专利名称：一种细胞dna文库及其构建方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种细胞DNA文库的构建方法以及由该方法制备得到的细胞DNA文库。
背景技术：
表观遗传学是基于非基因序列改变所引起的基因表达水平的变化，组蛋白修饰 (Histone modification)和DNA甲基化(DNA methylation)是表观遗传的两种主要形式。 组蛋白是染色体基本结构单位，其末端可发生多种修饰作用从而引起染色体结构的改变， 并调节相关基因的表达。DNA甲基化则是在不改变DNA序列的情况下，通过被修饰碱基介导的DNA空间结构的变化，引起相关基因的沉默或表达。组蛋白修饰与DNA甲基化修饰在生物体发育过程中共同发挥调节作用，并通过拮抗或协同等多种方式相互联系，形成表观遗传作用网络。通过组蛋白化学修饰的形式来确定特定的基因组区域在特定时间的表达情况及其它功能的调节方式称为组蛋白密码(Jenuwein Tand Allis C,Translating the histone code. Science, 2001,293 :1074 ；Cosgrove Mand Wolberger C, How does the histone code work ？ Biochemistry and CellBiology，2005，83 :468-476.)。对组蛋白密码的深入研究有助于了解组蛋白修饰模式对染色体结构及基因表达的调控。组蛋白修饰生物学定义为在不同催化酶的作用下，如组蛋白甲基化酶、组蛋白乙酰化酶等在组蛋白的N-末端或C-末端添加不同的化学基团的过程。组蛋白的修饰作用是可逆的，主要包括甲基化(methylation)、乙酰化(acetylation)、泛素化 (ubiquitination)、磷酸化(phosphorylation)等四种修饰方式(Strahl B and Allis C, The language of covalent histone modifications. Nature, 2000,403 :41-45.)四禾中修饰作用中，以甲基化和乙酰化修饰研究最为广泛与深入。泛素化修饰主要发生在组蛋白 H2A、H2B的赖氨酸残基上，包括单泛素化(monoubiquitous)和多泛素化(ployubiquitous) 两种形式，在细胞周期中起到重要的调节作用，并且与组蛋白甲基化修饰密切相关(Shukla A, Chaurasia P and Bhaumik SR, Histone methylation and ubiquitination with theircross-talk and roles in gene expression and stability. Cell Mol Life Sci, 2009,66 :1419-1433 ；Agus D,Matthew C and Matthew S,A modified cross talkbetween histone H2BK123 ubquitination and H3K79 methylation. JBC，2010.)。磷酸化修饰主要发生在组蛋白的丝氨酸Ger)残基上，在干细胞分化过程中起调节作用。甲基化和乙酰化修饰主要发生在组蛋白H3、H4的赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)残基上。其中甲基化修饰又包括单甲基化(monomethylation)、双甲基化(dimethylation)和三甲基化 (trimethylation)三种形式，主要起到相关基因表达的激活或抑制作用(Rice JC and Allis CD, Histone methylationversus histone acetylation :new insights into epigenetic regulation.Curr Opin CellBiol, 2001,13 :263-273)。组蛋白修饰与DNA甲基化对染色质稳定性及基因表达模式均起到至关重要的调节作用，两者的调节作用并不是孤立的，而是通过DNA甲基化酶与组蛋白修饰相关酶类，以及众多蛋白因子之间的相互作用而发生联系的。通常情况下DNA甲基化是在DNA甲基化酶 (DNA methyltransferase，DWT)的催化下，以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-methionine， SAM)为甲基供体，将甲基基团(-CH3)添加到DNA分子特定碱基上的过程。真核生物中DNA 甲基化发生于5’ -CpG-3’中胞嘧啶的第五位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶。人类基因组中，70% 80%的CpG双核苷酸处于DNA甲基化状态，未甲基化的CpG —般聚集成簇，形成 CpG岛。CpG岛一般位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，约有60%以上基因的启动子含有CpG岛。活性基因启动子区域CpG岛是未甲基化的，但在特定的情况下也会发生甲基化作用，进而导致基因的沉默，而去甲基化则可恢复基因表达。DNA甲基化对维持染色体结构、X染色体失活、基因印记都起重要作用(Jones P and Takai D，The role of DNA methylation in mammalian 印igenetics. Science，2001，293 :1068)，合适的DNA 甲基化水平和甲基化位点对于细胞的正常发育、分化是必须的。与正常体细胞相比，在肿瘤细胞中， DNA甲基化水平显著降低，肿瘤细胞基因组甲基化的程度与正常细胞相比仅为20-60%，低水平的DNA甲基化导致基因组的不稳定，多种致癌相关基因由表达抑制状态转变为活性表达或过量表达状态，同时伴随局部区域的高甲基化，包括肿瘤抑制相关基因、细胞周期调节基因、DNA修复基因等，造成抑癌基因表达的丢失，最终导致癌症的发生(Baylin S, DNA methylation and gene silencing in cancer. Nature Clinical Practice Oncology, 2005,2 :S4-S11 ；De Marzo A, Marchi V, YangE, et al. , Abnormal regulation of DNA methyltransferase expression duringcolorectal careinogenesis. Caneer research, 1999,59 :3855.)。 