缺氧诱导因子(hif)活性报告细胞系的制作方法
【专利说明】缺氧诱导因子（HIF)活性报告细胞系 发明领域
[0001] 本发明涉及一种新的缺氧诱导因子（HIF)应答报告基因构建体的构建，所述基因 构建体（genetic constructs)以及含有所述构建体的载体。此外，本发明涉及一种含有 HIF应答报告构建体的稳定的细胞系，以及利用本发明的构建体和细胞系鉴别HIF活性的 调节剂的方法和应用。
[0002] 发明背景
[0003] 组织缺氧的早期反应是诱导缺氧诱导因子（HIF)，一个基本的螺旋-环-螺旋转 录激活因子介导基因表达的变化以应答细胞的中氧气浓度的变化。当肺部受到损害或血流 量减少时可能会发生缺氧，减少氧的状态。缺血，减少血流量，可以通过动脉或静脉被血凝 块（血栓）的阻塞或通过任何外来循环物质（栓子）引起，或由一个血管障碍如动脉粥样 硬化引起。
[0004] 基于细胞的测定已经加速了现代药物的开发。目前，这些测定方法被用于引导鉴 另IJ、药物剂量优化以及靶标确认。小规模但高通量技术的使用使这些基于细胞的测定更有 效以及廉价地用于药物筛选。这些测定优选于其它的体外方法，因为它们对感兴趣的药物 靶标给予直接的细胞功能反应。这允许更清楚的了解靶标的生理和药理反应。
[0005] 目前，对HIF活性的定量测定的需求是巨大的。这是由于这样的事实，即除了参与 增殖、凋亡到癌症发展的多种细胞调控，HIF也被证明是参与干细胞更新（renewal)和分化 (Keith and Simon,，2007)。干细胞研宄在过去十年中的推进提升了有一个更强大的基于 细胞的测定系统的需求，以测量HIF活性特别是HIF相关的药物筛选中HIF的活性。不幸 的是，当前可用的系统是非常低效的，昂贵的，耗时的，最重要的是提供的灵敏度有限。对细 胞系的选择也是限制性的。
[0006] 基于细胞的HIF测定系统的发展已前被报告过（Woldemichael等，2006 Ji等， 2008)。然而，到现在为止只有两个HIF测定细胞系是可商购的。一个是来自于Invitrogen 公司，名为"CellSens〇r?:HRE-BLA ME-180 细胞系"(cat#K1644)。另一种是来自 Panomics 公司，名称为"稳定细胞系：NIH3T3/HIF-luc'（cat#RC0017)。SABiosciences，一个 Qiagen 公司，还销售HIF测定试剂盒，然而，它们的试剂盒为现成转导的慢病毒颗粒或现成的转染 的质粒的形式。最近，Emory大学和Rochester大学也在技术转让目录中报告他们的HIF活 性测定报告细胞系的开发。市售cellSensor HRE-BLA(Invitrogen)缺氧对常氧的信号比 值仅仅是13倍。而由Li等人（2008)开发的另一个系统只提供了 14倍的差异。在基于细 胞的测定法的信噪比不利的情况下，这种低诱导能力可能使这些系统不能以高通量形式应 用于药物筛选。
[0007] 鉴于上述已知的HIF活性的报告构建体，本发明的目的是提供一种HIF应答系统， 它显示出较高的HIF活化的诱导性和特异性，特别是应答缺氧。因此，本发明的再一个目的 是提供一种新颖的装置，用于HIF应答的调节剂的药物筛选，例如适合应用于高通量形式 的系统。
[0008] 解决上述问题的第一个方面是一种基因构建体，所述基因构建体整合有受缺氧诱 导因子（HIF)应答启动子控制的报告基因，其中所述HIF应答启动子包括至少一种衍生自 促红细胞生成素（EPO)基因的缺氧应答元件（HRE)。
