紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种紫檀芪的应用，具体涉及紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导 肝癌细胞凋亡药物中的应用，属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 肝癌是多药耐药肿瘤，多数患者确诊时已是晚期且药物疗效差，寻找低毒、有效、 安全的抗肿瘤药物是治疗肝癌的关键（卢创新，周云，薛飞，王文玉，李晓燕，郭志松.槲皮 素抑制肝癌IfepG2细胞的增殖及促凋亡机制的研究.中华实用诊断与治疗杂志.）。近些年 来，因为一些天然的抗肿瘤药物效果显著且几乎无不良反应。因此人们越来越重视这些物 质在抗肿瘤方面的研究和应用（王宁，杨阳，段维勋，梁振兴，李悦，金振晓，等.紫檀 芪对人肺腺癌A549细胞系增殖及凋亡的影响.中华临床医师杂志.）。
[0003] 细胞凋亡是一种独特的细胞死亡方式，它是生物体最重要的生理和病理现象之 一，是在基因调控下，由于内外环境改变或死亡信号触发引起的细胞程序性死亡。目前有两 大类最受重视的调控细胞凋亡的基因家族：一类叫做抑制凋亡因子，如Bcl-2 ;另一类叫做 促进凋亡因子，如Bax, Fas, Cycs和Caspase3。在细胞凋亡时，Bcl-2家族中的促凋亡蛋白 成员（如Bax)发生蛋白质的加工修饰，易位到线粒体的外膜上，引起细胞色素 C(Cycs) 和caspase等其他促凋亡因子的释放，导致细胞凋亡；而平时被隔离在线粒体等细胞器内 的该家族的抑制凋亡蛋白成员（如Bcl-2)则抑制Cycs和caspase等促凋亡因子的释放， 具有抑制细胞凋亡的功能（付永锋，樊廷俊.Bcl-2家族蛋白与细胞凋亡.生物化学与生物 物理学报.）。另外，Fas/FasL系统是肿瘤细胞凋亡的重要途径之一，通过影响肿瘤细胞 的Fas/FasL表达可以诱导其凋亡（孙麟，陈乔尔.Fas/FasL凋亡系统与肿瘤免疫逃逸研究 进展.医学综述.）。而Caspase-3是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞 凋亡过程中的主要效应因子。它的活化是凋亡进入不可逆阶段的标志（岳原亦，张扬，张一 奇.Caspase家族与细胞凋亡.中国医疗前沿.）。陈阳等（陈阳，赵秋宇，宋囡，贾连群.丹 参酮II A诱导人肝癌H印G2细胞凋亡的机制.中国老年学杂志.）研究发现丹参酮II A通 过上调Bax和下调Bcl-2基因的表达等方式诱导肝癌H印G2细胞凋亡。谢晓东等（谢晓 东，吴荧荧，黄文斯，刘庆，王颖，朱海涛，等.澳洲茄边碱对肝癌ifepG2细胞增殖及凋 亡的影响.江苏医药.）研究发现澳洲前边碱能够通过上调Bax和Caspase3,下调Bcl-2基 因的表达诱导肝癌IfepG2细胞凋亡。
[0004] 紫檀芪（Pterostilbene，PTE)广泛存在于多种小浆果和红酒中，是植物在受到 外来侵害时产生的一种植物抗毒素，属于抗体性物质。与白藜芦醇（Resveratrol，RES) 都属于芪类化合物，RES苯环上3, 5羟基的氢原子被甲基替换则成为紫檀芪。值得一提 的是，紫檀芪的多种生物活性都优于或至少不低于RES且具有良好的安全性（焦峰，黄海 进.紫檀芪对人食管癌EC9706细胞生长的影响及其机制.西南国防医药.）。研究发现， PTE 对乳腺癌（Nikhil K，Sharan S，Chakraborty A，Bodipati N，Peddinti R, Roy P. Role of isothiocyanate conjugate of pterostilbene on the inhibition of MCF_7cell proliferation and tumor growth in Ehrlich ascitic cell induced tumor bearing mice.Exp Cell Res 2014;320(2):311-328·)、肺癌（Yang Y，Yan X，Duan W，Yan J，Yi WjLiang Zjetal. Pterostilbene exerts antitumor activity via the Notchlsignaling pathway in human lung adenocarcinoma cells.PLos One 2013 ;8 (5):e62652.)、 前 列腺癌（Lin VC，Tsai YC，Lin JN，Fan LL，Pan MH，Ho CT，etal. Activation of AMPK by pterostilbene suppresses lipogenesis and cell cycle progression in p53positive and negative human prostate cancer cells. J Agric Food Chem 2012 ； 60(25) :6399-6407.)、食管癌等多种恶性肿瘤均有抑制作用，但其对治疗肝癌的研究尚无 明确报道。本发明以体外培养的人肝癌HepG2细胞为研究对象，探讨紫檀芪对HepG2细胞 增殖及凋亡的影响，进而为临床药物治疗肝癌提供新靶点。