组蛋白修饰与DNA甲基化相互联系，在染色体变构、干细胞分化、体细胞重编程， 癌症发生等过程中发挥重要调控(cedar h and dergman y, LinkingDNA methylation and histone modification. Nuture review, 2009,10 :295-304) 如组蛋白 H3 第 4 位的赖氨酸(!KM)的甲基化修饰与基因活性表达相关，并对DNA甲基化有拮抗作用。H3K4的甲基化通过阻扰DNA甲基化酶(DNMT)的结合阻止DNA甲基化，从而促进相关基因的高水平表达(BarskiA, Cuddapah S, Cui K, et al. , High-resolution profiling of histone methylations inthe human genome. Cell, 2007，129 :823-837)。而组蛋白 H3第 9位赖氨酸 (H3K9)的甲基化却可以吸引DNA甲基化酶的结合，从而与DNA甲基化发生协同作用，抑制相关基因的表达(Rosenfeld JA, Wang Z, Schones DE, et al. , Determination of enriched histone modifications in non-genic portions of thehuman genome. BMC Genomics, 2009,10 :143.)。活性表达基因一般是未甲基化的，但在内环境改变或外界因素刺激情况下，基因启动子区域的CpG岛可以发生甲基化，并引起组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的结合， 从而发生组蛋白的去乙酰化，进一步引起基因编码区的甲基化，引起染色质的高度折叠，最终形成异染色质，导致基因永久性沉默(Baylin S，DNA methylation and genesilencing in cancer. Nature Clinical Practice Oncology，2005，2 :S4_S11)。在胚胎发育过程中， 多能干细胞通过关闭某些基因进而分化成为体细胞，表达基因的关闭即是由组蛋白修饰和DNA甲基化，以及相关蛋白因子共同作用导致和维持的(Meissner A，Mikkelsen T，Gu H, et al. , Genome-scale DNAmethylation maps of pluripotent and differentiated cells. Nature, 2008,454 :766-770)。因此，深入了解细胞分化过程中的组蛋白修饰模式与DNA甲基化修饰途径后，通过向体细胞中添加特殊诱导因子anduction factor)，改变细胞内组蛋白修饰模式和去除DNA甲基化，可以使体细胞发生重编程，重新形成全能或多能干细胞(Takahashi K and Yamanaka S, Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures bydefined factors. Cell,2006,126 663-676 ；Maherali N,Sridharan R,Xie W,et al·,Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling andwidespread tissue contribution. Cell Stem Cell,2007,1 :55-70.)。人工诱导多功能干细胞(Induced Pluripotent Stem cells iPS) 在疾病治疗，尤其是癌症治疗方面具有重要意义。 鉴于组蛋白修饰与DNA甲基化在胚胎发育，个体发育，疾病发生过程中的重要作用，尤其是将组蛋白修饰与DNA甲基化相联系，在基因组水平上构建生物的表观遗传调控网络对于人类的疾病研究具有十分重要的意义。因此相关检测技术的发展在一定程度上左右了研究者对表观遗传的相关研究。研究蛋白质和DNA作用的传统方法有凝胶阻滞技术， DNase I足迹法，以及染色质免疫沉淀的方法。凝胶阻滞技术(Electrophoretic Mobility ShiftAssay, EMSA)是研究蛋白质-DNA的经典方法，可以对目标蛋白进行定性和定量分析 (Hellman L and Fried Μ,Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols, 2007, 2 :1849-1861.)。该技术的原理是蛋白质-DNA复合体的电泳迁移率受到蛋白质大小、电荷等因素影响，将显著低于游离DNA，在凝胶电泳过程中条带相对滞后。EMSA实验通常是将纯化的蛋白或细胞粗提液和32P同位素标记的DNA探针一同孵育，反应产物在非变性的聚丙烯凝胶上进行电泳， 蛋白质-DNA复合物由于较慢的迁移率形成滞后的条带。凝胶阻滞技术简单易行，并且放射性同位素标记可以保证实验的高灵敏度，仅需要少量蛋白和DNA即可以完成实验。随着技术的发展以及不同的实验需求，凝胶阻滞实验进行了相应的改进，可采用荧光、化学发光或免疫组化等检测手段，避免同位素对环境身体有害的缺点。但凝胶阻滞实验也存在局限性，最主要的是影响蛋白质-DNA复合体迁移率的因素较多，并且根据实验结果无法直接得到DNA的包括位置和序列的相关信息。DNase I足迹法的基本原理是用DNase I对末端标记的待测DNA酶切，使在DNA上形成随机切口，而与蛋白质结合的DNA由于空间阻隔，受到蛋白质的保护，不会受到DNase I酶切，因此产物中未被酶切的DNA片段分离纯化后，进行电泳和放射自显影，可与对照组相比得到足迹部位的核苷酸序列(Res N, Biol P， Biotechnol N, et al.,1.GalasDJ, Schmitz A :DNAse footprinting :a simple method for the detection ofprotein-DNA binding specificity. Journal of Computer and System Sciences，2002，65 :73-96)。DNase I足迹实验能够粗略定位目标蛋白结合的DNA 并得到其碱基序列，提供大量的有效信息，但对蛋白质的纯度和量要求较高。以上两种方法均为基于体外的蛋白质-DNA研究方法，其局限性是不能充分反映生理情况下DNA与蛋白相互作用的真实情况，而且很难捕捉到在染色质水平上基因表达调控的动态瞬时反应。 而ChIP (Chromatin Immunoprecipitation，染色质免疫沉淀)是一种直接反映细胞内蛋白和DNA相互作用的重要技术，在组蛋白修饰以及转录因子研究中应用十分广泛(Im H， Grass J, Johnson K, et al. , Measurement of protein—DNA interactions in vivo by chromatinimmunoprecipitation. METHODS IN MOLECULAR BI0L0GY-CLIFT0NTHEN T0T0WA-, 2004，284 :129-146)。