[0009] 根据本发明的基因构建体应指由多个功能元件构成，以允许表达一个报告基因的 核酸分子。在本发明的上下文中所用的核酸可以是单链或双链；可以是DNA或本领域中已 知的其它核酸分子。
[0010]启动子是指导结构基因转录的核酸序列。典型的启动子位于基因的5'区域，靠近 结构基因的转录起始位点。本发明的启动子包括HRE元件（多个）。此外，启动子可以包括 上游元件。这样的元件包括UARS和任选的其它影响结构基因的转录的核酸序列，如合成的 上游元件或增强子。
[0011] 一个核心启动子或最小启动子包含用于可操作连接的编码序列的表达所必需的 核苷酸序列，包括TATA盒和转录起点。通过此定义，在缺乏特定的序列时核心启动子可以 具有或可以不具有可测定的活性，其可增强活性或赋予组织特异性活性。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述基因构建体的启动子至少包括4个HRE。在该构 建体中的HRE优选为串联重复的方式，最优选的，其中所述启动子位于报告基因的上游。报 告基因的上游是指该启动子序列位于报告基因起始密码子的5'端，甚至更优选地，其中， 本发明的HRE位于报告基因起始密码子上游TATA盒的5'端。在一个优选的实施方案中， 本发明的构建体在图2中示意性地描绘。
[0013] 本发明的另一个优选实施方案涉及其中的HRE是从人类EPO的启动子区衍生的构 建体。
[0014] 在本发明的上下文中本领域技术人员已知的任何报告基因可以被使用和可操作 地连接于上述的HRE元件。常用的报告基因诱导视觉识别的特性通常涉及荧光和发光蛋白 质。实例包括编码水母绿荧光蛋白（GFP)的基因，其导致表达GFP的细胞在蓝色光下发出 绿光，萤光素酶，其催化与萤光素的反应以产生光，以及来自基因 DsRed的红色荧光蛋白。 在细菌中的一个常见报告基因是大肠杆菌IacZ基因，其编码的蛋白质为β -半乳糖苷酶。 这种酶会导致细菌表达该基因，它在包含底物类似物X-gal的培养基上生长时，出现蓝色。 一个可选择的标志物的一个例子，这也是在细菌中的报告基因，是氯霉素乙酰转移酶（CAT) 基因，其赋予对抗生素氯霉素的抗性。类似的标志物已知为脊椎动物细胞系工作。最优选 的在本发明的上下文中是使用萤光素酶，最优选其中所述报告基因是萤火虫荧光素酶。
[0015] 在另一个优选的实施方案中，本发明涉及一种基因构建体，其包括在TATA盒上游 的确切的4倍的人类EPO HRE序列和报告基因。
[0016] 本发明的上述目的另一个方面是通过包含该基因构建体的载体或如本文所述的 核酸序列的载体解决的。在本发明的含义中，载体是核酸，其能够被导入到细胞中。优选的 是由所引入核酸编码的蛋白质在细胞内导入载体时表达。在一个优选的实施方案中，本发 明的载体包括重组载体，质粒，噬菌粒，噬菌体，粘粒，病毒，特别是但不限于：病毒衍生的扩 增子的载体。
[0017] 本发明的上述目的的另一个方面由一个包含所述基因构建体或载体的细胞系解 决，如在本发明的各种实施例中所说明的。所述基因构建体或载体可以瞬时或稳定转染 (或转导）引入所述细胞中。优选的是，用于转染的细胞是脊椎动物，最优选哺乳动物或人 细胞。
[0018] 在一个实施方案中，优选的是，本发明的细胞系包括一个稳定整合的本发明所述 的基因构建体和/或载体。
[0019] 在一个最优选的实施方案中，所述细胞系是一个骨肉瘤细胞系，优选其中所述细 胞系是的Saos_2。
