三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用的制作方法

专利名称：三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用的制作方法
技术领域：
本发明涉及三突变型低氧诱导因子Id基因治疗领域。更具体地，本发明提供一 种利用三突变型低氧诱导因子Ia基因促进血管新生的方法，包括三突变型低氧诱导因 子Ia基因的构建，含有三突变型低氧诱导因子Ia基因的载体的构建，特别是重组腺病 毒载体的构建；该三突变型HIF-I α蛋白质，能够与CREB结合蛋白/腺病毒ElA相关蛋白 P300(CBP/p300)以及组蛋白去乙酰酶(HDAC)等辅助激活因子结合促进血管内皮生长因子 (VEGF)等HIF-I α下游靶基因的表达，以及它们作为冠心病、外周动脉缺血性血管疾病以 及间歇性跛行等的治疗剂应用。
背景技术：
缺血性血管疾病(冠心病、缺血性脑血管病以及外周血管病)已成为威胁人类健 康的重大疾病。我国缺血性血管疾病发病率和死亡率呈逐年上升趋势。目前，对其主要治 疗措施包括常规药物治疗、血运重建等，已经取得了重大成就。然而，相当一部分患者目前 的药物治疗难以见效，也不适于常规血运重建术处理，因此必须开辟新的治疗途径。近年来，促血管新生已成为缺血性血管疾病的治疗新方向，是当前国际上最热 点研究领域之一。先前曾报道了许多促血管新生因子，如血管内皮生长因子(VEGF)、 Fltl(VEGF-rec印tor)、成纤维生成因子(FGF)、血小板衍化生长因子(PDGF)、Endogl in、 转化生成因子β (TGF-β)和血管生成素(angiopoietin)等。有些因子曾试用于临床， 比如VEGF，但结果显示VEGF可导致新生血管不成熟、组织水肿及血管渗漏，因而其临床试 验已停止(Lee, Springer et al. 2000 ；Schwarz, Speakman et al. 2000 ；Grines, Watkins et al. 2002 ；Losordo, Vale et al. 2002 ；Masaki, Yonemitsu et al. 2002 ；Fam, Verma et al. 2003；Lee, Rentz et al. 2003 ；Semenza 2003)。血管新生是组织对缺氧的适应性反应，广泛存在于从胚胎发育、伤口愈合到肿瘤 生长等生理/病理过程中；同时，它是一个复杂的生物学过程，需要多种因子参与，依靠单 一的促血管新生因子很难完成。近10年研究显示低氧诱导因子1 (hypoxia inducible factor 1，HIF-1)是一个非常重要的核转录因子，能直接或间接调控100多种下游靶基 因(review in(ffenger, Stiehl et al. 2005 ；Ke and Costa 2006))，这些下游靴基因包 括血管生长、血管张力、糖代谢、红细胞生成、干细胞诱导分化等(Kaluz，Kaluz0va et al.2008)。到目前为止，已查明经HIF-I α直接调控参与血管新生的基因有30多种，是血 管新生的上游核心调控因子(Thurston, Suri et al. 1999 ；Bruick and McKnight 2001 ； Semenza 2002 ；Hirota and Semenza 2005)。〈〈Science〉〉曾经发表评述"Discovery of these could open up new therapeutic possibilitiesfor the many diseases such as ischemic heart disease and stroke" (http://www. sciences ignaling.org/cgi/ content/abstract/sigtrans ；2001/108/tw418)，因此，HIF-I α 是一个十分有应用前景的 治疗血管新生的功能基因。
