5a;
[0062] 所述酶切反应的体系为：PacI0? 8-1. 2y1，Pmel0? 8-1. 2y1，lOXbuffer 1.8-2. 2yl，OS-9基因1.8-2. 2yg，ddH20补至20yl;另外，在连接的过程中采用T4DNA 连接酶，且反应温度为15-17°C。
[0063]S14:对转化后DH5a进行质粒提取，获得plenti6. 3-OS-9质粒；
[0064] S15 :以所述plenti6. 3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感 染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
[0065] 具体的，该步骤包括以下操作：
[0066]a)、将plenti6. 3-OS-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6. 3-OS-9质 粒；
[0067]b)、将所述稀释后plenti6. 3-OS-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25 分钟，得到DNA与转染试剂复合物；
[0068]c)、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38°C、4-6%的 C02的条件下分段培养90-100小时后，呙心，过滤，得到病毒液；
[0069] 所述离心的转速为2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟；过滤的过程中，滤径 为0.4-0. 5微米。
[0070] d)、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加 入杀稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高 表达OS-9的细胞株。
[0071] 实施例2
[0072]S21:提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA;
[0073] 在该步骤中，对于Caco-2细胞的传代培养具体包括：
[0074] 人结肠癌上皮Caco-2细胞株购自中国科学院细胞库；Caco-2细胞完全培养基配 制：20%胎牛血清，1 %非必需氨基酸，1 %双抗，MEM培养基为母液；Caco-2细胞培养条件： 37°C，5 %C02，饱和湿度，培养4-6天；待细胞融合约80%时，将细胞用无菌PBS洗涤3次， 加入含0. 25%EDTA的胰酶进行消化，显微镜下观察，待细胞变圆，部分脱落时，立即加入含 有血清的培养基终止消化；用滴管反复吹打细胞悬液几次，将细胞悬液转移至无菌离心管， 放入离心机，1000转/分钟，离心5分钟；离心完毕，倒去上清液，加入无菌的Hanks缓冲液， 用滴管再次吹打均匀，然后1000转/分钟，离心5分钟；离心完毕，倒去上清液，加入完全培 养基吹打均匀，按1:3传代分瓶，置于细胞培养箱培养。
[0075] 对于Caco-2细胞mRNA的提取操作包括：
[0076] 倒去细胞培养基，用PBS洗涤两次。按每10cm2生长细胞加入1mlTrizol裂解液， 用移液枪吹打细胞使其脱落。将裂解液转移至离心管中，室温静置5分钟。加入l/5Trizol 量的氯仿，振荡混匀。室温静置5分钟。12000g，4°C，离心15分钟。将上清液小心转入一 新的去酶离心管中，加入与上清液等体积的异丙醇。室温静置10分钟。12000g，4°C，离心 10分钟。小心倒去上清，向沉淀中缓慢加入lml75%的乙醇。12000g，4°C，离心5分钟。倒 去上清，保留沉淀，室温晾干2-5分钟。加入30-100y1适量DEPC水溶解沉淀，测定浓度， 置于冰上，备用。
[0077] 逆转录的操作具体包括：
[0078] 使用逆转录试剂盒（Takara)将mRNA逆转录为cDNA。按以下成分于冰上配制反应 混合液：
[0079]5XgDNA Eraser Buffer2til? gDNA Eraser lul? Total RNA 2ul? RNase Free ddH20 5 u 1〇
[0080] 将混合液简短离心后，42°C，反应2分钟；再按以下成分继续于冰上配制反应混合 液。
[0081]上述反应混合液10 y 1，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 y 1，RT Primer Mix*4 1 y 1,5XPrimeScript Buffer 2 4yl,RNase Free ddH20 4 yl〇
[0082] 将混合液简短离心后，37°C，15分钟，然后迅速于85°C反应5秒，再置于冰上。将 获得的Caco-2细胞cDNA作为模板，继续以下步骤。
[0083] S22 :以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因；
[0084] 在该步骤中，在PCR扩增的过程中，对于引物的设计和选择按以下操作进行：
[0085] 从GenBank资料库中获得人OS-9的mRNA序列（NM_001017956)，设计带有酶切位 点PacI和Pmel的基因引物：
[0086] PacI-0S9-upF:agtcTTAATTAAACCATGGCGGCGGAAACGCTGCTG；
[0087] Br-0S9-upR:ATCCTCCTCTGTAGGTTGGGGTGATGGGGGAGG；
[0088] Os9-Fl:ccatcaccccaacctacagaggaggatcctgagcacagag ；
[0089] Os9-Rl:GCTTGGTGACCCGGACCCGGACTCTGTGCTCAGGATCCTC ；
[0090] Os9~F2:gggtccgggtcaccaagctccgtctcggaggccctaatca ；
[0091] Os9-R2:ATCTCGAGGACAGTCAGATCCTGATTAGGGCCTCCGAGAC ；
[0092] Os9_F3:gatctgactgtcctcgagatgaaacgggaaaacccacagctgaaacaaatcgaggg ;
[0093] Os9-R3:CCAGCAGCTCCTTCACCAGCCCCTCGATTTGTTTCAGCTG ；
[0094] 0s9~F4:ctggtgaaggagctgctggagagggagggactcacagctg ；