[0020] 在本发明中，发明人使用了人类骨肉瘤细胞系Saos-2,而另一些则使用的ME-180 子宫颈癌细胞系（Invitrogen公司）和NIH-3T3小鼠胚胎成纤维细胞系（Panomics公司）。 也使用了一种老鼠神经胶质瘤细胞系（研宄工具的目录，Emory University)。在本研宄中 筛选了几种人类癌细胞系，包括乳腺癌MCF7,宫颈癌HeLa，肾癌786-0和骨肉瘤Saos-2细 胞系。在缺氧诱导下由我们的报告构建体制造的荧光素酶信号在Saos-2细胞中最高。基 于这些新的发现，使用Saos-2进行具有稳定的缺氧报告构建细胞系的开发。
[0021] 还通过测定在细胞中的HIF应答的方法解决上述问题，包括以下步骤：
[0022] a.将根据权利要求1至5中的任一项的基因构建体导入到所述细胞中，
[0023] b.在缺氧条件下培养所述细胞，
[0024] c.可选的，在常氧下培养对照细胞，
[0025] d.确保所述报告基因的表达与所述细胞中的HIF应答的相对应。
[0026] 在这个方面，在另一个优选的实施方案中，所述细胞是骨肉瘤细胞。
[0027] 此外，本发明的实施方式涉及上述方法，其中所述基因构建体转导或转染到所述 细胞，优选其中所述的基因构建体稳定转导或转染到所述细胞中。
[0028] 在本发明的上下文中，术语"缺氧"应指氧（O2)浓度的气氛介于0和5% O2之间， 优选0. 01至1 %的O2，更优选为0. 01和之间0. 3% O2。在一个最优选的实施方案中缺氧是 指氧的浓度约〇. 3 % O2。
[0029] 另一方面，在本发明的上下文中，术语"常氧"应表示氧的浓度介于5至21% O2，优 选为10~21% O2，更优选10至20% O2。在一个最优选的实施方案中，"常氧"指的是正常 大气中的氧浓度。
[0030] 本发明的问题进一步通过用于识别的HIF应答的调节剂的筛选方法解决，包括， 执行本发明的上述方法，并将所述细胞与被怀疑是HIF信号调节剂的化合物接触，其中，相 比于未处理的对照基因，报告基因表达的升高表明所述化合物是缺氧诱导因子应答的激动 剂，并且其中相比于未处理的对照基因，报告基因表达的降低表明该化合物是缺氧诱导因 子应答的拮抗剂。
[0031] 用于本发明的上下文中的合适的试验化合物为包括在化合物文库中的小分子。可 替代地，蛋白质或肽都可以使用。
[0032] 而且，核酸分子可以用作本文所述的筛选方法的候选化合物。在这些中，抑制性 RNAs是特别令人感兴趣的。其可能是RNA诘抗剂（antagomirs)，单链RNA，双链RNA或反义 RNAs。抑制剂RNA分子可以在适用于高通量形式筛选方法的库中购得。
[0033] 此外，本发明提供了由上述筛选方法得到的调节缺氧应答的化合物。
[0034] 在另一个方面，本发明涉及一种用于在细胞中测试HIF应答的试剂盒，包含基因 构建体、或载体、或根据本发明的任何本文所述的实施方案的一个细胞的试剂盒。
[0035] 任选的，本发明的试剂盒可以包括如何执行本发明的方法的说明书和/或缓冲剂 和/或用于执行HIF应答测试的溶液。
[0036] 此外，本发明涉及如本文中所示的本发明的材料的应用，具体地说，本发明的基因 构建体、载体、细胞或试剂盒在HIF介导的应答或缺氧诱导的应答的调节剂的筛选方法中 的应用。
[0037] 虽然本发明已经根据其某些优选实施例进行了特异性的描述，在概括的解释和等 效构型的原则和范围内，以下实施例仅用于说明本发明，而并非意在限制本发明。
【附图说明】
[0038] 图1 :从ATCC获得的Saos-2细胞显示典型的上皮