该技术是在活细胞状态下，采用甲醛固定蛋白质和DNA的结合，然后通过超声波打断得到理想大小的染色质片段后，再与特异性抗体进行抗体与目标蛋白的结合反应，从而获得与目标蛋白结合的DNA进行后续研究。广泛使用的ChIP方法还可以通过MNase I的特异性酶切获得单核小体并通过特异的抗体富集与目标蛋白结合的DNA片段，进而分析目标蛋白和DNA相互作用关系。ChIP技术可以充分反映生理状态下DNA与蛋白质作用的真实情况，是目前用于研究蛋白质-DNA相互作用常用的方法。ChIP实验可以记录活细胞状态下蛋白质和DNA的相互作用，甚至能够捕捉到发生在染色体水平上基因表达调控的瞬时事件。免疫沉淀中使用的特异性的抗体能够精确的富集所研究的靶蛋白-DNA复合体。ChIP可以与生物芯片技术以及新一代测序技术结合，高通量的筛选与目标蛋白结合的DNA在基因组上的分布。在ChIP基础上发展起来的ChIP on chip技术是 ChIP和芯片相结合的技术，可高通量的分析活体细胞中蛋白质和基因组DNA之间的相互作用(Kuras L, Characterization of protein-DNAassociation in vivo by chromatin immunoprecipitation. METHODS I匪OLECULAR BIOLOGY-CLIFTON THEN T0T0WA，2004，284 : 147-162)。ChIP on chip的核心流程是染色体DNA进行ChIP实验富集，紧接着与标记好的芯片杂交，从芯片数据的分析得到与目标蛋白结合的DNA序列信息。ChIP on chip尽管能获得高分辨率的基因组图谱，并可以确定与研究对象(如组蛋白或转录因子)相互作用的 DNA序列信息，但芯片价值不菲，导致ChIPon chip技术成本昂贵，除此之外，海量的数据分析也是一个挑战。 随着DNA甲基化研究的深入，检测DNA甲基化的方法也不断涌现。其中一种常见的方法是基于甲基化敏感的限制性内切酶，该方法依赖于特定限制性内切酶对甲基化位点的敏感，对甲基化区域不切割的特性，将DNA切割成大小不一的片度， 进一步通过二维电泳或者PCR技术分析。该技术包括甲基化敏感的限制性指纹技术 (MethyIation-sensitive restriction fingerprinting，MSRF)(Huang T，Laux D，Hamlin B，et al.，Identification of DNA methylationmarkers for human breast carcinomas using the methylation-sensitive restrictionfingerprinting technique. Cancer research，1997，57 :1030.)、限制性标记基因组扫描技术(Restriction landmark genomic scanning，RLGS) (Costello J，FriihwaIdM, Smiraglia D，et al.，Aberrant CpG-island methylation has non-random andtumour-type-specific patterns. Nature genetics， 2000，24:132-138.)、甲基化间区位点扩增技术(Amplification of intermethylated sites，AIMS)(Frigola J，Ribas M，Risques R，et al.，Methylome profiling of cancer cells by amplification ofinter-methylated sites (AIMS). Nucleic Acids Research， 2002,30 :e28)0依赖于限制性酶切的甲基化检测技术虽然成本低廉，并可以检测到全基因组所有的CpG岛的甲基化情况，但由于限制性内切酶本身的限制，可能会出现某些位点被遗漏或者不完全消化导致出现假阳性，除此之外，由于试验方法和仪器设备的限制，基于酶切的限制性内切酶的分析方法不能够进行高通量的样本分析。另外一种甲基化检测方法基于亚硫酸氢盐对甲基化和非甲基化胞嘧啶的不同作用，在亚硫酸氢盐的作用下，甲基化修饰的胞嘧啶保持不变，而非甲基化修饰的胞嘧啶将发生脱氨基作用，转变成尿嘧啶(U)。因此，利用亚硫酸氢盐处理的反转碱基的作用，可以检测到每个CpG位点的甲基化状态，精确勾画出某个基因或全基因组的甲基化全貌。传统的亚硫酸氢盐转化直接测序((Bisulfite sequencing)的方法随着测序技术的改进，与新一代测序技术结合，可快速准确的得出大量的有效数据(Frommer M, McDonald L, MillarD, et al.，A genomic sequencing protocolthat yields a positive display of5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proceedings of the NationalAcademy of Sciences of the United States of America, 1992,89 :1827)。传统甲基化检测方法和芯片技术的结合解决了通量问题。这种技术基于寡核苷酸微阵列杂交，可以在基因组中寻找甲基化位点，包括用于全基因组甲基化水平检测的差异化杂交(Differential methylation hybridization usingCGI array, DMH) (Huang Τ, Perry M and Laux D, Methylation profiling of CpGislands in human breast cancer cells. Human molecular genetics, 1999,8 :459.),差异化杂交的芯片是CpG岛微阵列，是依赖于甲基化敏感性限制性酶切和PCR技术的杂交法，能够快速简捷地富集高甲基化的CpG岛。该方法可用于多样本和多位点的甲基化分析，但由于仍不能解决酶切导致的假阳性问题。以及用于检测单个甲基化位点的甲基化特异性微阵列 ((Methylation specificoligonucleotide, MS0)(Gitan R, Shi H, Chen C, et al. , Methy lation-specificoligonucleotide microarray -.a new potential for high-throughput methylationanalysis. Genome research, 2002,12 :158)。