handschumacher“第53章Drugs Used for Immunosuppression”第1264-1276页)的应用。其它免疫抑制药也是可行的。例如，对于类风湿性关节炎的治疗，可以将可溶性CTLA4突变体分子与包括但不限于皮质类固醇、非类固醇消炎药/Cox-2抑制剂、氨甲蝶呤、羟氯喹、sulphasalazopryine、金盐、etanercept、infliximab、anakinra、硫唑嘌呤和/或其它生物制剂例如抗TNF的药物一起给予。对于系统性红斑狼疮的治疗，可以将可溶性CTLA4突变体分子与包括但不限于皮质类固醇、cytoxan、硫唑嘌呤、羟氯喹、麦考酚酸mofetil和/或其它生物制剂的药物一起给予。此外，对于多发性硬化的治疗，可以将可溶性CTLA4突变体分子与包括但不限于皮质类固醇、干扰素β-1a、干扰素β-1b、glatiramer acetate、盐酸米托蒽醌和/或其它生物制剂的药物一起给予。
所述可溶性CTLA4突变体分子(最好是L104EA29YIg)也可以与调节免疫应答的一种或多种以下药物联合使用可溶性gp39(也称为CD40配体(CD40L)、CD154、T-BAM、TRAP)、可溶性CD29、可溶性CD40、可溶性CD80、可溶性CD86、可溶性CD28、可溶性CD56、可溶性Thy-1、可溶性CD3、可溶性TCR、可溶性VLA-4、可溶性VCAM-1、可溶性LECAM-1、可溶性ELAM-1、可溶性CD44、与gp39反应的抗体、与CD40反应的抗体、与B7反应的抗体、与CD28反应的抗体、与LFA-1反应的抗体、与LFA-2反应的抗体、与IL-2反应的抗体、与IL-12反应的抗体、与IFN-γ反应的抗体、与CD2反应的抗体、与CD48反应的抗体、与任何ICAM(例如ICAM-2)反应的抗体、与CTLA4反应的抗体、与Thy-1反应的抗体、与CD56反应的抗体、与CD3反应的抗体、与CD29反应的抗体、与TCR反应的抗体、与VLA-4反应的抗体、与VCAM-1反应的抗体、与LECAM-1反应的抗体、与ELAM-1反应的抗体、与CD44反应的抗体。在某些实施方案中，优选单克隆抗体。在其它实施方案中，优选抗体片段。正如本领域技术人员容易理解的，所述组合可以包括本发明的可溶性CTLA4突变体分子与一种其它的免疫抑制药、所述可溶性CTLA4突变体分子与两种其它免疫抑制药、所述可溶性CTLA4突变体分子与三种其它免疫抑制药等。所述最佳组合和剂量的确定可以采用本领域众所周知的方法来确定和优化。
某些具体组合包括以下组合L104EA29YIg和CD80mAb；L104EA29YIg和CD86mAb；L104EA29YIg、CD80mAb和CD86mAb；L104EA29YIg和gp39mAb；L104EA29YIg和CD40mAb；L104EA29YIg和CD28mAb；L104EA29YIg、CD80mAb和CD86mAb以及gp39mAb；L104EA29YIg、CD80mAb和CD86mAb以及CD40mAb；以及L104EA29YIg、抗LFA1mAb和抗gp39mAb。gp39mAb的一个具体实例是MR1。其它组合是本领域技术人员容易想到和理解的。
本发明的可溶性CTLA4突变体分子例如L104EA29Y可以作为唯一的有效成分或者与免疫调节方案中的其它药物或其它消炎药一起给予，例如以治疗或预防同种或异种移植物急性或慢性排斥或炎性疾病或自身免疫病，或诱导耐受。例如，它可以与以下药物联合使用钙调磷酸酶抑制剂，例如环孢菌素A或FK506；免疫抑制性大环内酯，例如雷帕霉素或其衍生物，例如40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素；淋巴细胞归巢剂，例如FTY720或其类似物；皮质类固醇；环磷酰胺；硫唑嘌呤；氨甲蝶呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；麦考酚酸；麦考酚酸mofetil；15-deoxyspergualine或其类似物；免疫抑制性单克隆抗体，例如针对白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD 11a/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或其配体的单克隆抗体；或其它免疫调节化合物，例如CTLA4/CD28-Ig或其它粘附分子抑制剂，例如mAb或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择蛋白拮抗剂和VLA-4拮抗剂。所述化合物在上述适应症例如耐受诱导中与干扰CD40及其配体的化合物(例如抗CD40的抗体和抗CD40-L的抗体)联合尤其有用。
当本发明的可溶性CTLA4突变体分子与其它免疫抑制疗法/免疫调节疗法或抗炎疗法(例如上文具体描述的)结合给予时，所述共同给予的免疫抑制药、免疫调节药或抗炎化合物的剂量自然将根据所用的辅助药物的类型(例如它是类固醇还是环孢菌素)、所用的具体药物、所治疗的病症等而变化。
按照上述描述，在再一方面，本发明提供如上限定的方法，所述方法包括共同给予(例如同时给予或顺序给予)治疗有效量的游离形式或药学上可接受的盐形式的本发明可溶性CTLA4突变体分子L104EA29YIg、以及第二种药物，所述第二种药物是免疫抑制药、免疫调节药或消炎药，例如如上所述的药物。还提供例如用于任何上述方法中的治疗组合，例如试剂盒，所述试剂盒包含与至少一种药用组合物同时或顺序使用的游离形式或药学上可接受的盐形式的L104EA29YIg，所述药用组合物包含一种免疫抑制药、免疫调节药或消炎药。所述试剂盒可以包含给药说明。生产本发明分子的方法可以在原核细胞中表达CTLA4突变体分子。原核生物最通常以各种细菌菌株为代表。细菌可以是革兰氏阳性菌或者是革兰氏阴性菌。通常，优选革兰氏阴性细菌例如大肠杆菌(E.coli)。也可以使用其它微生物菌株。
可以将编码CTLA4突变体分子的序列插入为在原核细胞例如大肠杆菌中表达外源序列而设计的载体中。这些载体可以包括常用的原核控制序列，原核控制序列在本文中定义为包括转录起始的启动子、任选带有操纵子、和核糖体结合部位序列，包括诸如以下的常用启动子β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子系统(Chang等，(1977)Nature1981056)、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel等，(1980)NucleicAcids Res.84057)和λ衍生PL启动子和N-基因核糖体结合部位(Shimatake等，(1981)Nature292128)。