HIF-I是由α和β两个亚基组成的异二聚体(Wang，Jiang et al. 1995)，α 亚基为其功能活性发挥的关键性调节亚基，组织中HIF-I α的量与活性受氧浓度的调节。 HIF-I α g丰勾_中Lfi 1 ! P華角军g (OxygenDependent Degradation Domain, ODDD), % HIF-I α的稳定性有关(Pugh，0' Rourke et al. 1997)。同时HIF-1 α的C末端含有2个相 对独立的转录激活区(Transactivation Domains, TAD) :N_TAD 和 C-TAD (Ruas，Poellinger et al. 2002)，其中N-TAD与ODDD有部分重叠，参与HIF-I α稳定性的调节；C-TAD则与共 激活因子CBP/P300结合启动下游靶基因的转录(Lando，Peet et al. 2002)。HIF-I α稳定性调节主要与ODDD区上ft~o402以及Pro5642个脯氨酸残基羟基 化有关(Ivan，Kondo et al. 2001)。常氧情况下，ftx)402和/或ft~o564被脯氨酸羟化酶 (prolyl hydroxylase domain, PHD)羟化后，HIF-I α与ρVHL泛素Ε3连接酶结合经泛素 途径降解，故HIF-I α在常氧下的半衰期很短，约l-2min，5min即可全部降解(Salceda and Caro 1997)；低氧时，PHD功能受到抑制，HIF-I α不被降解因而变得稳定，稳定的HIF-I α 与HIF-Ιβ结合后，从胞浆转位到核内。机体对HIF-I α的氧依赖的调节是双重调节(Pugh and Ratcliffe 2003)，除了前述稳定性调节以外，更稳重要的是HIF-I α转录活性调节。常 氧情况下，C-TAD结构域内803位点上的天门冬酰胺(Asn8tl3)在HIF-I α抑制因子(factor InhibitingHIF, FIH)作用下羟化，故即使稳定的HIF(半衰期内，< 2-5min)转位到核内 后，因HIF-I α的C-TAD不能与转录共激活因子CBP/P300结合，转录活性由此受到抑制； 低氧时，FIH功能受到抑制，不能有效的催化结构域内Asn8tl3羟基反应，从而使CBP/300与 非羟化的C-TAD结合激活下游靶基2因转录(Hewitson，McNei 11 et al. 2002 ；Masson and Ratcliffe2003)。目前报道的 HIF-I α 的亚型有 HIF-I α WT，HIF-1 α FL, HIF-1 α 736, HIF-1 α 557， HIF-I α 516, HIF-I α 785 (Lee, Bae et al. 2004 ；Gaber, Dziurla etal. 2005)以及 HIF-I α 390 (Vincent, Shyu et al. 2000)等。突变型 HIF-1 α 缺乏部分或者全部 ODDD 或 /和C-TAD，故稳定性和/或转录活性明显降低。Chun等先后实验证实(Chun，Choi et al. 2000 ；Chun, Choi et al. 2001 ；Chun, Choi et al. 2002)因 HIF-1 α 736、HIF_1 α 557 以及 HIF-I α 三种缺陷型缺乏C-TAD结构域，突变型HIF-I α虽能与HIF-Ιβ结合从胞浆转 位到核内，但是其转录活性明显低于HIF-I α ffT,HIF-I α FL,VEGF的表达不足HIF-1 α WT以及 HIF-I α FL的1/3。突变型HIF-1 α 785含有C-TAD结构域，故其虽保留了转录活性；但是其 ODDD结构域缺陷(ΑΑ512_554)，并不能增加其在常氧下的稳定性(Je0ng，Bae et al. 2002)。另 一方面，HIF-I α作为一个核转录因子能调控如此众多的下游靶基因参与血管新生过程取 决于HIF-I α的TAD区与转录辅助激活因子的共同作用(Herzig，Long et al. 2001 ；Yoon, Puigserver et al. 2001 ；Hermanson, Glasset al. 2002 ；Kasper, Boussouar et al. 2002 ； Liu, Auboeuf et al. 2002 ；ffu, Qin et al. 2002)。目前已明确与 HIF-1 α TAD 区的转录活 性绝对的需要辅助激活因子有CREB结合蛋白/腺病毒ElA相关蛋白P300(CREB binding protein/p300,CBP/p300)的辅助(Kasper，Boussouar et al. 2005)。此外，组蛋白去乙酰酶 (histone deacetylase, HDAC)亦在该过程起重要作用(Kasper, Boussouar et al. 2005)， 说明基因序列的完整性是其功能正常发挥的基础。我们力图在保留HIF-I α基因结构完整性的基础上，通过基因工程技术获得在常 氧条件下能成组表达且具有高效的转录活性HIF-I α，从而使HIF-I α常氧条件下具有促血管新生潜能，进一步开发出安全、稳定、高效的促血管新生的基因治疗药物。

