一种中药诱导增强型dc-cik细胞的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种结合中药提取物与细胞因子扩增免 疫细胞技术及其应用。 技术背景
[0002] 恶性肿瘤已成为中国死亡原因第一位，严重威胁着人民的健康与生命，目前，肿瘤 的治疗通常以手术、放疗、化疗和生物治疗等多种手段的综合治疗。辅助化疗是术后癌患者 的重要治疗方法之一，但化疗往往会产生较为严重的胃肠道毒性、心脏毒性、神经毒性等毒 性反应，部分患者对化疗药物耐受性差，难以坚持整个化疗疗程是限制治疗效果的重要因 素。
[0003] 近年来，随着肿瘤免疫学、细胞生物学等学科的迅猛发展，肿瘤细胞免疫治疗受到 了国内外学者的重视。其中，免疫细胞治疗由于其副作用小、杀瘤作用机理明确、安全性 高等特点在国内临床开展较多，为肿瘤治疗提供了新的治疗方法。免疫细胞治疗包括NK、 LAK、CIK、DC-CIK、TIL等，其中，DC-CIK因其兼具特异性与非特性肿瘤杀伤效应而受到广泛 的关注，临床研宄表明DC-CIK能够提高癌症患者的生存率，且能增强由化疗削弱的免疫功 能。然而，常规抽取患者外周血在体外培养扩增DC-CIK后，细胞在体内留存时间短，细胞 特异性、活性有限，患者需要长期接受治疗，一旦停止容易复发，且费用昂贵等问题限制了 DC-CIK在临床上的广泛应用。
【发明内容】
[0004] 为解决以上现有技术问题，本发明的目的在于提供一种中药诱导增强型DC-CIK 细胞的制备方法，该方法能激活免疫细胞活性与功能，提高DC-CIK细胞的特异性，使其在 体内能够长时间发挥抗肿瘤作用，且通过该方法能获得大量DC-CK细胞，节省细胞培养时 间。
[0005] 为达到该发明目的，本发明采用的技术方案为：一种中药诱导增强型DC-CIK细胞 的制备方法，向DC或CIK细胞培养液或DC-CIK细胞培养液或DC，CIK和DC-CIK细胞培养 液中加入黄芪与党参提取物来激活DC或CIK细胞活性与功能，所述的黄芪与党参提取物为 黄芪多糖和党参多糖。
[0006] 进一步的，本发明的中药诱导增强型DC-CIK细胞的制备方法，包括如下步骤：
[0007] 1)外周血采集：静脉穿刺采集患者外周血，转移至盛有肝素抗凝的离心管内，拧 紧管盖轻柔地颠倒混匀；
[0008] 2)单个核细胞分离：将步骤1)所得的外周血液样本离心后，废弃上层血浆，加入 生理盐水稀释血样，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，分离的单个核细胞加入生理盐水离 心洗涤获得单个核细胞沉淀；
[0009] 3)细胞种瓶：将步骤2)所得的细胞沉淀物用无血清培养液A重悬细胞，移至培养 瓶，放入5%C02培养箱培养，优选的培养时间为2h;所述的无血清培养液A为LONZAX-VIVO 15 ；
[0010] 4)DC细胞诱导及培养：步骤3)所述细胞经孵育培养后，优选的孵化时间为2h，DC 细胞贴附于细胞培养瓶底，CIK细胞仍悬浮于细胞培养液中，将含有CIK细胞悬浮培养液移 植新的培养瓶，剩下的贴壁细胞加入新鲜的无血清培养液B;
[0011] 所述DC细胞诱导培养需7天，每2?3天细胞半量换液；
[0012] 所述的无血清培养液B包含：LONZAX-VIVO15、黄芪与党参提取物、细胞因子 GM-CSF和IL-4 ;
[0013] 5)CIK细胞诱导及培养：将步骤4)中装有含CIK细胞的细胞悬液的培养瓶中添加 细胞因子C1、黄芪与党参提取物；培养24小时后，添加细胞因子C2和C3,此后每2?3天 细胞传代1次，同时添加细胞因子C2、黄芪与党参提取物；所述CIK细胞诱导培养7天；
[0014] 6)DC细胞与CIK细胞混合培养：将步骤4)和步骤5)所述DC细胞和CIK细胞在 第7天混合，继续培养3天，同时添加细胞因子C2、黄芪与党参提取物；
[0015] 7)细胞悬液制备：分别收集步骤6)所得的混合细胞的DC细胞与CIK细胞至离心 管，离心，弃去上清液，加生理盐水重悬细胞，离心洗涤；将所得的DC细胞与CIK细胞混合， 然后加入人血白蛋白、生理盐水，混匀细胞，最后细胞悬液过70ym细胞滤网使细胞分散为 单个细胞悬液转移至细胞袋中，热合封口。