这类表达载体也将包括复制起点和选择标记，例如赋予对抗生素抗性的β-内酰胺酶或新霉素磷酸转移酶基因，使得所述载体可以在细菌中复制，携带所述质粒的细胞可以根据在抗生素(例如氨苄青霉素或卡那霉素)存在下生长来进行选择。
可以通过各种各样的标准方法，包括但不限于CaCl2-休克(shock)(Cohen，(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA692110，和Sambrook等(编著)，“Molecular CloningA Laboratory Manual”，第2版，Cold SpringHarbor Press，(1989))和电穿孔，将表达质粒导入原核细胞中。
按照本发明的实施，真核细胞也是合适的宿主细胞。真核细胞的实例包括任何动物细胞(无论是原代细胞还是无限增殖化细胞)、酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosacharomyces pombe)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))和植物细胞。骨髓瘤细胞、COS细胞和CHO细胞是可以用作宿主的动物细胞的实例。具体的CHO细胞包括但不限于DG44(Chasin等，1986Som.Cell.Molec.Genet.12555-556；Kolkekar 1997Biochemistry3610901-10909)、CHO-K1(ATCC No.CCL-61)、CHO-K1 Tet-On细胞系(Clontech)、名为ECACC 85050302的CHO(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、CHO克隆13(GEIMG，Genova，IT)、CHO克隆B(GEIMG，Genova，IT)、名为ECACC 93061607的CHO-K1/SF(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)和名为ECACC 92052129的RR-CHOK1(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)。示例性的植物细胞包括烟草(全植株、细胞培养物或愈伤组织)、玉米、大豆和水稻细胞。玉米、大豆和水稻种子也是可接受的。
也可以将编码CTLA4突变体分子的核酸序列插入到为在真核宿主中表达外源序列而设计的载体中。所述载体的调节元件可以根据具体的真核宿主而变化。
在表达载体中使用的常用真核控制序列包括与哺乳动物细胞匹配的启动子和控制序列，例如CMV启动子(CDM8载体)和禽肉瘤病毒(ASV)(πLN载体)。其它常用的启动子包括得自猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期启动子(Fiers等，(1973)Nature273113)或其它病毒启动子，例如得自多瘤病毒、腺病毒2和牛乳头瘤病毒的那些启动子。也可以使用诱导型启动子，例如hMTII(Karin等，(1982)Nature299797-802)。
用于在真核生物中表达CTLA4突变体分子的载体也可以携带称为增强子区的序列。这些在优化基因表达方面是重要的，并且存在于所述启动区的上游或下游。
用于真核宿主细胞的表达载体的实例包括但不限于用于哺乳动物宿主细胞的载体(例如BPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2(Maniatis)；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1(Life Technologies)；pVPakc载体、pCMV载体、pSG5载体(Stratagene))、逆转录病毒载体(例如pFB载体(Stratagene))、pCDNA-3(Invitrogen)或其修饰形式、腺病毒载体；腺伴随病毒载体、杆状病毒载体、酵母载体(例如pESC载体(Stratagene))。
可以将编码CTLA4突变体分子的核酸序列整合到真核宿主细胞的基因组中，并且当宿主基因组复制时进行复制。或者，携带CTLA4突变体分子的载体可以含有复制起点，以允许在染色体外复制。
为了在酿酒酵母中表达所述核酸序列，可以使用得自内源酵母质粒的复制起点-2μ环(Broach，(1983)Meth.Enz.101307)。或者，可以使用得自酵母基因组中能够启动自主复制的序列(参见例如Stinchcomb等，(1979)Nature28239)；Tschemper等，(1980)Gene10157；和Clarke等，(1983)Meth.Enz.101300)。
供酵母载体用的转录控制序列包括用于合成糖酵解酶的启动子(Hess等，(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7149；Holland等，(1978)Biochemistry174900)。本领域已知的其它启动子包括在CDM8载体中提供的CMV启动子(Toyama和Okayama，(1990)FEBS268217-221)；3-磷酸甘油酸激酶的启动子(Hitzeman等，(1980)J.Biol.Chem.2552073)和其它糖酵解酶的启动子。
其它启动子是诱导型的，因为它们可以受环境刺激或所述细胞的生长培养基的调节。这些诱导型启动子包括得自热激蛋白、醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮分解代谢相关的酶和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的基因的启动子。
可以将调节序列置于所述编码序列的3’端。这些序列可以用来稳定信使RNA。这类终止子存在于几种酵母衍生基因和哺乳动物基因中所述编码序列之后的3’非翻译区中。
供植物和植物细胞用的示例性载体包括但不限于农杆菌Ti质粒、花椰菜花叶病毒(CaMV)和番茄金花叶病毒(TGMV)。
Axel已经描述了哺乳动物细胞宿主系统转化的一般性方面(于1983年8月16日授予的美国专利第4,399,216号)。哺乳动物细胞可以用包括但不限于以下的方法来转化在磷酸钙存在下转染、微注射、电穿孔或通过用病毒载体转导。