甲基化特异性微阵列是针对 CpG 二核苷酸位点的寡核苷酸微阵列，芯片的设计采用甲基化特异性PCR的原理，按照亚硫酸氢盐转化后非甲基化位点和甲基化位点的差异设计两个寡核苷酸探针，采用亚硫酸氢盐对目标DNA处理后，进行PCR扩增，并标记产物3’端后杂交，根据杂交后产生的荧光强度判断目标DNA甲基化水平。甲基化特异性微阵列和其他基于芯片的甲基化检测技术一样，在通量方面有极大的提高，但芯片的成本阻碍了其广泛的应用。除上述技术外，还有基于抗原抗体反应的甲基化DNA免疫沉淀技术(Methylated DNA Immunoprecipitation，MeDIP)和甲基化 DNA 结合蛋白的(Methylated DNA Binding Domain) WfF(Shiraishi Μ, Sekiguchi A, Oates A, et al. ，Methyl-CpG binding domain column chromatography as a tool forthe analysis of genomic DNA methylation. Analytical biochemistry, 2004, 329 :1)。这两种方法都是依赖特异性的抗体或者特异性蛋白对甲基化DNA的富集作用，结合新一代测序技术，可以得出全基因组水平上DNA甲基化情况。这两种方法与因为测序之前对基因组甲基化区域进行了富集，所以与亚硫酸氢盐处理直接测序相比，测序成本较低，但只能得到基因组中甲基化情况的概况或者高度甲基化区域的情况，而不能精确到基因组单个碱基的甲基化情况。因此亚硫酸氢盐处理技术仍然是绘制精细基因组甲基化图谱必须的技术。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种能够同时用于组蛋白修饰和DNA 甲基化研究的细胞DNA文库构建方法以及由该方法制备得到的细胞DNA文库。为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案本发明公开了一种细胞DNA文库构建方法，所述方法包括，对同一细胞样本依次进行染色质免疫共沉淀处理及亚硫酸氢盐处理，并对处理后产物进行扩增得到所述细胞 DNA文库。优选的，所述方法包括步骤a、在活体细胞状态下进行交联反应，使DNA与DNA上结合的蛋白质交联固定；
b、将交联固定后的染色质打断至片段长度为200 500bp ；C、采用染色质免疫共沉淀的方法从打断后的染色质中分离得到与目的蛋白质相结合的DNA片段；d、将分离的DNA片段采用亚硫酸氢盐处理使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。进一步的，所述在步骤c之后及步骤d之前还包括步骤c+1，将分离的DNA片段进行末端修复，使其成为平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”碱基，使其形成“T-A”粘性末端，然后连接甲基化测序接头；在步骤d之后还包括步骤d+Ι，使用与甲基化测序接头相匹配的引物进行PCR扩增得到所述细胞DNA文库。更进一步地，所述步骤a中，进行交联反应的活体细胞起始量为不低于10E6数量级，所述交联反应为甲醛交联反应，交联反应所用甲醛的终浓度为0. 8-1. 2 %优选1 %，甲醛交联时间为5-20min优选IOmin。在本发明一个优选的实施方式中，所述步骤b中，染色体打断采用非接触式超声破碎仪进行超声波打断，且超声频率为200w 320w，打断条件为超声25-35秒on/0. 5-3min off,共6-8个循环，优选30秒on/2min off,共7个循环，；所述步骤c中，染色质免疫共沉淀方法选用目的蛋白的特异性抗体及免疫磁珠来分离DNA片段，所述步骤c包括，将免疫磁珠与特异性抗体混合制备磁珠-抗体反应物，然后将步骤b打断的染色质与磁珠-抗体反应物混合进行免疫沉淀反应，之后进行反交联反应，并纯化得到与蛋白质分离的DNA。在本发明一个具体的实施方式中，所述特异性抗体为H3Mme3，所述免疫磁珠为分别包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠。所述抗体H3K4me3 的用量为3 4.5 μ g优选4yg，protein A磁珠和protein G磁珠的用量为300 600 μ g 优选600 μ g且两者的用量比为1 1。所述反交联反应的时间为2 1 优选池。在本发明另一个具体的实施方式中，所述步骤d的亚硫酸氢盐处理包括使用可溶性亚硫酸氢盐使胞嘧啶磺酸化，对苯二酚脱氨基，再在碱性环境下，使磺基消失，成为尿嘧啶。本发明还公开了采用上述构建方法制备得到的细胞DNA文库。由于采用了以上技术方案，使本发明具备的有益效果在于本发明的细胞DNA文库构建方法，通过将研究蛋白质-DNA相互作用的染色质免疫沉淀技术和精确检测甲基化位点的亚硫酸氢盐处理直接测序的技术相结合，可以直接有效的检测出与特定组蛋白修饰相结合的DNA甲基化状况，通过对数据的分析从而得出特定组蛋白修饰和与DNA甲基化直接或间接地相互关系，从而深入研究组蛋白修饰及DNA甲基化在生物体内的网络作用，构建表观遗传调控图谱；本发明的方法通过优化，解决了传统做法的染色质免疫共沉淀(ChIP)实验得到的产物量较少、无法用于常规亚硫酸氢盐处理的问题，本发明通过优化染色质免疫共沉淀(ChIP)实验方法增加其产物量，使其能够达到亚硫酸氢盐处理实验的最低起始量的要求。
图1为本发明染色质免疫沉淀技术(ChIP)结合亚硫酸氢盐(Bilsufite)处理的文库构建技术流程图。主要的实验步骤依次为细胞处理(染色质固定)、染色体的片段化、 染色质免疫共沉淀、DNA片段末端处理与甲基化修饰接头连接、亚硫酸氢盐处理、PCR扩增
处理产物等。图2为本发明实施例的样品打断效果检测的电泳图像。
