稳定高表达os-9的细胞株的构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物技术领域，具体而言，涉及一种稳定高表达OS-9的细胞株的 构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肠粘膜屏障是机体防御的重要屏障，可防止肠腔内致病性抗原（细菌、有毒物质、 食物抗原物质、致癌物质等）侵入，使机体内环境保持相对稳定，维持机体的正常生命活 动。
[0003] 肠上皮细胞间的紧密连接蛋白是构成肠粘膜屏障的重要组成部分。一旦紧密连接 蛋白受到破坏，肠上皮细胞间通透性便增加，细菌、内毒素和大分子物质就可通过紧密连 接蛋白进入体循环，参与多种疾病的发生发展。
[0004] 大量研宄表明在烧伤、创伤、大型手术等外科应激条件下，会引起肠道的急性缺 氧，从而导致肠粘膜屏障功能障碍，造成肠源性感染，进一步加重原发疾病，诱发全身炎症 反应综合征，导致多脏器功能衰竭，甚至危及生命。
[0005] 骨肉瘤蛋白（os-9)是在人体组织广泛表达的一种蛋白，但其功能尚不完全明确。 目前对os-9的研宄主要集中于它从内质网向高尔基体转运一些膜蛋白，以及在缺氧条件 下调节缺氧诱导因子。然而〇s-9在表达的过程中，其可能会伴随着一系列的刺激和诱导作 用，并促使一些未知蛋白（包括一些对机体防御功能有利的蛋白）表达量提高；因此通过研 宄〇s-9的表达状态，进一步地探宄其对其他对机体防御功能具有帮助的功能性蛋白的表 达情况为人们对疾病治疗和防御开辟了新的路径。
[0006] 然而，目前还未见有通过os-9过表达探宄肠粘膜屏障保护作用的相关报道，因此 提供一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法并进行应用是人们亟需解决的一个技术问 题。
[0007] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0008] 本发明的第一目的在于提供一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，该方法 实现了高表达OS-9的细胞株的构建，为通过研宄OS-9高表达探宄对机体防御功能具有帮 助的功能性蛋白的表达情况提供了实验材料。
[0009] 本发明的第二目的在于提供上述的表达OS-9的细胞株的构建方法构建成的细胞 株的用途。
[0010] 为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
[0011] 一种稳定高表达os-9的细胞株的构建方法，包括将plenti6. 3载体和OS-9基因 连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得Plenti6. 3-OS-9质 粒；以所述plenti6. 3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2 细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
[0012] 该方法构建的细胞株，其能够实现OS-9的过表达，进而为在研宄OS-9过表达过程 中，其他功能蛋白表达状态提供了良好的实验材料，而且该细胞株表达OS-9稳定，可很好 地用于定量和定性检测OS-9高表达状态下相关蛋白的表达状态；此外，该构建方法由于载 体、供体细胞以及宿主细胞等选择合理，进而使得稳定高表达OS-9的细胞株易于获得，且 获得的细胞株性能稳定，易于贮存。
[0013] 可选的，该构建方法具体包括以下步骤：
[0014] 1)、提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到CDNA;
[0015] 2)、以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
[0016] 3)、将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6. 3载体进行连接，并导入DH5a感受 态细胞中进行转化，得到转化后DH5a;
[0017] 4)、对转化后DH5a进行质粒提取，获得Plenti6. 3-OS-9质粒；
[0018] 5)、以所述plenti6. 3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感 染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
[0019] 可选的，在步骤2)中，所述PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下 游扩增引物以及中间缺失拼接引物；
[0020] 其中，所述上游引物的序列如SEQIDNO: 1-SEQIDNO:2所示；所述下游扩增引 物如SEQIDNO:3-SEQIDNO:4所示；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQIDNO:5-SEQ IDNO:12 所示。
[0021] 通过特定序列的引物，以实现不同位置OS-9基因片段的扩增，上述所举几种引 物，由于酶切位点设置合理，同时序列选择得当，非常便于全长0S-9序列的扩增以及后续 连接反应的顺利进行。
[0022] 可选的，在步骤2)中，所述PCR扩增具体包括如下步骤：
[0023] 以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增， 获得3个扩增产物；
[0024] 以3个扩增产物为模板，以如SEQIDNO:1和如SEQIDNO:4所示序列为引物，进 行扩增。
[0025] 以不同的引物，通过扩增获得不同的目的片段，具体的，引物SEQIDN0:1和SEQ IDNO:2扩增上游1. 6kb目的片段（退火温度选择60°C);引物SEQIDNO:3和SEQID NO:4扩增下游260bp片段（退火温度选择50°C);引物SEQIDNO:5-SEQIDNO:12基因 拼接中间缺失的165bp片段（退火温度55°C)。
[0026] 然后以上面三个PCR产物做模板，用引物SEQIDNO: 1和如SEQIDNO:4,扩增全 长0S-9,目的片段2k。该方式可快速有效地获得全长0S-9基因。
[0027] 可选的，在步骤3)中，所述酶切反应的体系为：PacI0. 8-1. 2y1，Pmel 0? 8-1. 2y1，lOXbuffer1. 8-2. 2y1，0S-9 基因 1. 8-2. 2yg，ddH20 补至 20y1〇
[0028] 在上述的酶切反应体系中，由于反应体系设置合理，因此可以实现顺利酶切效果， 从而便于后续与plenti6. 3载体顺利连接。