将外源DNA序列导入植物和酵母基因组中的方法包括(1)机械方法，例如将DNA微注射到单个细胞或原生质体中，将细胞与玻璃珠在DNA存在下涡旋混合，或将包有DNA的钨球或金球射入到细胞或原生质体中；(2)通过经聚乙二醇处理或经过高压电脉冲(电穿孔)使细胞膜对大分子通透而导入DNA；或(3)应用与细胞膜融合的脂质体(含有cDNA)。
CTLA4突变体分子的表达可以通过本领域已知的方法检测。例如，可以通过将SDS-PAGE凝胶考马斯染色，并且用结合CTLA4的抗体进行免疫印迹，可以检测所述突变体分子。蛋白质的回收可以采用标准蛋白纯化法例如亲和层析或离子交换层析来进行，以得到基本纯的产物(R.Scopes，“Protein Purification，Principles and Practice”，第3版，Springer-Verlag(1994))。
本发明还提供如上所述产生的可溶性CTLA4突变体分子。基于CTLA4Ig密码子的诱变在一个实施方案中，用定点诱变和一种新的筛选方法来鉴定CTLA4胞外结构域中改进对CD86结合亲和力的几种突变。在该实施方案中，在以下部位进行突变CTLA4胞外结构域中从丝氨酸25至精氨酸33的区中的残基、C’链(丙氨酸49和苏氨酸51)、F链(赖氨酸93、谷氨酸95和亮氨酸96)、以及在甲硫氨酸97至酪氨酸102的区、酪氨酸103至甘氨酸107的区和G链中的位置谷氨酰胺111、酪氨酸113和异亮氨酸115。这些位点的选择基于对嵌合CD28/CTLA4融合蛋白的研究(Peach等，J.Exp.Med.，1994，1802049-2058)和一种预测哪些氨基酸残基侧链将是溶剂暴露的模型和在CD28和CTLA4之间的某些位置缺乏氨基酸残基同一性或同源性。此外，在空间上紧邻所鉴定的残基(5-20埃单位)的任何残基被认为是本发明的部分。
为了合成和筛选对CD80和/或CD86的亲和性改变的可溶性CTLA4突变体分子，采用一种两步策略。所述实验要求首先产生一个在CTLA4胞外部分的特定密码子突变的文库，然后通过BIAcore分析筛选这些突变，以鉴定对CD80或CD86的反应性改变的突变体。Biacore测定系统(Pharmacia，Piscataway，N.J.)使用一种表面等离波子共振检测系统，基本上包括将或者CD80Ig或者CD86Ig共价结合于包有葡聚糖的位于检测器中的传感器芯片上。然后将所述受试分子注射到含有所述传感器芯片的室中，可以根据与传感器芯片的包有葡聚糖一侧物理结合的分子量的改变，评价所结合的互补蛋白的量；分子量的改变可以用所述检测系统测量。本发明的优点因为CTLA4与CD80和CD86的结合的特征为缔合(“on”)速率快和解离(“off”)速率快，并且因为CTLA4Ig-CD86复合体的解离比CTLA4Ig-CD80复合体的解离快约5-8倍，所以这就是减慢CTLA4Ig与CD80和/或CD86解离的速率可能产生更为有效的免疫抑制特性的分子的原因。因此，预期与野生型CTLA4和非突变型CTLA4Ig相比对CD80阳性细胞或CD86阳性细胞的亲和力较高的可溶性CTLA4突变体分子，以高于野生型CTLA4或非突变型CTLA4Ig的效力阻断抗原特异性活化细胞的引发。
此外，CTLA4Ig的生产成本非常高。具有更有效的免疫抑制特性的高亲和力突变型CTLA4Ig分子可以以比非突变型CTLA4Ig低得多的剂量用于临床，而达到相似的免疫抑制水平。因此，可溶性CTLA4突变体分子例如L104EA29YIg可能是非常成本有效的。
提供以下实施例以说明本发明，并且有助于技术人员实施和使用本发明。所述实施例不是以任何方式限制本发明的范围。
对于邻近CTLA4Ig的S25-R33的诱变，首先通过PCR引物指导的诱变，将沉默NheI限制位点引入该环的5’。PCR产物用NheI/XbaI消化，并亚克隆到经相似切割的CTLA4Ig或L104EIg表达载体中。用该方法构建双位点CTLA4突变体分子L104EA29YIg(图7)。具体地说，用编码单位点CTLA4突变体分子L104EIg的核酸分子作为模板，构建双位点CTLA4突变体分子L104EA29YIg。具有L104EA29YIg的piLN载体示于图12。
目前的体外和体内研究表明，CTLA4Ig本身不能完全阻断抗原特异性活化T细胞的引发。采用CTLA4Ig和CD80或CD86特异性单克隆抗体测量T细胞增殖的抑制的体外研究表明，抗CD80单克隆抗体不增强CTLA4Ig的抑制。然而，抗CD86单克隆抗体却增强所述抑制，表明CTLA4Ig在阻断CD86相互作用方面并不同样有效。这些数据支持Linsley等的早期发现(Immunity，(1994)，1793-801)，所述发现表明CD80介导的细胞应答的抑制比CD86介导的应答需要低约100倍的CTLA4Ig浓度。根据这些发现，推断出对CD86的亲和力高于野生型CTLA4的可溶性CTLA4突变体分子应该能够比CTLA4Ig更好地阻断抗原特异性活化细胞的引发。
为此，采用一种新的筛选方法筛选以上实施例1中所述的可溶性CTLA4突变体分子，以鉴定CTLA4胞外结构域中CD80和CD86结合亲和力改进的几种突变。这一筛选策略提供了一种有效的方法，直接鉴定解离速率明显较慢的突变体，而无需蛋白纯化或定量，因为“解离”速率的测定是与浓度无关(O’Shannessy等，(1993)Anal.Biochem.，212457-468)。
用各种小量制备纯化的质粒DNA转染COS细胞，并将其繁殖数天。向包被可溶性CD80Ig或CD86Ig的BIAcore生物传感芯片(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)供应三天的条件培养基。通过表面等离波子共振(O’Shannessy，D.J.等，(1993)Anal，Biochem.212457-468)测量突变蛋白的特异性缔合和解离。所有实验均在BIAcoreTM或BIAcoreTM2000生物传感器上于25℃下进行。用标准N-乙基-N’-(二甲氨基丙基)碳二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺偶联(Johnsson，B.等(1991)Anal.Biochem.198268-277；Khilko，S.N.等(1993)J.Biol.Chem2685425-15434)，将配体在研究级NCM5传感器芯片(Pharmacia)上固定化。筛选方法在24孔组织培养板中生长的COS细胞用编码突变型CTLA4Ig的DNA瞬时转染。3天后，收集合有分泌型可溶性突变型CTLA4Ig的培养基。
