表达猪pCD163的细胞系、其制备方法及应用
【技术领域】
[0001]
本发明涉及生物技术中基因表达领域，特别涉及一种表达猪P⑶163的细胞系，还涉及此细胞系的制备方法及应用。
【背景技术】
[0002]
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS),俗称“猪蓝耳病”，由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratorysyndrome virus, PRRSV)引起，病毒感染后可以导致母猪流产、返情、产死胎或弱仔、仔猪死亡及各种年龄的猪不同程度的呼吸道症状，并且能破坏猪的免疫系统，引起混合感染或继发感染。我国于1995年底爆发此病，并迅速蔓延到全国多个省份。在许多规模化猪场，PRRS阳性率很高，有的可达80%以上。自2006年以来，我国部分地区猪场发生了由PRRSV变异株导致的高致病性蓝耳病。该病在临床上以发病猪高热、呼吸困难、皮肤发红为主要特征，具有更高的发病率和死亡率，给我国的养猪业造成了极为严重的经济损失。现阶段使用疫苗免疫仍是防制PRRS流行的主要手段。
[0003]PRRSV表现出相当严格的细胞嗜性，PRRSV在感染猪体时，其主要的靶细胞为肺泡巨噬细胞(PAM)，在体外培养时，则只能在CL2621、MARC-145等细胞中增殖。PAM非常容易感染PRRSV，但是PAM难于获得且只能原代培养，操作成本高昂，无法在PRRSV的疫苗生产中使用；MARC-145细胞虽然可以增殖PRRSV，但是存在着增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的局限性。
[0004]CD163是PRRSV细胞受体，可以单独介导PRRSV的吸附和内吞。研宄发现，将CD163分子导入PRRSV非易感细胞，使该细胞表达CD163蛋白后就能够感染并增殖PRRSV，成为PRRSV易感细胞。CD163在MARC-145细胞中的表达量很低，导致了 MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低。
[0005]公开号为CN103525773A的中国发明专利申请，公开了一种提高猪蓝耳病病毒靶细胞感染滴度的方法及其应用。通过构建能够表达猪蓝耳病病毒受体硫酸乙酰肝素、唾液酸粘附素、波形蛋白、CD163、CD151和非肌肉肌球蛋白重链II A受体中的单个或多个的Marcl45细胞或MA-104细胞，再利用该细胞接种猪蓝耳病病毒，收集病毒液，猪蓝耳病病毒感染滴度得到大幅提高；收集的病毒液可进一步用于蓝耳病疫苗生产。说明书中【具体实施方式】详细公开了细胞系的构建方法及病毒培养效价，构建过程中使用的载体为PIRES2-EGFP。利用能表达猪蓝耳病病毒受体细胞接种病毒，可连续收获病毒且收获病毒滴度提高2?5倍，而所制备疫苗的效力并没有降低，在不增加额外生产成本的基础上，使单位时间产能提高2?5倍。本发明人认为，上述效果还有进一步提升的空间。
【发明内容】
[0006]
为了解决以上现有技术中P⑶163在MARC-145细胞中的表达量低，导致了 MARC-145细胞增殖PRRSV速度慢、PRRSV滴毒低的问题，本发明提供了一种可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV的表达猪P⑶163的细胞系P⑶163-MARC。
[0007]本发明还提供了所述细胞系P⑶163-MARC的制备方法。
[0008]本发明还提供了所述细胞系P⑶163-MARC的应用。
[0009]本发明是通过以下步骤得到的:
一种表达猪P⑶163的细胞系，通过以下步骤得到的:
通过RT-PCR扩增获得P⑶163受体基因，将其插入真核表达载体pC1-neo中，构建真核表达质粒pC1-pCD163，将真核表达质粒pC1-pCD163转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选，获得单克隆细胞并扩大培养即得。
[0010]根据GenBank公布的PCD163的基因序列(GenBank No: HM991330)设计一对扩增PCD163受体基因序列的引物，序列如下:
pCD163-Fwd(ZAoI): 5’ -ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC-3’，pCD163-Rev(M?iI): 5’ -ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG-3’。
[0011]所述的细胞系，优选RT-PCR扩增获得P⑶163受体基因，PCR反应体系为25μ?,含 cDNA I μ?, Mg2+ 1.5 mmoL/L, dNTP 200 MmoL/L，10XLA PCR Buffer 2.5 μ?,pCD163-FwdUXoI)和 pCD163_Rev OVoiI)各 400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2 U ；
反应条件为:预变性95。C 5 min ;然后进行35个循环，循环条件为95。C 45 s，61° C 45 S，72 ° C I min ;然后 72 ° C 延伸 10 min。
[0012]所述的细胞系在临床分离PRRSV和生产PRRSV疫苗中的应用。
[0013]所述的应用，优选将含有PRRSV的病料样品接种至所述的细胞系，盲传5代，出现明显CPE的为分离到病毒。
[0014]所述的应用，优选将所述的细胞系感染PRRS疫苗株，培养若干小时后收毒，用于疫苗的生产。
[0015]采集健康猪肺脏分离PAM (猪肺泡巨噬细胞)，提取RNA，通过RT-PCR扩增获得P⑶163基因。然后将该基因插入真核表达载体pC1-neo中，构建真核表达质粒pC1-p⑶163。将该质粒转染MARC-145细胞，通过G418进行抗性筛选。采用有限稀释法获得单克隆细胞并扩大培养，IFA,Western blot鉴定获得的细胞系，通过pCD163_MARC与CN103525773A中的细胞系对PRRSV增殖的差异比较试验，证实P⑶163-MARC细胞系增殖PRRSV的优势。