发明内容
本项发明是以野生型HIF-I α在低氧条件下具有稳定性和高转录活性的特点为 基础。HIF-2ci以及HIF-3ci与HIF-I α具有相似的基因和蛋白结构以及生物学功能，故在 本发明中主要阐述HIF-I α。一方面，本发明是以野生型HIF-I α蛋白质的结构以及功能为基础。本发明提供 的野生型HIF-I α蛋白质是人HIF-I α蛋白质，是由SEQ ID NQ :2所编码的蛋白质。在一 个实施例中，在野生型HIF-I α蛋白质氨基酸序列中，第402位上的氨基酸残基是脯氨酸残 基(Pro 402)、第564位上的氨基酸残基是脯氨酸残基(Pro 564)、第803位上的氨基酸残 基是天门冬酰胺残基(Asn 803)；野生型HIF-I α蛋白质可以是天然存在的HIF-I α蛋白 质(例如SEQ ID NQ :2所编码的蛋白质)，也可以是与天然存在的HIF-I α蛋白质具有相 似结构且具有HIF-I α生物学功能的通过生物工程技术人工合成的相关蛋白质。本发明所述三突变型HIF-I α蛋白质与野生型HIF-I α蛋白质相比，该三突变型 HIF-I α蛋白质氨基酸序列上第402位上的脯氨酸残基(Pro 402)，第564位上的脯氨酸残 基(Pro 564)以及第803位上的天门冬酰胺残基(Asn 803)均发生突变。所述突变可以是 替代或者缺失，优选是替代。在优选的实施例中，三突变型HIF-I α蛋白质是由SEQ ID NQ: 1所编码的蛋白质。在三突变型HIF-I α蛋白质氨基酸序列中，第402位上的脯氨酸残基 (Pro 402)被替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)；第564位上的脯氨酸残基(Pro 564)被替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)；第803位上的天门冬酰胺残基(Asn 803)被替代为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)；在优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-I α蛋白质在常氧条件下能明显促 进下游靶基因(例如促血管新生基因VEGF、PLGF, PAI-I、PDGF, Ang-I以及Ang_2等)表 达，与低氧条件下野生型HIF-I α蛋白质转录活性相比，该三突变型HIF-I α蛋白质在常氧 条件下具有高效的转录活性。在另一个优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-I α蛋 白质，与野生型HIF-I α蛋白质相比，其通过与辅助激活因子CBP/p300或/和HDAC结合， 来促进促进下游靶基因(例如促血管新生基因VEGF、PLGF、PAI-I、PDGF，Ang-I以及Ang-2 等)表达。在另一个优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-Ια蛋白质，与野生型 HIF-I α蛋白质相比，能明显增加下游靶基因(例如促血管新生基因VEGF、PLGF、PAI-I以 及PDGF等)的在常氧条件下的稳定性。在另一个优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-Ια蛋白质，与野生型 HIF-I α蛋白质相比，能明显促进形成成熟的具有功能的新生血管(例如促进内皮细胞增 殖、黏附、迁移以及降低新生血管渗漏)。另一方面，本发明提供编码本发明中所述野生型HIF-Ια蛋白质以及三突变型 HIF-I α蛋白质的核酸序列。在一个实施例中，本发明所述野生型HIF-I α核苷酸序列编码由拟6氨基酸残基 组成的野生型HIF-I α蛋白质。在野生型HIF-I α核苷酸序列SEQ ID NQ :2中，与编码第 402位上的脯氨酸残基相对应的密码子是CCk,与编码第564位上的脯氨酸残基相对应的密码子是CCC，与编码第803位上的天门冬酰胺残基相对应的密码子是AAT。