让COS细胞条件培养基流过用CD86Ig或CD80Ig衍生化的BIAcore生物传感芯片(如Greene等，1996J.Biol.Chem.27126762-26771中所述)，根据“解离”速率比野生型CTLA4Ig中观测的解离速率慢，鉴定出突变体分子。将对应于所选培养基样品的cDNA测序，制备DNA以进行更大规模的COS细胞瞬时转染，在对培养基进行A蛋白纯化后，从中制备突变型CTLA4Ig蛋白。
如J.Greene等1996J.Biol.Chem.27126762-26771中和本文所述，进行BIAcore分析条件和平衡结合数据分析。BIAcore数据分析在分析之前，将Senosorgram基线标准化为零应答单位(RU)。使样品通过模拟衍生化的流动细胞，以测定由于溶液之间体积折射率(bulk refractive index)的差异而产生的背景应答单位(RU)值。根据Req对C的曲线计算平衡解离常数(Kd)，其中Req是稳态反应减去模拟衍生化芯片上的应答，而C是被分析物的摩尔浓度。用商业非线性曲线拟合软件(Prism，GraphPAD Software)分析结合曲线。
首先将实验数据与单一配体与单一受体结合的模型(单位点模型，即简单朗缪尔系统，A+BAB)拟合，根据等式R＝Rmax·C/(Kd+C)计算平衡缔合常数(Kd＝[A]·[B]\[AB])。随后，将数据与最简单的配体结合的双位点模型(即根据等式R＝Rmax1·C\(Kd1+C)+Rmax2·C\(Kd2+C)描述与具有两个非相互作用非依赖性结合部位的受体)拟合。
这两种模型的适合度通过与实验数据比较进行肉眼分析，以及通过平方和的F检验进行统计学分析。选择较简单的单位点模型作为最佳拟合，除非双位点模型拟合显著更好(p＜0.1)。
缔合和解离分析用BIA evaluation 2.1软件(Pharmanai)来进行。以两种方式计算缔合速率常数Kon，假定既有同源单位点相互作用也有平行的双位点相互作用。对于单位点相互作用，kon值按照等式Rt＝Req(1-exp-ks(t-t0)来计算，其中Rt是给定时间t的应答；Req是稳态应答；t0是注射开始时的时间；而ks＝dR/dt＝kon·Ckoff，其中C为根据单体结合部位计算的被分析物的浓度。对于双位点相互作用，kon值按照等式Rt＝Req1(1-exp-ks1(t-t0)+Req2(1-expks2(t-t0)来计算。对于每种模型，kon值根据ks对C的曲线图的计算斜率(至约70％最大缔合)来确定。
解离数据按照单位点(AB＝A+B)或双位点(AiBj＝Ai+Bj)模型进行分析，速率常数(koff)根据最佳拟合曲线来计算。使用所述结合部位模型，除非所述残基大于机器背景(2-10 RU，按照机器)，在这种情况下使用双结合部位模型。利用关系t1/2＝0.693/koff，计算受体占据的半衰期。流式细胞术鼠mAB L307.4(抗CD80)购自Becton Dickinson(San Jose，Califomia)，而IT2.2(抗B7-0[也称为CD86])购自Pharmingen(San Diego，Califormia)。对于免疫染色，通过在含有10mM EDTA的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中孵育，从培养管中取出CD80阳性和/或CD86阳性CHO细胞。首先将CHO细胞(1-10×105)与mAb或免疫球蛋白融合蛋白在含有10％胎牛血清(FBS)的DMEM中孵育，然后洗涤，并与异硫氰酸荧光素缀合的山羊抗小鼠或抗人免疫球蛋白第二步试剂(Tago，Burlingame，California)一起孵育。给予细胞最后一次洗涤，并在FACScan(Becton Dickinson)上分析。SDS-PAGE和大小排阻层析在Tris/甘氨酸4-20％丙烯酰胺凝胶(Novex，San Diego，CA)上进行SDS-PAGE。分析型凝胶用考马斯蓝染色，通过数字扫描获得湿凝胶的图象。通过大小排阻层析，用在含有0.02％NaN3的磷酸缓冲盐溶液中以1.0ml/min的流速平衡的TSK-GEL G300 SWXL柱(7.8×300mm，Tosohaas，Montgomeryville，PA)分析CTLA4Ig(25μg)和L104EA29YIg(25μg)。CTLA4XC120S和L104EA29YXC120S如先前已描述的方法(Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.27015417-15424)制备单链CTLA4XC120S。简而言之，制癌蛋白M CTLA4(OMCTLA4)表达质粒用作模板，选择正向引物GAGGTGATAAAGCTTCACCAATGGGTGTACTGCTCACACAG以匹配所述载体中的序列；而反向引物GTGGTGTATTGGTCTAGATCAATCAGAATCTGGGCACGGTTC对应于CTLA4胞外结构域中的最后7个氨基酸(即氨基酸118-124)，并且含有一个限制性酶位点和一个终止密码子(TGA)。反向引物限定了一个C120S(位置120上半胱氨酸变为丝氨酸)突变。具体地说，以上所示反向引物的核苷酸序列GCA(核苷酸34-36)被以下核苷酸序列之一取代AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT。正如本领域技术人员会理解的，核苷酸序列GCA是半胱氨酸的密码子TGC的反向互补序列。同样，核苷酸序列AGA、GGA、TGA、CGA、ACT或GCT是丝氨酸密码子的反向互补序列。聚合酶链式反应产物用HindIII/XbaI消化，定向亚克隆到表达载体πLN(Bristol-Myers Squibb Company，Princeton，NJ)中。以同样方式制备L104EA29YXC120S。每种构建体通过DNA测序来确证。高亲和力突变体的鉴定和生物化学表征选择24个氨基酸进行诱变，通过表面等离波子共振(SPR；如上所述，参见上文)分析所得的～2300种突变型蛋白的CD86Ig结合。每个位点诱变的主要效应概述于表II中。S25-R33中某些氨基酸的随机诱变显然不改变配体结合。E31和R33以及残基M97-Y102的诱变显然导致配体结合降低。残基S25、A29以及T30、K93、L96、Y103、L104和G105的诱变产生“缔合”速率慢和/或“解离”速率慢的蛋白质。这些结果证实了先前的发现，即S25-R33区中的残基和M97-Y102中或其附近的残基影响配体结合(Peach等，(1994)J.Exp.Med，1802049-2058)。