[0029] 可选的，在步骤3)中，所述连接的过程中采用T4DNA连接酶，且反应温度为 15-17。。。
[0030] 在该温度下，T4DNA连接酶具有较好的连接效果，可以实现大量的0S-9基因与 plenti6. 3载体连接。
[0031] 可选的，在步骤5)中，具体包括：
[0032] a)、将plenti6. 3-OS-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6. 3-OS-9质 粒；
[0033]b)、将所述稀释后plenti6. 3-OS-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25 分钟，得到DNA与转染试剂复合物；
[0034]c)、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38°C、4-6%的 C02的条件下分段培养90-100小时后，呙心，过滤，得到病毒液；
[0035]d)、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加 入杀稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高 表达OS-9的细胞株。
[0036] 可选的，在步骤c)中，所述离心的转速为2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟； 所述过滤的过程中，滤径为0. 4-0. 5微米。
[0037] 所述的构建方法在制备降低对肠粘膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连 接蛋白表达量的药物中的应用。
[0038] 所述的构建方法通过提高claudin-1和occludin表达量，增强肠粘膜屏障功能中 的应用。
[0039] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0040] (1)、通过本发明的构建方法构建的高表达0S-9的细胞株，其生化性能稳定，能够 实现0S-9过表达，极大的方便了在研宄0S-9过表达的状态下，其他功能性蛋白的表达情 况，为0S-9过表达与其他功能性蛋白表达的关系的相关研宄提供了理想的实验材料。
[0041](2)、该高表达0S-9的细胞株，可通过westernblot、免疫焚光等操作进行相关蛋 白的定量和定性。
[0042](3)、该构建方法在获取全长0S-9基因的过程中，对于引物进行特定的选择，而且 在PCR的过程中，用不同的引物扩增，获取不同目的片段，然后再以所获的目的片段为模板 再次扩增，非常利于全长0S-9基因的获取。
[0043] (4)、该细胞株在高表达0S-9的过程中，其可明显提高紧密连接蛋白（claudin-1 和occludin)的表达量，而且还可降低对肠粘膜通透性的破坏，因此用于制备降低对肠粘 膜通透性破坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中，以预防和治疗肠粘膜 疾病。
【附图说明】
[0044] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0045] 图1为本发明应用例1中0S-9过表达细胞株在正常条件和缺氧条件对紧密连接 蛋白claudin-1和occludin的蛋白表达图。
[0046] 其中，A为western blot实验结果，B图为western blot结果的定量统计分析；
[0047] 图2为本发明应用例2中，免疫荧光实验结果显示0S-9过表达对紧密连接蛋白的 上调的结果图；
[0048] 图3为本发明提供的高表达OS-9的细胞株与肠上皮细胞跨上皮电阻检测肠粘膜 屏障通透性关系检测结果图；
[0049] 图4为本发明实施例5提供的高表达OS-9的细胞株的倒置荧光显微镜观测以及 os-9表达结果图。
【具体实施方式】
[0050] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会 理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为 可以通过市售购买获得的常规产品。
[0051] 本发明提供了一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，包括：将plenti6. 3 载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得 plenti6. 3-OS-9质粒；以所述plenti6. 3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述 病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞 株。
[0052] 该方法构建的细胞株，其能够实现OS-9的过表达，进而为在研宄OS-9过表达过程 中，其他功能蛋白表达状态提供了良好的实验材料，而且该细胞株表达OS-9稳定，可很好 地用于定量和定性检测OS-9高表达状态下相关蛋白的表达状态；此外，该构建方法由于载 体、供体细胞以及宿主细胞等选择合理，进而使得获得稳定高表达OS-9的细胞株的过程易 于实现，而且获得的细胞株性能稳定，易于贮存。
[0053] 接下来，结合以上的内容，对本发明的稳定高表达OS-9的细胞株构建方法举出以 下具体的实施例。
[0054] 实施例1
[0055] SI1 :提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA;
[0056] S12 :以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
[0057] PCR扩增的过程中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼 接引物；
[0058] 其中，所述上游引物的序列如SEQIDNO: 1-SEQIDNO:2所示；所述下游扩增引 物SEQIDN0:3-SEQIDN0:4所述；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQIDN0:5-SEQID NO: 12所示。
[0059] 另外，在扩增的过程中，以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺 失拼接引物进行扩增，获得3个扩增产物；
[0060] 以3个扩增产物为模板，以如SEQIDNO:1和如SEQIDNO:4所示序列为引物，进 行扩增。
[0061] S13 :将所述全长0S-9基因酶切后与plenti6. 3载体进行连接，并导入DH5a感受 态细胞中进行转化，得到转化后DH