[0016] 优选的，所述的步骤3)中所述的重悬细胞的密度应为2X106/ml。
[0017] 优选的，所述的步骤4)中所述的黄芪与党参提取物为：黄芪多糖与党参多糖，黄 芪多糖在无血清培养液中的浓度为150?300yg/ml，党参多糖在无血清培养液中的浓度 为100?200yg/ml;所述的GM-CSF在无血清培养液中的浓度为50ng/ml;所述的IL-4在 无血清培养液中的浓度为20ng/ml。
[0018] 优选的，所述的步骤5)中所述细胞因子Cl为IFN-y，浓度为1000U/ml;所述细胞 因子C2为IL-2,浓度为1000U/ml;所述细胞因子C3为CD3McAb，浓度为50ng/ml;所述的 黄芪与党参提取物为：黄芪多糖与党参多糖，黄芪多糖在无血清培养液中的浓度为150? 300yg/ml，党参多糖在无血清培养液中的浓度为100?200yg/ml;所述悬浮细胞培养液 密度为1?2X106/ml。
[0019] 优选的，所述的步骤6)中所述细胞因子C2为IL-2,浓度为1000U/ml，所述的黄 芪与党参提取物为：黄芪多糖与党参多糖，黄芪多糖在无血清培养液中的浓度为150? 300yg/ml，党参多糖在无血清培养液中的浓度为100?200yg/ml;所述的DC细胞与CIK 细胞混合比例：1 : (5?25)。
[0020] 本发明的另一目的在于利用上述方法制备得到的中药诱导增强型DC-CIK细胞将 其应用于肿瘤疾病的细胞治疗，制备得到的增强型DC-CIK细胞回输体内可直接杀伤肿瘤 细胞、调节机体免疫机能。与传统的治疗方法不同，细胞治疗在不损伤机体免疫系统和功能 的前提下，直接识别、杀伤、清除存在于人体内血液、淋巴中的肿瘤细胞，重建和增强机体自 然抗肿瘤免疫系统和功能。细胞免疫治疗肿瘤具有提高患者自身的免疫功能与提高生活质 量，并适用于除T细胞淋巴瘤以外的所有肿瘤疾病。
[0021] 本发明通过向DC或CIK细胞培养液中加入黄芪与党参提取物来激活DC或CIK细 胞活性与功能的理论基础在于：
[0022] 黄芪与党参提取物主要成分为党参多糖及黄芪多糖，两者能在体内能通过增强机 体免疫功能而发挥抗肿瘤作用，也就是说多糖在体内能够发挥对免疫细胞的调节作用，研 宄表明党参多糖及黄芪多糖可促进DC细胞成熟，活化T细胞，增强T细胞活性并能诱导T 细胞增殖。此外，临床观察显示黄芪与党参提取物能降低恶心、呕吐等化疗副反应，还能有 效保护骨髓，阻止白细胞下降，提高患者KPS评分，改善患者生活质量，说明其在体内能够 保护淋巴细胞维持其活性，于是本发明人通过将通过向DC或CIK细胞培养液中加入黄芪与 党参提取物来激活DC或CIK细胞活性与功能，得到了意想不到的效果，于是有了本发明。
[0023] 本发明的有益效果体现在：本发明利用党参多糖及黄芪多糖在体内能够发挥对免 疫细胞的调节作用，可促进DC细胞成熟，活化T细胞，增强T细胞活性并能诱导T细胞增 殖以及能降低恶心、呕吐等化疗副反应，还能有效保护骨髓，阻止白细胞下降，提高患者KPS 评分，改善患者生活质量等特性。通过该方法诱导培养的DC-CIK细胞，具有提高DC-CIK细 胞的杀瘤活性与分泌细胞因子能力，使其在体内能够长时间发挥抗肿瘤作用，且通过该方 法能获得大量DC-CK细胞，所收获的细胞数量大于原来方法的10倍，节省细胞培养时间，培 养时间由原来的14?16天缩短到10天。
[0024] 其杀伤肿瘤细胞的活性大大高于常规诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤百分率实验 室检测结果达到80%以上。体外实验显示，经该法制备的增强型DC-CIK细胞增殖能力较常 规诱导的DC-CIK显著提高；经该法制备的增强型DC-CIK细胞其分泌抗肿瘤细胞因子的量 较常规诱导的DC-CIK显著提高；临床应用发现，经该法制备的DC-CIK细胞治疗肿瘤患者均 不同程度的改善了生活的质量，缓解病情，得到医务工作者以及肿瘤病患者的认可，为肿瘤 的治疗提供了一种更为有效的方法和手段。
【附图说明】
[0025] 图1为本