具体实施例方式染色质免疫共沉淀技术(ChIP)和亚硫酸氢盐处理技术已经分别成为研究组蛋白修饰和DNA甲基化的经典方法。单独的使用ChIP技术或是亚硫酸氢盐处理技术只能从一个方面了解在研究对象体内修饰组蛋白与DNA的结合区域或者是这个研究对象全基因组 DNA甲基化的状况，而随着表观遗传学的发展，为了更加透彻的系统的理解细胞内表观作用网络，需要将表观现象作为一个整体进行研究。因此，为了研究组蛋白修饰和DNA甲基化的相互关系，我们将研究蛋白质-DNA相互作用的染色质免疫沉淀技术和精确检测甲基化位点的亚硫酸氢盐处理直接测序的技术相结合，可以直接有效的检测出与特定组蛋白修饰相结合的DNA甲基化状况，通过对数据的分析从而得出特定组蛋白修饰和与DNA甲基化直接或间接地相互关系，从而深入研究组蛋白修饰及DNA甲基化在生物体内的网络作用，构建表观遗传调控图谱。但是传统做法的染色质免疫共沉淀(ChIP)实验得到的产物量较少 (很多时候都不到10ng，对于某些珍贵的材料来说，由于细胞样品的量有限，得到的ChIP产物量更少)，而为了保证测序数据质量亚硫酸氢盐处理的起始量必须保证在IOOng以上，因此本发明为了将此两种技术相结合，通过优化染色质免疫共沉淀(ChIP)实验方法步骤增加其产物量使其能够达到亚硫酸氢盐处理实验的最低起始量的要求。本发明的实验步骤如图1所示，详细的实验原理根据实验步骤依次进行说明。一细胞处理根据免疫共沉淀实验的要求(Hoffman B and Jones S, Genome-wide identification of DNA-protein interactions usingchromatin immunoprecipitation coupled with flow cell sequencing. Journal of Endocrinology, 2009, 201 :1),首先要在活体细胞状态下将蛋白质与DNA交联固定，从而达到捕捉生理状态下蛋白质与DNA作用情况的目的。采用甲醛处理细胞的方法可以使蛋白质与DNA交联，其原理是在甲醛的作用下，DNA碱基上的氨基或亚氨基和蛋白质上的α-氨基及赖氨酸、精氨酸、组氨酸、色氨酸的侧链氨基与另外的DNA和蛋白质上的氨基或亚氨基交联在一起形成蛋白质-DNA复合体 (Merk 0 and Speit G,Significance of formaldehyde-induced DNA-protein crosslinks formutagenesis. Environmental and molecular mutagenesis, 1998, 32 :260-268),防止细胞内蛋白质组分的重新分布，从而便于进行免疫沉淀反应。甲醛交联反应是可逆的，便于在后续步骤中分别对DNA和蛋白质进行分析。交联反应所用甲醛的终浓度为1%，而交联时间需要分析确定。交联时间如果太长，交联后的DNA-蛋白质复合体难以被超声破碎仪打断，并且可能造成抗原表位丢失，影响后续免疫沉淀结果；交联时间过短，则蛋白质与 DNA无法形成较稳定的结合，容易导致ChIP反应沉淀下来的DNA量不足以构建文库，造成假阴性。本发明优化的甲酸交联时间为IOmin(Kim A,Kiefer CM andDean A,Distinctive signatures of histone methylation in transcribed coding andnoncoding humanbeta-globin sequences. Mol Cell Biol，2007，27 :1271-1279)。二染色体片段化根据免疫共沉淀与高通量测序的要求，需要将交联固定后的染色体打断到合适的片段长度以便于后续文库构建与测序。本发明采用超声方法打断染色体，超声打断过程中会产生大量的热引起样品溶液温度升高，容易造成蛋白质变性不利于后续的免疫共沉淀操作。因此为了保证蛋白质的活性状态，整个超声打断过程样品均需处于冰浴状态，且采用间断超声的方式，即超声打断与停止冷却反复进行。超声打断的时间需要根据不同超声破碎仪的参数与研究目的来确定，打断时间太短会造成DNA片段太大，使得与DNA结合的蛋白质抗原表位难以暴露，不利于抗体识别且不符合测序文库要求；而打断时间太长则会导致 DNA片段偏小，与蛋白质的结合过于松散不利于免疫沉淀反应。除此之外，超声时间过长还可能导致蛋白质的变性失活，无法与采用的抗体结合，导致DNA无法被沉淀下来。本发明使用Bioruptor超声破碎仪，功率输出设置为“H”，打断条件设定为30s on/2min off，共7个循环。细胞打断后不进行离心(以避免染色体损失)，直接用dilution buffer稀释，以得到更过的IP产物。三染色质免疫共沉淀(ChIP)免疫共沉淀是通过抗原抗体的特异性结合富集与目的蛋白质相结合的DNA片段。 染色质DNA片段后，根据研究选择合适的组蛋白抗体，并根据抗体对ftOtein A与ftOtein G的亲和力选择合适的磁珠与用量比例。除了选择合适的磁珠外，ChIP反应体系中抗体的量也是至关重要的。ChIP反应体系中抗体的量需要提前确定。若体系中抗体不足会造成 DNA不能完全沉淀，从而导致结果的假阴性或者DNA量达不到建库要求；反之，若体系中抗体量过大，则过量的抗体会与部分非目标蛋白发生非特异性结合，导致假阳性的产生。本发明进行以下改进单个ChIP反应体系采用4 μ g鼠来源的H;3Mme3 (abl012)抗体，磁珠采用protein A与protein G各20 μ 1 (包被好的磁珠的浓度30ug/ul)进行混合。在做 ChIP实验时，一定要做好实验对照，因为没有对照，很难对实验结果的可靠性进行评估。阳性抗体和阴性抗体对照是最基本的实验对照。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的比较保守的蛋白的抗体，阴性抗体通常选择目的蛋白抗体宿主的IgG。通过阳性对照和阴性对照的设置可以检测ChIP实验的效果，从而保证整个实验流程的有效性。另外，还应考虑目的蛋白抗体与DNA的非特异性结合的可能，所以通常还会选择一对阴性引物，即目的蛋白肯定不会结合的DNA序列，作为该抗体的阴性对照。除了设置阳性和阴性对照外，在进行免疫沉淀前，需要取一部分断裂后的染色质做Input对照。Input是断裂后的基因组DNA， 需要与沉淀后的样品DNA —起经过逆转交联，DNA纯化，以及最后的PCR或其他方法检测。 Input对照不仅可以验证染色质断裂的效果，还可以根据hput中的靶序列的含量以及染色质沉淀中的靶序列的含量，检测ChIP反应的富集效率。本发明取1/50的染色体打断后样品作为Input对照，与ChIP反应样品一起进行反交联处理，纯化DNA片段，将纯化后的 Input与ChIP样品稀释成相同浓度，取相同的量作为模板进行荧光定量PCR检测，通过比较 ChIP样品和Input的Ct值可以计算出ChIP反应的富集效率(Schemittgen TD,Livak KJ, Analyzing real-time PCR data by thecomparative Ct method,Nature protocol,2008, 13 :1101-1108.)，计算方法为富集效率=2" (Ct_Input_Ct_Sample)。四ChIPed DNA片段末端处理与甲基化接头连接