位点S25、T30、K93、L96、Y103和G105的诱变导致鉴定出与CD86Ig“解离”速率较慢的某些突变蛋白。然而，在这些情况下，所述慢的“解离”速率被慢的“缔合”速率所平衡，导致突变蛋白对CD86Ig的总体亲和力看起来与野生型CTLA4Ig的相似。另外，K93的诱变导致显著聚集，这可能是由于所观测到的动力学改变所引起的。
L104的随机诱变后接COS细胞转染和通过在固定化CD86Ig上培养基样品的SPR进行筛选，得到6种含有突变蛋白的培养基样品，所述突变蛋白的“解离”速率比野生型CTLA4Ig慢约2倍。当对这些突变体的相应cDNA测序时，发现每种cDNA编码一个亮氨酸变为谷氨酸的突变(L104E)。显然，亮氨酸104被取代为天冬氨酸(L104D)不影响CD86Ig的结合。
然后如上所述在表II中所列的每个位点重复诱变，这时采用L104E代替野生型CTLA4Ig作为PCR模板。再次利用固定化CD86Ig的SPR分析，鉴定出6种得自丙氨酸29诱变的培养基样品，所述蛋白质的“解离”速率比野生型CTLA4Ig慢约4倍。最慢的两种是酪氨酸取代(L104EA29Y)，两种是亮氨酸(L104EA29L)、一种是色氨酸(L104EA29W)，一种是苏氨酸(L104EA29T)。显然，当在野生型CTLA4Ig中将丙氨酸29单独随机突变时，没有鉴定出解离”速率慢的突变体。
经纯化的L104E和L104EA29YIg的相对分子量和聚集状态通过SDS-PAGE和大小排阻层析来评价。L104EA29YIg(～1μg；3道)和L104EIg(～1μg；2道)电泳迁移率在还原条件(～50kDa；+βME；加上2-巯基乙醇)和非还原条件(～100kDa；-βME)下在表观上与CTLA4Ig(～1μg；1道)相同(图10A)。大小排阻层析表明，L104EA29YIg(图10C)的迁移率在表观上与二聚CTLA4Ig相同(图10B)。主峰代表蛋白二聚体，而图10B中较快洗脱的次要峰代表较高分子量的聚集体。约5.0％的CTLA4Ig以较高分子量的聚集体存在，但没有L104EA29YIg或L104EIg聚集的证据。因此，用L104EIg和L104EA29YIg观测到与CD86Ig的较强结合可能不能归因于诱变诱导的聚集。平衡和动态结合分析采用表面等离波子共振(SPR)，在A蛋白纯化的CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg上进行平衡和动态结合分析。结果示于表I中。根据在浓度(5,0-200nM)范围内产生的结合曲线，计算所观测的平衡解离常数(Kd；表I)。L104EA29YIg与CD86Ig的结合比L104EIg或CTLA4Ig强。L104EA29YIg(3.21nM)的Kd比L104EIg(6.06nM)或CTLA4Ig(13.9nM)低，表明L104EA29YIg与CD86Ig的结合亲和力更高。L104EA29YIg(3.66nM)的Kd比L104EIg(4.47nM)或CTLA4Ig(6.51nM)低，表明L104EA29YIg与CD80Ig的结合亲和力更高。
动态结合分析表明，CTLA4Ig、L104EIg和L104EA29YIg与CD80结合的相对缔合”速率相似，对CD86Ig的“缔合”速率也相似(表I)。然而，这些分子的“解离”速率不同(表I)。与CTLA4Ig相比，L104EA29YIg与CD80Ig的“解离”速率慢约2倍，与CD86Ig的“解离”速率慢约4倍。L104E的“解离”速率介于L104EA29YIg和CTLA4Ig之间。因为这些突变的引入不显著影响“缔合”速率，所以用L104EA29YIg观测到的对CD80Ig和CD86Ig亲和力的增强同样主要是由于“解离”速率降低引起的。
为了确定L104EA29YIg对CD86Ig和CD80Ig的亲和力增强是否是影响每个单体缔合为二聚体的方式的突变所致、或者是否在每个单体中引入了亲和力增强的结构改变，如上述所述和Linsley等，(1995)J.Biol.Chem.，27015417-15424中所述的方法，在将半胱氨酸120诱变为丝氨酸后，制备CTLA4和L104EA29YIg胞外结构域的单链构建体。在通过SPR分析配体结合特性之前，通过凝胶渗透层析(Linsley等，(1995)，参见上文)，表明纯化蛋白CTLA4XC120S和L104EA29YXC120S是单体的。结果表明，两种单体蛋白对CD86Ig的结合亲和性比所观测到的其相应二聚体低约35-80倍(表I)。这支持了先前发表的确立高亲和力配体结合需要CTLA4二聚化的资料(Greene等，(1996)J.Biol.Chem.，27126762-26771)。
L104EA29YXC120S与CD80Ig和CD86Ig两者结合的亲和性均比CTLA4XC120S高约2倍。所述增强的亲和性是由于与所述两种配体的解离速率慢约3倍所致。因此，L104EA29Y较强的配体结合很可能是由于已经引入到每个单体链中的亲和力增强性结构改变所致，而非因分子二聚化的改变所致。亲和力增强突变的位置和结构分析最近通过NMR光谱法测定了CTLA4胞外IgV样结构域的溶液结构(Metzler等，(1997)Nature Struct.Biol.4527-531)。这允许精确确定三维折叠中亮氨酸104和丙氨酸29的位置(图11A-B)。亮氨酸104位于高度保守的MYPPPY氨基酸序列附近。丙氨酸29位于在空间上与MYPPPY区相邻的S25-S33区C末端附近。虽然在这两个区的碱基上的残基之间有显著的相互作用，但表观上在L104和A29之间没有直接的相互作用，虽然它们都构成所述蛋白中相邻疏水核心的部分。通过建模评价这两种亲和力增强突变体的结构重要性。A29Y突变可以容易地容纳在S25-R33区和MYPPPY区之间的裂缝中，可以用来稳定MYPPPY区的构象。在野生型CTLA4中，L104与MYPPPY区附近的L96和V94形成广泛的疏水作用。因为两个原因，谷氨酸突变采用与L104相似的构象是非常不可能的。首先，在不显著扰乱S25-R33区的情况下，在所述结构中没有足够的空间容纳较长的谷氨酸的侧链。其次，疏水区中掩盖谷氨酸侧链的负电荷的电荷成本将会很大。而建模研究预测谷氨酸侧链翻转到表面上，在此其电荷可以通过溶剂化而稳定。这种构象的改变可以容易由G105提供，而相对于所述区中其它残基的扭曲最小。高亲和力突变体与表达CD80或CD86的CHO细胞的结合CTLA4Ig和突变体分子与稳定转染的CD80+和CD86+CHO细胞结合的FACS分析(图2)如本文所述方法进行。让CD80阳性和CD86阳性CHO细胞与浓度增加的CTLA4Ig、L104EA29YIg或L104EIg一起孵育，然后洗涤。结合的免疫球蛋白融合蛋白用异硫氰酸荧光素缀合的山羊抗人免疫球蛋白检测。