[0095] 0s9-R4:ATTTTGATCTCAATTTTCCCTGCAGCTGTGAGTCCCTCCC ；
[0096] Br-0S9-downF:acagctgcagGGAAAATTGAGATCAAAATTGTCC ；
[0097] PmeI-0S9-downR:gtcaGTTTAAACTCAGAAGTCAAATTCGTCCAGG〇
[0098]引物设计和合成由上海天晶生物技术有限公司协助完成。
[0099]使用PCR试剂盒（Takara)按以下成分于冰上配制反应体系：
[0100] PremiX Taq 10 yl, cDNAO. 5yl, Forward Primer 0. 5yl, Reverse Primer 0. 5 y 1，RNase Free ddH20 8. 5 y 1。
[0101] 将上述反应液简短离心后，按以下表1所示条件进行PCR扩增：
[0102] 表1 PCR扩增过程中反应条件
[0103]
【主权项】
1. 一种稳定高表达os-9的细胞株的构建方法，其特征在于，包括：将plenti6. 3载 体和0S-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得 plenti6. 3-0S-9质粒；以所述plenti6. 3-0S-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述 病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达0S-9的细胞 株。
2. 根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，具体包括以下步骤： 1) 、提取传代培养后Caco-2细胞的mRNA，并进行逆转录，得到cDNA ; 2) 、以所述cDNA为模板，进行PCR扩增、电泳以及切胶回收，得到全长OS-9基因； 3) 、将所述全长OS-9基因酶切后与plenti6. 3载体进行连接，并导入DH5 α感受态细 胞中进行转化，得到转化后DH5 α ; 4) 、对转化后DH5 α进行质粒提取，获得Plenti6. 3-OS-9质粒； 5) 、以所述plenti6. 3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染 Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。
3. 根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增的过程 中，所用的引物包括上游扩增引物、下游扩增引物以及中间缺失拼接引物； 其中，所述上游引物的序列如SEQ ID NOd-SEQ ID NO :2所示；所述下游扩增引物如 SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:4所示；所述中间缺失拼接引物的序列如SEQ ID N0:5-SEQ ID NO :12所示。
4. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在步骤2)中，所述PCR扩增具体包括 如下步骤： 以所述cDNA为模板，分别以上游引物、下游引物和中间缺失拼接引物进行扩增，获得3 个扩增产物； 以3个扩增产物为模板，以如SEQ ID NO: 1和如SEQ ID NO :4所示序列为引物，进行扩 增。
5. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在步骤3)中，所述酶切反应的体系 为：PacI 0.8-1. 2 μ 1，PmeI 0.8-1. 2 μ 1，10Xbuffer 1.8-2. 2 μ l，0S-9 基因 1.8-2. 2 μ g， ddH20 补至 20 μ 1。
6. 根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，在步骤3)中，所述连接的过程中采用 T4DNA连接酶，且反应温度为15-17°C。
7. 根据权利要求2-6任一项所述的构建方法，其特征在于，在步骤5)中，具体包括： a) 、将plenti6. 3-0S-9质粒和包装质粒等量混合，得到稀释后plenti6. 3-0S-9质粒； b) 、将所述稀释后plenti6. 3-0S-9质粒与转染试剂Lipo2000混合后孵育15-25分钟， 得到DNA与转染试剂复合物； c) 、将所述DNA与转染试剂复合物滴加到293T细胞培养液中，于36-38°C、4-6%的CO2的条件下分段培养90-100小时后，尚心，过滤，得到病毒液； d) 、将所述病毒液接种于含有Caco-2细胞的培养液中进行培养，并在培养液中加入杀 稻瘟菌素，每隔两天换液一次，并加入新的杀稻瘟菌素，持续培养10-15天获得稳定高表达 0S-9的细胞株。
8. 根据权利要求7所述的构建方法，其特征在于，在步骤c)中，所述离心的转速为 2800-3200转/分钟，时间为10-20分钟；所述过滤的过程中，滤径为0. 4-0. 5微米。
9. 权利要求1-8任一项所述的构建方法获得的细胞株在制备降低对肠粘膜通透性破 坏或提高肠上皮细胞中的紧密连接蛋白表达量的药物中的应用。
10. 权利要求1-8任一项所述的构建方法获得的细胞株在通过提高claudin-1和 occludin表达量，增强肠粘膜屏障功能中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种稳定高表达OS-9的细胞株的构建方法，属于分子生物技术领域。该方法包括将plenti6.3载体和OS-9基因连接，并转化感受态大肠杆菌；将转后的大肠杆菌进行质粒提取，获得plenti6.3-OS-9质粒；以所述plenti6.3-OS-9质粒转染293T细胞，收获病毒液，并以所述病毒液感染Caco-2细胞后筛选出阳性克隆，培养10-15天后，获得稳定高表达OS-9的细胞株。该细胞株，方便了在研究OS-9过表达的状态下，其他功能性蛋白的表达情况，为OS-9过表达与其他功能性蛋白表达关系的研究提供了材料。可通过western blot、免疫荧光等操作进行相关蛋白的定量和定性。
【IPC分类】C12N15-85, C12N5-10
【公开号】CN104830778
【申请号】CN201510205030
【发明人】孙力华, 杨桦, 肖卫东, 王文生
【申请人】孙力华
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月27日