[0016]本发明所构建的pCD163-MARC细胞系比CN103525773A中公开的Marc_145/CD163细胞(以下简称对照细胞)对PRRSV增殖的滴度提高了 10°_6_°_7TCID5tl,更适合于临床PRRSV的分离和疫苗生产。
[0017]本发明的有益效果是:
(1)本发明构建的PCD163-MARC细胞系可以在病毒滴度较低的情况下快速、高效地增殖PRRSV，突破了以往MARC-145细胞系PRRSV增殖率低的局限性；
(2)通过病毒增殖实验证明，在相同的条件下，本发明构建的pCD163-MARC细胞系对临床样品的PRRSV分离率高，病毒增殖滴度高，更加适合于疫苗生产。
[0018]【附图说明】: 图1为从PAM细胞中扩增出的P⑶163基因电泳图，其中I和2均为P⑶163 RT-PCR产物，M 为 DL 15,000 DNA Marker,
图2为本发明重组真核表达质粒pC1-p⑶163 Xhol/Notl双酶切鉴定图谱，其中I和3代表两个不同重组阳性质粒XhoVNotl双酶切结果；2和4代表两个不同重组阳性质粒对照；M 为 DL 15，000 DNA Marker,
图3为间接免疫荧光(IFA)检测两种细胞中⑶163蛋白的表达情况，其中左图为MARC-145细胞，右图为本发明构建的P⑶163-MARC细胞系，
图4为Western blot检测两种细胞中CD163蛋白的表达情况，其中I为MARC-145细胞中⑶163蛋白的表达情况，2为本发明构建的P⑶163-MARC细胞系中⑶163蛋白的表达情况，下部分为β-actin内参，
图5为PRRSV经典株SD-1株(A)和高致病性毒株SD-JN株⑶感染p⑶163-MARC细胞与CN103525773A中公开的Marc-145/⑶163细胞(对照细胞)后分别取样，测定的一步生长曲线，
图6为PRRSV经典株SD-1株(A)和高致病性毒株SD-JN株⑶感染p⑶163-MARC细胞与对照细胞后分别取样，Real-time PCR测定的PRRSV的RNA的量。
【具体实施方式】
[0019]1.表达P⑶163的重组真核质粒pC1-p⑶163的构建 1.1引物设计
根据GenBank公布的pCD163的基因序列(GenBank No: HM991330)设计设计一对扩增P⑶163受体基因序列的特异性引物P⑶163-FwdUXoI)和p⑶163-RevOVoiI)。在引物PCD163-FwdUXoI)的5’端引入ZAoI酶切位点和Kozak序列，引物序列如下:pCD163-Fwd{Xhol):5~ATACTCGAGCCACCATGGACAAACTCAGAATGGTGCTAC~3pCD163-Rev(M?iI): 5~ATAGCGGCCGCAAGCTTATCATTGTACTTCAGAG~3两条引物pCD163-FwdUXoI)和pCD163_Rev OVoiI)横跨pCD163整个蛋白编码区，预计扩增片段长度为3380 bp?
[0020]1.2猪巨噬细胞的分离培养及总RNA的提取
采用肺气管冷PBS灌洗法分离获得猪肺泡巨噬细胞，将50日龄的SPF仔猪放血，结扎气管后无菌摘取其肺脏，先用0.9%的生理盐水洗涤外表面，将pH7.2的PBS 30.0 mL从气管灌入肺脏，轻轻拍打肺表面，1-2 min后回收灌洗液，如此反复进行，直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打，将细胞团块打散，4 ° C 2000 rpm离心10min,收集沉淀。PBS洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的RPM1-1640营养液吹散细胞，置培养瓶中于37 ° C、含0)25￥%的培养箱中培养，待其贴壁后弃去上清及非吸附细胞。继续用含10%胎牛血清的RPM1-1640培养液培养备用，用TRIzoI试剂提取总RNA，作为RT-PCR的模板。
[0021]1.3 RT-PCR 扩增
以RNA经反转录酶01 igo d (T)反转录后得到cDNA为模板，pCD163-Fwd (Xhol)和pCD163-Rev {Notl)为引物进行PCR扩增，PCR反应体系为25 μ?,含cDNA I μ?,Mg2+ 1.5 mmoL/L，dNTP 200 MmoL/L，10XLA PCR Buffer 2.5 μ?, pCD163_Fwd UXoI)和pCD163-RevOVoiI)各 400 nmoL/L，TaKaRa LA Taq 2 U。反应条件为:预变性 95。C 5min ;然后进行35个循环，循环条件为95 ° C 45 S，61 ° C 45 S，72 ° Cl min ;然后72° C延伸10 min，取出产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收获得pCD163基因的PCR产物。结果见图1。
[0022]1.4重组真核表达质粒的构建及鉴定
用XhoVm t\双酶切P⑶163基因的扩增产物，胶回收得到编码P⑶163基因片段I，用Xhol/Notl双酶切真核表达质粒pC1-neo，胶回收得到载体基因片段2，将p⑶163基因片段I和载体基因片段2连接，转化DH5a感受态细菌，37 ° C过夜培养16 h，挑取菌落于氨苄青霉素抗性的LB培养基中37 ° C过夜振荡培养，第二天提取质粒，进行ZAoIAVoiI双酶切鉴定。结果见图2。鉴定为阳性的质粒pC1-pCD163交由TaKaRa公司测序。用Vector NTI和DNAStar软件分析所插入的基因序列和推导氨基酸序列。
[0023]2.稳定表达pCD163的MARC-145细胞系pCD163-MARC的构建
2.1 MARC-145细胞G418耐受性测试
消化MARC-145细胞，用10%的胎牛血清DMEM (不含抗生素)稀释细胞，使其密度达到I X 14个细胞/mL，在12孔细胞板上每孔接种I mL，于3