如图2所示，将CD80阳性或CD86阳性CHO细胞(1.5×105)与所示浓度的CTLA4Ig(实心方形)、L104EA29YIg(圆形)或L104EIg(三角形)一起于23℃孵育2小时，洗涤，然后与异硫氰酸荧光素缀合的山羊抗人免疫球蛋白抗体一起孵育。在FACScan上分析(单一检测(singledetermination))总共5,000个活细胞上的结合，用PC-LYSYS，根据数据直方图确定平均荧光强度(MFI)。数据根据在仅与第二步试剂一起孵育的细胞上测量的背景荧光(MFI＝7)进行校正。对照L6mAb(80μg/ml)得出MFI＜30。这些结果代表四个独立的实验。
L104EA29YIg、L104EIg和CTLA4Ig与人CD80转染的CHO细胞的结合大约相同(图2A)。L104EA29YIg和L104EIg与稳定转染人CD86的CHO细胞的结合比CTLA4Ig更强(图2B)。功能测定通过免疫磁性负选择(Linsley等，(1992)J.Exp.Med.1761595-1604)，分离人CD4阳性T细胞。分离的CD4阳性T细胞在浓度逐渐增加的抑制剂存在下用乙酸肉豆蔻酸佛波醇(PMA)加CD80阳性或CD86阳性CHO细胞刺激。CD4阳性T细胞(8-10×104/孔)在1nM PMA加上或无辐射的CHO细胞刺激物存在下培养。通过在72小时培养的最后7小时期间加入1μCi/孔的[3H]胸苷，测量增殖应答。进行L104EA29YIg和CTLA4Ig对PMA加CD80阳性CHO或CD86阳性CHO刺激的T细胞的抑制。结果示于图3。L104EA29YIg比CTLA4Ig更强地抑制CD80阳性PMA处理的CHO细胞的增殖(图3A)。在抑制CD86阳性PMA处理的CHO细胞增殖方面，L104EA29YIg也比CTLA4Ig更有效(图3B)。因此，L104EA29YIg是更为有效的CD80和CD86介导的T细胞共同刺激的抑制剂。
图4显示了L104EA29YIg和CTLA4Ig对上述制备的经同种刺激并且用表达CD80和CD86的人B类淋巴母细胞细胞系(LCL)(称为PM)进一步同种刺激的人T细胞(T细胞3.0×104/孔，PM8.0×103/孔)的抑制。初次同种刺激进行6天，然后所述细胞用3H-胸苷脉冲处理7小时，然后测定放射性标记的掺入。
二次同种刺激如下进行。在淋巴细胞分离介质(LSM)(ICN，Aurora，OH)上收获7天初次同种刺激的T细胞，并休息24小时。然后，通过按上述相同的比率加入PM，使T细胞在逐渐增加量的CTLA4Ig或L104EA29YIg存在下再次刺激(二次刺激)。刺激进行3天，然后如上所述，所述细胞用放射性标记进行脉冲处理并收获。L104EA29YIg对初次同种刺激的T细胞的影响示于图4A。L104EA29YIg对二次同种刺激的T细胞的影响示于图4B。L104EA29YIg比CTLA4Ig更好地抑制初次和二次T细胞增殖应答。
为了测量细胞因子产生(图5)，建立复份的二次同种刺激平板。3天后，用ELISA试剂盒(Biosource，Camarillo，CA)，用生产商建议的条件分析培养基。发现L104EA29YIg比CTLA4Ig更有效地阻断在二次同种刺激后T细胞的IL-2、IL-4和γ-干扰素细胞因子的产生(图5A-C)。
L104EA29YIg和CTLA4Ig对猴混合淋巴细胞应答(MLR)的影响示于图6。得自两只猴子的外周血单核细胞(PBMC；3.5×104细胞/孔，得自每只猴子)在淋巴细胞分离介质(LSM)上纯化，将其与2μg/ml植物凝集素(PHA)混合。对所述细胞刺激3天，然后用放射性标记脉冲处理16小时，然后收获。L104EA29YIg比CTLA4Ig更好地抑制猴T细胞增殖。表I在下表中给出平衡和表观动力学常数(数值为得自三个不同实验的平均值±标准差)固定化蛋白 被分析物 kon(×105) kon(×10-3)KdM-1S-1S-1nMCD80Ig CTLA4Ig 3.44±0.292.21±0.18 6.51±1.08CD80Ig L104EIg 3.02±0.051.35±0.08 4.47±0.36CD80Ig L104EA29YIg 2.96±0.201.08±0.05 3.66±0.41CD80Ig CTLA4XC120S12.0±1.0 230±10 195±25CD80Ig L104EA29YXC120S8.3±0.26 71±585.0±2.5CD86Ig CTLA4Ig 5.95±0.578.16±0.52 13.9±2.27CD86Ig L104EIg 7.03±0.224.26±0.11 6.06±0.05CD86Ig L104EA29YIg 6.42±0.402.06±0.03 3.21±0.23CD86Ig CTLA4XC120S16.5±0.5 840±55 511±17CD86Ig L104EA29YX120S11.4±1.6 300±10 267±29表II如上文所述，通过SPR测定在所列位点上CTLA4Ig的诱变对CD86Ig结合的效应。主要效应用“+”符号表示。诱变位点 诱变的效应无表观效应“缔合”速率慢/ 配体结合“解离”速率慢 减弱S25 +P26+G27+K28+A29 +T30 +E31 +R33 +K93 +L96 +M97 +Y98 +P99 +P100 +P101 +Y102 +Y103+L104+G105+I106+G107+Q111+Y113+I115+
正如本发明所属领域的技术人员显而易见的，本发明可以具体表现为以上具体公开的形式以外的形式，而不违背本发明的精神或基本特征。因而，以上所述的本发明的具体实施方案应被认为是说明性的，而非限制性的。本发明的范围如所附权利要求书中所述，而不限于以上说明中所包括的实施例。
权利要求
1.一种结合CD80和/或CD86的CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含CTLA4的胞外结构域，使得在所述胞外结构域中，(a)位置+29的丙氨酸被选自酪氨酸、亮氨酸、色氨酸和苏氨酸的一种氨基酸取代，并且(b)位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
2.权利要求1的CTLA4突变体分子，所述突变体分子还包含改变所述可溶性CTLA4突变体分子的溶解性、亲和性或效价的氨基酸序列。
3.权利要求2的CTLA4突变体分子，其中所述氨基酸序列包含人免疫球蛋白的恒定区。