在优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-I α核苷酸序列编码由拟6氨基酸 残基组成的三突变型HIF-I α蛋白质。在三突变型HIF-I α核苷酸序列SEQ ID NQ :1中， 编码第402位上的脯氨酸残基的密码子由CCA替代为其他密码子(例如GCA)，编码第564 位上的脯氨酸残基的密码子由CCC替代为其他密码子(例如GCC)，编码第803位上的天门 冬酰胺残基的密码子由AAT替代为其他密码子(例如GCT)。在其他实施例中，本发明指向至少中等度严紧条件下与本文提供的核苷酸、或其 片段、或其互补序列能够杂交的核苷酸。在核酸杂交反应时，根据核酸的性质，长度，高度的 互补性，核苷酸序列组成来确定其严紧程度。典型地，“杂交条件”根据测量杂交时所用的 “严紧性”程度来分类。严紧性程度可以以例如核酸结合复合物或者探针的解链温度(Tm) 为依据。例如，“最大严紧性”典型地发生在约Tm-5°C (低于探针Tm 5°C )；“高等严紧性” 发生在约Tm以下约5 10°C;“中等严紧性”发生在约Tm以下约10 20°C;“低等严紧性” 发生在约Tm以下约20 25°C。作为替代，或者进一步地，杂交条件可以以杂交的盐或者离 子强度条件和/或依次或多次的严紧性洗涤为依据。例如，6XSSC=极低严紧性；3XSSC =低至中严紧性；IXSSC =中等严紧性；0.5XSSC=高等严紧性。从功能上说，可以采用最 大严紧性条件确定与杂交探针严紧同一或近严紧同一的核酸序列；而采用高等严紧性条件 确定与该探针有约80%或更多序列同一性的核酸序列。对于要求高的选择性应用，典型地期望采用相对严紧的条件来形成杂交体，例如 选择相对低的盐和/或高温条件。Sambrook等(Sambrook，J等《分子克隆——实验室手 册》，Cold Spring Harbor Press, Plain-view, N. Y.)提供了中等严紧性和高等严紧性在内 的杂交条件。本发明中所涉及的核酸与其他核酸分子杂交的高等严紧性实验条件为在 2XSSC.0. 1% SDSUmM EDTA(pH = 8. 0)以及室温条件下杂交，继而分别在低严紧条件 (2XSSC.0. 1% SDS以及室温)、中严紧条件(0. 2XSSC、0. 1% SDS以及42°C )、高严紧条 件(0. 2X SSC以及68°C )条件下洗涤10 15分钟。本领域技术人员应当理解，然而，如上 所述，最佳条件会有所不同，依具体的杂交反应根据相关实验经验来确定。在优选的实施例中，本发明所述三突变型HIF-I α核苷酸序列编码的三突变型 HIF-I α蛋白质，与野生型HIF-I α核苷酸序列编码的野生型HIF-I α蛋白质相比，三突 变型HIF-I α核苷酸序列能更稳定、更高水平的表达HIF-I α蛋白质，而这种三突变型 HIF-I α蛋白质与野生型HIF-I α相比具有更高的促进下游靶基因转录的活性。在另一方面，本发明提供包含本发明的核酸分子载体，优选是病毒载体，更优选是 腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。本发明还提供包含野生型HIF-I α编码核酸的腺病 毒载体，特别是5型腺病毒载体。在一个实施例中，本发明所述载体是能够表达三突变型HIF-I α核酸序列的表 达载体，与含有野生型HIF-I α核酸序列的表达载体相比，能够更稳定，更高水平的表达 HIF-I α蛋白质，而这种三突变型HIF-I α蛋白质与野生型HIF-I α相比具有更高的促进下 游靶基因转录的活性。在另一方面，本发明提供含有本发明核酸分子或者本发明的宿主细胞。宿主细胞 可以是动物细胞、植物细胞和微生物(包括真菌以及细菌等)等。
在另一方面，本发明提供含有本发明三突变型HIF-I α蛋白质、或本发明三突变 型HIF-I α核苷酸序列、或本发明载体的组合物。本发明组合物优选是药物组合物，优选还 含有药用助剂。如赋形剂。更优选的，所述组合物是用于治疗缺血性疾病的药物组合物， 该药物组合物优选可以被配置成注射液或者冻干粉针。或者，该组合物可以是促进血管新 生或改善缺血的药物组合物，所述药物组合物是用于提高常氧条件下HIF-I α蛋白质表达 水平，或延长HIF-I α蛋白质半衰期，以及增强HIF-I α蛋白质转录的组合物。在另一方面，本发明提供含有本发明三突变型HIF-I α蛋白质、或本发明三突变 型HIF-I α核苷酸序列、或本发明载体在制备用于治疗缺血性疾病以及可以是促进血管新 生或改善缺血的药物用途。