由于ChIP沉淀下来的DNA片段是通过超声的方法打断的，需要对DNA末端进行修复，使其成为平末端。末端修复的目的是将双链DNA片段损伤的5’端进行磷酸化，损伤的 3’端进行羟基化。末端修复完成后，通过向DNA片段3’末端加上一个“A”碱基，使其形成 “T-A”的粘性末端以便进行接头连接。根据PCR扩增和测序的要求需要对DNA片段加上合适的接头。一般情况下ChIP文库只需要连接常规的测序接头，但在本发明中要对得到的 DNA片段进行亚硫酸氢盐翻转处理，以研究DNA的甲基化情况，因此测序接头的所有胞嘧啶位点必须都经过甲基化修饰以防止亚硫酸氢盐处理后无法进行PCR扩增与文库构建。即连接的甲基化接头可以保证DNA片段经亚硫酸氢盐处理后接头序列不变，但仍可与测序引物匹配，从而使染色质免疫共沉淀与亚硫酸氢盐处理有效的结合。五亚硫酸氢盐翻转处理亚硫酸氢盐翻转是采用亚硫酸氢盐对单链DNA分子进行化学修饰，导致未甲基化胞嘧啶(C)可被亚硫酸氢盐脱去氨基而转变成尿嘧啶(U)，而5mC不能被修饰，仍保持为 5mC，在PCR反应过程中，尿嘧啶与腺嘌呤(A)配对，尿嘧啶则被胸腺嘧啶(T)取代。这一化学反应过禾呈首先由 Frommer 等A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosineresidues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A 89(1992) 1827-31)报导。具体过程为第一步，亚硫酸氢钠使胞嘧啶磺酸化；第二步，对苯二酚脱氨基；第三步，在碱性环境下，磺基消失，成为尿嘧啶。例如，该实验可由EZ DNA甲基化试剂盒-Gold(ZYM0 D5006)进行实施。六PCR扩增在DNA经过亚硫酸氢盐翻转之后，PCR的目的是将单链的DNA片段变成双链，同时扩增DNA的量。PCR扩增所用引物和亚硫酸氢盐处理之后的接头的序列相匹配。PCR扩增之后通过凝胶电泳回收的方式回收合适大小的DNA片段用于测序。胶回收采用Qiagen公司的QIAquick凝胶回收试剂盒。通过对上述步骤的终产物各项数据的进行分析后，可以直接有效的检测出与特定组蛋白修饰相结合的DNA甲基化状况，从而得出特定组蛋白修饰和与DNA甲基化直接或间接地相互关系，有助于阐明蛋白质与DNA甲基化之间相互作用的机制以及基因表达抑制的调控关系。从而深入研究组蛋白修饰及DNA甲基化在生物体内的网络作用，构建表观遗传调控图谱。下面通过具体实施方式
结合附图对本发明作进一步详细说明。实施例一材料和方法实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。培养健康人外周血细胞，命名为YH细胞。YH细胞培养使用 RPMI1640 (C22400500BT, Invitrogen)培养基(含 10% FBS (IO437OlO, Invitrogen))，YH 细胞属于悬浮培养细胞，细胞培养瓶选用T-75。在倒置显微镜下观察细胞状态，根据细胞培养基颜色变化进行传代，当培养基颜色变为偏黄时进行传代。按照图1的流程进行细胞处理、 文库构建与相应的测序，详细操作步骤如下1.细胞处理与交联反应
用pH7. 4的PBS缓冲液(10010-031，Invitrogen)新鲜配制浓度为的甲醛溶液，37°C水浴锅预热待用。将细胞培养瓶从细胞培养箱中取出，并旋紧培养瓶盖。在生物安全柜中进行以下操作用巴斯德吸管将培养瓶壁上的细胞吹勻，直接补充等体积的培养基进行传代，后置于37°C，5% C02细胞培养箱培养。当收集细胞的时候，直接吹勻，并将细胞搜集到新的50ml离心管中，用血球计数板进行计数。本实验经过优化后可以采用10E6 数量级细胞量起始，富集产物的量即能满足进行亚硫酸氢盐处理所需量。将收集的细胞在 4°C下850g离心5min，弃除细胞培养液，加入预热的新鲜配制的甲醛溶液25ml，吹勻细胞，37°C细胞水浴锅孵育10分钟；立即在4°C下850g离心5min，弃除甲醛溶液，分别用预冷的 IOml PBS-BSA (用 PBS 配制，BSA 浓度为 5mg/ml。BSA 货号为 0332_100g，AMRESC0)缓冲液及预冷的PBS缓冲液清洗细胞各一次；加入2ml冰预冷的PBS完全液(PBS-PIC，PIC即 protease inhibitor cocktail，Roche)，将细胞收集到2ml离心管中。850g离心1分钟；移除上清，轻弹管壁使收集的细胞重悬于残余的PBS中(可以在此步骤将处理好的细胞_80°C 冻存)。2.抗体准备根据本次实验所用抗体Histone H3(tri methyl K4)antibody [mAbcaml012] (abl012，Abeam)，选择 DynalBeads protein A(100. OlDInvitrogen)禾口 DynalBeads protein G(100. 03D, Invitrogen)(包被好的磁珠的浓度30ug/ul)，各取20 μ 1到新的 1. 5ml离心管中；加入500 μ 1冰预冷的PBS+BSA混合液，轻弹管壁，使磁珠重悬，并颠倒混勻；将离心管置于磁力架上2min，待磁珠吸附到磁力架上、上清变得澄清后，在磁力架上移除上清液。按上述步骤处理磁珠两次，最后重悬磁珠于500 μ 1冰预冷的PBS+BSA混合液， 并加入 4yg Histone H3(tri methyl K4) [H3K4me3]抗体(ab8580，Abeam)，4°C垂直混合器上孵育反应5h。3.样品打断通过实验条件的优化，选择Bioruptor超声破碎仪作为染色质打断的仪器，与其他超声仪相比，Bioruptor超声破碎仪的稳定性好，由于利用水波振荡进行打断，因此条件相对温和，更加利于ChIP实验，并且与探头式超声仪相比，Bioruptor打断在封闭的离心管中进行，可以避免由于探头浸入样品中造成污染。提前半小时将向Bioruptor超声破碎仪操作室中加入超纯水，将冷循环仪打开， 使其降温。新鲜制备 lysis buffer 完全液(1% SDS，IOmM EDTA, pH8. 150mM Tris-HCl, 1XPIC)，向步骤1中处理好的细胞中加入200μ1 lysis buffer完全液，轻弹管壁，使细胞重悬，冰置10-15min使细胞裂解；然后将其安装到Bioruptor超声破碎仪的适配器上 (Bioruptor UCD-200)。使用Biorupter超声破碎仪打断将功率输出设置为“H” (该档位功率为320w)，在控制旋钮上将“On”时间设置为30s，“Off”时间设置为2min，共7个循环。此打断条件可以使打断的片段分布于200-500bp之间，取出1/50的量作为input，常规 ChIP实验一般是取用1/10的打断样品作为hput，用Input来检测打断的效果，本实验由于起始细胞量少，所以只取出很少量的细胞作为hput，而用ChIP反应后的上清DNA用于检测打断效果，用 Dilution buffer (1 % triton, 2mMEDTA, 150mM NaCl,pH8. 120mM Tris-HCl) 将打断后产物稀释6-9倍，置于冰上备用。4.免疫共沉淀反应