4.权利要求2的CTLA4突变体分子，所述突变体分子还包含允许所述可溶性CTLA4突变体分子分泌的氨基酸序列。
5.权利要求4的CTLA4突变体分子，其中所述氨基酸序列包含制癌蛋白M的信号肽。
6.权利要求1的CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含如图7中所示位置+1的甲硫氨酸和位置+124的天冬氨酸。
7.权利要求1的CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含如图7中所示位置-1的丙氨酸和位置+124的天冬氨酸。
8.权利要求3的CTLA4突变体分子，其中将所述人免疫球蛋白的恒定区突变，以包括如图7中所示用丝氨酸取代的位置+130的半胱氨酸、用丝氨酸取代的位置+136的半胱氨酸、用丝氨酸取代的位置+139的半胱氨酸和用丝氨酸取代的位置+148的脯氨酸。
9.一种以比CTLA4更高的亲和力与CD80和/或CD86结合的可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含CTLA4的胞外结构域，其中在所述胞外结构域中，如图7中所示，位置+29的丙氨酸被酪氨酸取代，且位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
10.权利要求9的CTLA4突变体分子，所述突变体分子还包含改变所述可溶性CTLA4突变体分子的溶解性、亲和性或效价的氨基酸序列。
11.权利要求10的CTLA4突变体分子，其中所述氨基酸序列包含人免疫球蛋白的恒定区。
12.权利要求10的CTLA4突变体分子，所述突变体分子还包含允许所述可溶性CTLA4突变体分子分泌的氨基酸序列。
13.权利要求12的CTLA4突变体分子，其中所述氨基酸序列包含制癌蛋白M的信号肽。
14.权利要求9的CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含如图7中所示位置+1的甲硫氨酸和位置+124的天冬氨酸。
15.权利要求9的CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含如图7中所示位置-1的丙氨酸和位置+124的天冬氨酸。
16.权利要求11的CTLA4突变体分子，其中将所述人免疫球蛋白的恒定区突变，以包括如图7中所示用丝氨酸取代的位置+130的半胱氨酸、用丝氨酸取代的位置+136的半胱氨酸、用丝氨酸取代的位置+139的半胱氨酸和用丝氨酸取代的位置+148的脯氨酸。
17.一种以比CTLA4更高的亲和力与CD80和/或CD86结合的可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含CTLA4的胞外结构域，其中在所述胞外结构域中，如图8中所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
18.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码对应于权利要求1的可溶性CTLA4突变体分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
19.一种核酸分子，所述核酸分子包含编码对应于权利要求9的可溶性CTLA4突变体分子的氨基酸序列的核苷酸序列。
20.权利要求18的核酸分子，所述核酸分子具有始于图7或8所示的核苷酸位置+1的腺嘌呤且终止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
21.权利要求19的核酸分子，所述核酸分子具有始于图7或8中所示核苷酸位置+1的腺嘌呤且终止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
22.权利要求18的核酸分子，所述核酸分子具有始于图7或8中所示的-3的鸟嘌呤且终止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
23.权利要求19的核酸分子，所述核酸分子具有始于图7或8中所示的-3的鸟嘌呤且终止于+1071的腺嘌呤的核苷酸序列。
24.一种载体，所述载体包含权利要求18-23中任一项的核苷酸序列。
25.一种载体，所述载体编码L104EA29YIg，名为pD16L104EA29YIg且以ATCC No.PTA-2104保藏于ATCC。
26.一种在合适宿主细胞中包含权利要求24或25的载体的宿主载体系统。
27.权利要求26的宿主载体系统，其中所述合适的宿主细胞是细菌细胞或真核细胞。
28.一种宿主细胞，所述宿主细胞具有权利要求24或25的载体。
29.权利要求28的宿主细胞，所述宿主细胞是真核细胞。
30.权利要求29的宿主细胞，其中所述真核细胞是COS细胞。
31.权利要求29的宿主细胞，其中所述真核细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
32.权利要求31的宿主细胞，其中所述CHO细胞选自DG44、CHO-K1、CHO-K1 Tet-On细胞系、名为ECACC 85050302的CHO、CHO克隆13、CHO克隆B、CHO-K1/SF和RR-CHOK1。
33.一种生产可溶性CTLA4突变蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求26的宿主载体系统，以在所述宿主细胞中产生所述CTLA4突变蛋白，并且回收如此产生的所述蛋白。
34.一种生产L104EA29YIg的方法，所述方法包括培养权利要求28的宿主细胞，以在所述宿主细胞中产生L104EA29YIg，并且回收如此产生的所述蛋白。
35.一种按照权利要求33的方法生产的可溶性CTLA4突变蛋白。
36.一种按照权利要求34的方法生产的L104EA29YIg。
37.一种调节T细胞与CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞相互作用的方法，所述方法包括使所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞与权利要求1的可溶性CTLA4突变体分子接触，以便形成CTAL4突变体分子/CD80复合体或CTAL4突变体分子/CD86复合体，所述复合体干扰所述T细胞与所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞之间的相互作用。