【发明内容】
[0005] 目前，治疗肝癌的有效方法多以化疗、放疗为主，但其毒副作用较大。因此，研制和 开发新型高效低毒的抗癌药物已经成为治疗和攻克癌症的新希望。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：
[0007] 紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡药物中的应用，具体涉及紫 檀苗在制备通过上调Bax、Fas、Cycs和Caspase3基因，下调Bcl-2基因进而抑制肝癌细胞 增殖和诱导肝癌细胞凋亡的药物中的应用。
[0008] 在本发明中，优选的，所述肝癌细胞为人肝癌H印G2细胞。
[0009] 在本发明中，优选的，所述紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡 药物中应用的有效浓度为20~140 μ mol/L。
[0010] 在本发明中，优选的，所述紫檀芪在制备抑制肝癌细胞增殖和诱导肝癌细胞凋亡 药物中应用的有效浓度为80 μ mol/L。
[0011] 本发明的技术方案是对肝癌细胞系HepG2进行常规培养，MTT法检测不同浓度紫 檀芪对H印G2细胞活力的影响；倒置显微镜和流式细胞术检测紫檀芪处理后H印G2细胞的 凋亡情况；实时定量PCR和Western blot分别检测紫檀芪处理后Bax、Bcl_2、Fas、Cycs (细 胞色素C)和Caspase3基因mRNA和蛋白表达情况。
[0012] 本发明探讨了紫檀芪（PTE)对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制，本发 明研究结果显示，紫檀苗能够使Bax, Fas, Cycs和Caspase3基因的表达上调和Bcl-2基因 的表达下调。此外，通过线粒体跨膜电位的变化和上调Fas和Caspase3基因的表达，可以推 断出紫檀芪可能通过线粒体途径和死亡受体途径双重机制介导诱导肝癌IfepG2细胞凋亡。
[0013] 1.细胞培养和药物配制
[0014] !1印62细胞培养液为含10%的胎牛血清、10011^/1链霉素和1\1051]/1青霉素的完 全培养液，培养箱环境为37°C、5% CO2、饱和湿度。紫檀芪先用DMSO溶解，然后再用完全培 养基稀释，用其做后续实验。
[0015] 2.紫檀芪对细胞增殖能力的影响
[0016] 用不同浓度紫檀芪（20~140 μ mol/L)分别处理H印G2细胞24, 48, 72h后，用酶 标仪在570nm波长下测定吸光度值（OD)，并计算出细胞增殖抑制率和IC50值。经测定，细 胞增殖出现抑制效应且呈剂量时间依赖性，紫檀芪作用HepG2细胞48h的最佳药物浓度为 80 μ mol/L，IC50 值为 80. 068 μ mol/L。
[0017] 3.细胞形态观察
[0018] 取对数生长期的H印G2细胞，分别加入终浓度为0, 40, 80, 120 μ mol/L的紫檀芪培 养48h后，光学显微镜下观察细胞形态的改变并拍照。用200 μ L吖啶橙（0. 5 μ g/ μ L)在 室温条件下孵育3~5min，荧光显微镜下观察细胞核的变化并拍照。形态学观察发现紫檀 芪作用后的细胞呈明显凋亡状态，出现细胞周期阻滞现象。
[0019] 4.紫檀芪对肝癌!fepG2细胞凋亡的作用
[0020] 不同浓度紫檀芪（0, 40, 80, 120 μL?οΙ/L)处理H印G2细胞48h后，AnnexinV-FITC/ PI双染法检测细胞凋亡率及统计分析。紫檀芪能够诱导肝癌IfepG2细胞凋亡，且随着药物 浓度的不断增大，细胞早期凋亡率呈现先增加后减小的趋势，在80 μ mol/L和120 μ mol/L 时变化显著。当紫檀芪浓度达到80 μ mol/L时细胞早期凋亡率最大，为（15. 61 ±0.71) % (Ρ〈0· 05) 〇
[0021] 5.紫檀芪对肝癌HepG2细胞线粒体膜电位（△ Ψπι)的作用
[0022] 不同浓度紫檀芪（0, 40, 80, 120 μ mol/L)处理H印G2细胞48h后，流式细胞术检测 紫檀芪对IfepG2细胞线粒体膜电位（△ Ψπι)的影响及统计分析。对照组的H印G2细胞线粒 体膜电位为294. 15 ±20. 35,当药物浓度达到80 μ mol/L和120 μ mol/L时，线粒体膜电位明 显下降为165. 39±11. 35和103. 22±8. 72(P〈0. 01)，且变化极显著。
[0023]