取出Dynal beads与抗体反应物，置于磁力架上2分钟，弃除上清液；加入500ul 冰预冷的PBS-BSA混合液，轻弹管壁重悬磁珠，并颠倒混勻；置于磁力架上anin ；在磁力架上移除上清液，重复处理一次，此处理的目的在于除去未与磁珠结合的抗体；将步骤3中处理好的样品转移加入磁珠中；4°C旋转混合IP反应过夜。5.样品反交联取出染色质免疫沉淀反应过夜的样品，置于磁力架上2分钟，将上清转移；力口入 500 μ 1 RIPA buffer(50mM HEPES(H4034-25G，Sigma)，ImMEDTA(EB0185_500g，BBI)， 0.7 % Na Deoxycholate (D6750-100G，Sigma)，1 % NP-40(NDB0385-100ml, BBI),0.5M LiCl (LDB0307-250g, BBI))，轻弹管壁重悬磁珠，并颠倒混勻；置于磁力架上2min，弃除上清液；再加入500 μ 1 RIPAbuffer,轻弹管壁重悬磁珠，并在4°C旋转混合20min ；置于磁力架上2min，弃除上清液；重复步骤两次；加入500 μ 1 TE (ΑΜ9858，Ambion)，轻弹管壁重悬磁珠，并颠倒混勻；置于磁力架上2min，弃除上清液；再加入500 μ 1 TE (pH 8. 0)，轻弹管壁轻弹管壁重悬磁珠，并在4°C旋转混合20min ；置于磁力架上aiiin，将上清液弃除干净；将磁珠重悬于200 μ 1的反交联buffer (1% SDS, 0. IM NaHCO3)中，将ChIP反应后上清，ChIP样品与^iput同时65°C反交联，反交联时间由过夜缩短为3h，使整个建库流程缩短1天，上清 DNA用于电泳检测打断的效果，结果如图2显示，本实验打断的主带位于250-500bp之间。6.纯化ChIP产物将反交联样品置于磁力架上aiiin，取出样品，并用200 μ 1的纯水洗磁珠，转移出洗液与样品混合。加入等体积的酚氯仿异戊醇05 24 1)抽提，HOOOrpm离心IOmin ；离心后吸取上层水相，加入2倍体积的无水乙醇，1/10体积的3Μ NaAc, 1 μ 1的 20ug/ul的糖原，_80°C超低温冰箱放置20min，然后HOOOrpm离心lOmin，弃上清液；70% 乙醇清洗沉淀一次，HOOOrpm离心5min ；弃除上清，晾干沉淀，溶于25 μ 1 EB溶液中。抽取 Ιμ 样品采用Qubit (Quant-it dsDNA HS Assary Kit)检测样品浓度，本实验ChIP产物总量为83ng。7.末端修复预先从_20°C 保存的冻存盒中取出 lOXPolynucleotide Kinasebuffer (B904, Enzymatics)和IOmM dNTPs mix(N201L，Enzymatics)，将其置于冰上融解并充分混勻 10 XPolynucleotide Kinase buffer。取出 KlenowFragment (P706L, Enzymatics),用一新的PCR管取1 μ 1 Klenow Fragmen并按1 10稀释成浓度为IU/ μ 1的工作液。在1. 5ml 的离心管中配制末端修复反应体系ChIP样品DNA 20 μ 1 ； 10 XPolynucleotide Kinase BufferlOy 1 ； IOmM dNTPs mix 2μ 1 ； T4DNA Polymerase (P708L, Enzymatics) 1 μ 1 ；## 10 倍白勺 Klenow Fragmen 1 μ 1 ；Τ4 Polynucleotide Kinase(Y904L, Enzymatics)1 μ 1 ；辛卜水至总体系100 μ 1。将离心管在Iliermomixer中20°C温浴30min后，用酚氯仿异戊醇 (25 4 1)抽提一次，并用乙醇沉淀DNA，最后溶于34 μ 1 EB中。8.末端加A预先从-20°C保存的冻存盒中取出IOXblue buffer (B011, Enzymatics)和 ImM dATP，将其置于冰盒上溶解并充分混勻。在1. 5mL的离心管中配制加“Α”反应体系末端修复的样品 32 μ 1，IOXblue buffer (Β011，Enzymatics) 5 μ 1，dATP (28406501, Sigma) 10 μ 1 禾口 3μ 1 Klenow (3 ‘ -5，exo_) (P701-LC-L，Enzymatics),反应体系总体积为 50 μ 1。在Thermomixer中在37°C温浴30min，用氯仿异戊醇抽提，乙醇沉淀，最后DNA溶于45 μ 1的 EB中。9.连接甲基化接头预先从-20°C 保存的冻存盒中取出 2XRapid ligation buffer (ΒΙΟΙ, Enzymatics)禾口 PE Methylated Adapter (illumina methylated adapterME-100-0010, 其置于冰上融解并充分混勻2XRapid Iigationbuffer0取出PE Adapter用一新的PCR 管取IyL Adapter oligo mix按1 10稀释成工作液。在1. 5mL离心管中配置如下反应体系加 A 后的样品 45 μ L ;2 X Rapid ligation buffer 50 μ 1;稀释 10 倍 PE Methylated Adapter 1 μ 1 ；H20 2μ L ； T4DNA Ligase (L603-HC-L, Enzymatics) 4 μ 1 ；总体积 100 μ 1。在在Thermomixer中在20°C温浴15min，用氯仿异戊醇抽提，乙醇沉淀，最后DNA溶于45 μ 1 的超纯水中。10.亚硫酸氢盐处理本实验使用ZYMO EZ DNA Methylation-Gold Kit进行亚硫酸氢盐处理，实验步骤如下1)在PCR管中添加 130 μ 1 的CT Conversion Reagent 到每20 μ IDNA样品中.如果DNA样品的体积小于20 μ 1，则用水来弥补差量.通过轻弹试管或移液器操作来混合样
P