38.一种调节T细胞与CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞相互作用的方法，所述方法包括使所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞与权利要求9的可溶性CTLA4突变体分子接触，以便形成CTAL4突变体分子/CD80复合体或CTAL4突变体分子/CD86复合体，所述复合体干扰所述T细胞与所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞之间的相互作用。
39.权利要求37的方法，其中所述可溶性CTLA4突变体分子包含CTLA4的胞外结构域，其中在所述胞外结构域中，如图8所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
40.权利要求37的方法，其中使所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞与所述可溶性CTLA4突变体分子的片段或衍生物接触。
41.权利要求38的方法，其中使所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞与所述可溶性CTLA4突变体分子的片段或衍生物接触。
42.权利要求37的方法，其中所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞是抗原呈递细胞。
43.权利要求38的方法，其中所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞是抗原呈递细胞。
44.权利要求37的方法，其中所述CTLA4阳性T细胞与所述CD80阳性细胞和CD86阳性细胞的相互作用被抑制。
45.权利要求38的方法，其中所述CTLA4阳性T细胞与所述CD80阳性细胞和CD86阳性细胞的相互作用被抑制。
46.一种治疗由于T细胞与CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞相互作用而介导的免疫系统疾病的方法，所述方法包括给予受治疗者权利要求1的可溶性CTLA4突变体分子，以调节T细胞与所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞的相互作用。
47.一种治疗由于T细胞与CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞相互作用而介导的免疫系统疾病的方法，所述方法包括给予受治疗者权利要求9的可溶性CTLA4突变体分子，以调节T细胞与所述CD80阳性细胞和/或CD86阳性细胞的相互作用。
48.权利要求46的方法，其中所述可溶性CTLA4突变体分子包含CTLA4的胞外结构域，其中在所述胞外结构域中，如图8所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
49.权利要求46的方法，其中所述T细胞相互作用被抑制。
50.权利要求47的方法，其中所述T细胞相互作用被抑制。
51.一种抑制受治疗者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括给予所述受治疗者权利要求1的可溶性CTLA4突变体分子和一种与IL-4反应的配体。
52.一种抑制受治疗者的移植物抗宿主病的方法，所述方法包括给予所述受治疗者权利要求9的可溶性CTLA4突变体分子和一种与IL-4反应的配体。
53.权利要求51的方法，其中所述可溶性CTLA4突变体包含CTLA4的胞外结构域，其中在所述胞外结构域中，如图8所示，位置+104的亮氨酸被谷氨酸取代。
54.一种可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子由名为ATCC No.PTA-2104的核酸分子编码。
55.一种编码L104EA29YIg且具有ATCC No.PTA-2104的DNA序列。
56.一种可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子包含图7的氨基酸序列。
57.一种核酸分子，所述核酸分子编码权利要求56的可溶性CTLA4突变体分子。
58.一种可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子以高于野生型CTLA4的亲和力结合CD86。
59.一种可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子与CD80和/或CD86结合的解离速率比野生型CTLA4慢。
60.一种可溶性CTLA4突变体分子，所述突变体分子与CD80和/或CD86结合的缔合速率和解离速率比野生型CTLA4慢。
61.一种由名为ATCC No.PTA-2104的核酸分子编码的可溶性CTLA4突变体分子的部分，其中所述部分包含所述突变型CTLA4的胞外结构域。
62.权利要求61的可溶性CTLA4突变体分子的部分，所述部分还包含一个Ig尾。
63.一种编码可溶性CTLA4突变体分子且具有ATCC No.PTA-2104的核酸分子的部分，其中所述部分编码所述突变型CTLA4分子的胞外结构域。
64.权利要求63的核酸分子的部分，所述部分还包含编码Ig尾的核酸分子。
65.一种用于治疗免疫系统疾病的药用组合物，所述药用组合物包含一种药学上可接受的载体和权利要求1的可溶性CTLA4突变体分子。
66.一种用于治疗免疫系统疾病的药用组合物，所述药用组合物包含一种药学上可接受的载体和权利要求9的可溶性CTLA4突变体分子。
全文摘要
本发明提供与CD80和/或CD86抗原结合的亲和力高于野生型CTLA4或非突变型CTLA4Ig的可溶性CTLA4突变体分子。所述可溶性CTLA4分子具有一个包含CTLA4胞外结构域的第一氨基酸序列，其中S25－R33区和M97－G107区内的某些氨基酸残基被突变。本发明的突变体分子也可以包括增强所述突变体分子溶解性的第二氨基酸序列。
文档编号C12N15/09GK1441810SQ01810145
公开日2003年9月10日 申请日期2001年5月23日 优先权日2000年5月26日
发明者R·J·皮奇, J·R·奈穆拉, P·S·林斯利, J·巴约拉斯 申请人:布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司