ΡΠ O2)将样品管放到循环变温器并按以下步骤操作98°C放置10分钟，64°C放置2. 5 小时，立刻进行下述操作或者在4°C下存储(最多20小时).3)添加 600 μ 1 的 M-Binding Buffer 到 Zymo-Spin Column 中，并将柱放如试剂盒所提供的Collection Tube中.4)装填样品(从步骤2)到Zymo-Spin Column含有M-Binding Buffer.盖上盖将柱颠倒数次来混合样品。5)全速(> 10，OOOxg)离心30秒.去除流出液。6)添加200 μ 1的M-Wash Buffer到柱中.全速离心30秒。7)添加 200 μ 1 的 M-Desulphonation Buffer 到柱中并且在室温(20°C _30°C下放置15-20分钟.在培养后，全速离心30秒。8)添加200 μ IM-Wash Buffer到柱中·全速离心30秒·再添加200 μ 1的M-Wash Buffer并且离心30秒·。9)直接添加20 μ 1的M-Elution Buffer到柱基质中.将柱放置在1. 5ml的管中.全速离心来洗脱DNA。11. PCR从-20°C 保存的冻存盒中取出 PCR PE Primer 1. 1 禾口 PCR PE Primer 2. 1(Paired-End DNA Sample Pr印 Kit，PE-102-1001)，MgSO4(C11708-021，Invitrogen)， IOmM dNTP mix, IOXPfx amplication buffer (Cl 1708-021, Invitrogen)将其置于冰上化冻并充分混勻。在0. 2mL的PCR管中配制PCR反应体系样品20μ 1 ； 10 X Pfx amplication buffer 5 μ 1 ；platinum PfxDNA Polymerase(C11708-021, Invitrogen)0. 5 μ 1 ；primer 1. l(10pmol/y 1)5μ 1 ；primer 2. 1 (lOpmol/μ 1) 5 μ 1 ；补水至总体积 50ul。配置完成后，首先在热循环仪中94°C下反应2min，然后进行18个扩增循环，扩增程序为94°C变性15sec，62°C退火30sec，72°C延伸30sec，最后在72°C保持5min。反应结束及时将样品取出放入4°C冰箱保存并按要求退出或关闭仪器。通过琼脂糖凝胶电泳，选取合适大小的PCR 产物胶回收纯化，用于Illumina公司HiSeq2000测序仪测序。本实验中选取插入片段约为 150bp的PCR产物进行胶回收与文库构建。二结果1、Sanger法测序库检对用本次发明的测序库样本制备技术所制备的测序库进行克隆处理并使用 Sanger法进行小范围的测序检测。文库检测结果中有91 %的reads能比对回基因组区，且其甲基化化率为45% ；而99%的转化率说明亚硫酸氢盐(磺酸化)处理的效果(表1)非常显著。因此，通过抗体富集与亚硫酸氢盐处理可得到有效的序列信息。文库检测合格并构建Illumina公司Hiseq高通量测序的I^aired End DNA文库与进行相应的测序。表2 1细胞H3Mme3抗体ChIP文库Sanger法测序结果
权利要求
1.一种细胞DNA文库构建方法，所述方法包括，对同一细胞样本依次进行染色质免疫共沉淀处理及亚硫酸氢盐处理，并对处理后产物进行扩增得到所述细胞DNA文库。
2.根据权利要求1所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述方法包括步骤a、在活体细胞状态下进行交联反应，使DNA与DNA上结合的蛋白质交联固定；b、将交联固定后的染色质打断至片段长度为200 500bp；c、采用染色质免疫共沉淀的方法从打断后的染色质中分离得到与目的蛋白质相结合的DNA片段；d、将分离的DNA片段采用亚硫酸氢盐处理使未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶。
3.根据权利要求2所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述在步骤c之后及步骤d之前还包括步骤c+1，将分离的DNA片段进行末端修复，使其成为平末端，并在DNA片段3’末端加上“A”碱基，使其形成“T-A”粘性末端，然后连接甲基化测序接头；在步骤d之后还包括步骤d+Ι，使用与甲基化测序接头相匹配的引物进行PCR扩增得到所述细胞DNA文库。
4.根据权利要求2或3所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述步骤a中，进行交联反应的活体细胞起始量为不低于10E6数量级，所述交联反应为甲醛交联反应，交联反应所用甲醛的终浓度为0. 8-1. 2%优选1%，甲醛交联时间为5-20min优选lOmin。
5.根据权利要求4所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述步骤b中，染色体打断采用非接触式超声破碎仪进行超声波打断，且超声频率为200w 320w，打断条件为超声 25-；35 秒 on/0. 5_3min off,共 6-8 个循环，优选 30 秒 on/2min off,共 7 个循环。
6.根据权利要求4所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述步骤c中，染色质免疫共沉淀方法选用目的蛋白的特异性抗体及免疫磁珠来分离DNA片段，所述步骤c包括，将免疫磁珠与特异性抗体混合制备磁珠-抗体反应物，然后将步骤 b打断的染色质与磁珠-抗体反应物混合进行免疫沉淀反应，之后进行反交联反应，并纯化得到与蛋白质分离的DNA。
7.根据权利要求6所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述特异性抗体为 H;3K4me3，所述免疫磁珠为分别包被有protein A和protein G的protein A磁珠和protein G磁珠，所述抗体H3Mme3的用量为3 4. 5 μ g优选4 μ g，protein A磁珠和protein G磁珠的用量为300 600 μ g优选600 μ g且两者的用量比为1 1。
8.根据权利要求6或7所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述反交联反应的时间为2 IMi优选池。
9.根据权利要求2或3所述的细胞DNA文库构建方法，其特征在于所述步骤d的亚硫酸氢盐处理包括使用可溶性亚硫酸氢盐使胞嘧啶磺酸化，对苯二酚脱氨基，再在碱性环境下，使磺基消失，成为尿嘧啶。
10.采用权利要求1 9任意一项所述的细胞DNA文库构建方法制备得到的细胞DNA 文库。
全文摘要
本发明公开了一种细胞DNA文库构建方法，包括对同一细胞样本依次进行染色质免疫共沉淀处理及亚硫酸氢盐处理，并对处理后产物进行扩增得到所述细胞DNA文库。本发明的方法，可以直接有效的检测出与特定组蛋白修饰相结合的DNA甲基化状况，从而深入研究组蛋白修饰及DNA甲基化在生物体内的网络作用，构建表观遗传调控图谱。
文档编号C40B50/06GK102534812SQ201010619688
公开日2012年7月4日 申请日期2010年12月31日 优先权日2010年12月31日
发明者卓著, 叶明芝, 张秀清, 杨焕明, 郜赵伟, 韩旭 申请人:深圳华大基因研究院, 深圳华大基因科技有限公司