在另一方面，本发明提供含有本发明三突变型HIF-I α蛋白质、或本发明三突变 型HIF-I α核苷酸序列、或本发明载体在制备用于提高常氧条件下HIF-I α蛋白质表达水 平，或延长HIF-Ια蛋白质半衰期，以及增强HIF-I α蛋白质转录的药物中的用途。本发明构建了表达人HIF-I α基因的重组腺病毒载体，为采用HIF_1 α转基因治 疗缺血性疾病(冠心病、外周血管疾病以及间歇性跛行)奠定了基础。本发明构建的重组人 HIF-I α基因腺病毒载体是El区复制缺陷型腺病毒El区基因是腺病毒复制所必需的基因， 该区编码的蛋白主要作用是激活其他病毒基因的转录，对有关细胞基因的转录也有明显的 调控作用，El区的功能由辅助细胞反式提供，最常用的辅助细胞是293细胞，是由人胚胎肾 细胞经Ad5DNA片断转染后发生转化而形成的，其基因组中整合了含有腺病毒El区的片段， 可持续表达El区蛋白，用于增殖El区缺失的腺病毒载体。因此这就决定了复制缺陷型腺 病毒在靶细胞中只有一次感染机会而无复制能力，从而完成腺病毒载体的功能，避免腺病 毒本身对靶细胞的损害，达到安全转移基因之目的。


为了让上述发明的特征、优势、目的以及其他方面的阐述更加的明晰，上述发明简 述包含的详细内容有可能在附图/表中得到有关说明。这些附图/表成为发明详细内容的 一部分。需要值得注意的是，这些附图/表仅是对本发明内容的进一步解释说明，因此对本 发明的范围不构成任何限制。图1、pcDNA3. l/V5_HisA结构示意图及其多克隆位点。图2、pcDNA3. 1(+)结构示意图及其多克隆位点。图3、穿梭质粒pamttle2结构示意图及其多克隆位点。图4、腺病毒骨架质粒pAdeno-X Viral DNA结构示意图及其酶切位点。图 5、腺病毒表达系统 Adeno-X Adenoviral Expression System 1 构建流程图。图6、重组 pcDNA3. 1(+)-HIF-Ianative 质粒以 Kpn I、Xba I 作单、双酶切鉴定图。 1 :pcDNA3. l/V5-HisA-HIF-l α 经 Xba I 单酶切；2 :pcDNA3. l/V5-HisA-HIF_l α 经 Kpn I、Xba I 双酶切；M :DL15000 Marker。图 7、pcDNA3. 1 (+)酶切图。1 :pcDNA3. 1 (+)；2 :pcDNA3. 1(+)Kpn I、Xba I 双酶切。
M :DL15000 Marker ；图8、重组 pShuttle2-HIF_lanative 质粒作 Nhe I、Apa I 单、双酶切鉴定图。1 :pcDNA 3. 1 (+) -HIF-I α native ；2 :pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α native 经 Apa I, Nhe I 双酶切；3 :pShuttle2 经 Apa I、Nhe I 双酶切。M :DL15000 Marker ；图9、重组穿梭质粒pShuttle2-HIF-l α native测序结果。图9A 402位点；图9B :564位点；图9C :803位点；图10、重组穿梭质粒 pShuttle2-HIF_l α -Ala402-Ala564-Ala803 经 BspT104I、Age I单、双酶切鉴定图。1 :pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 经 BspT104I 单酶切；2-3 :pShuttle2HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 经 BspT104I、Age I 双酶切；4 :DL2000 Marker ；5 :DL15000 Marker。图11、重组穿梭质粒 pShuttle2-HIF_l α -Ala402-Ala564-Ala803 测序结果。图IlA 402 位点；图 IlB :564 位点；图 IlC :803 位点；图12、重组穿梭质粒 pShuttle2-HIF_l α -Ala402-Ala564-Ala803 经 Pl-SceI、I-CeuI 双酶切。M:DL15000Marker ；1 :pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 经 ΡΙ—Sce I、I-CeuI 双酶切。图13、pAdeno-HIF-1 α native 经 Xho I 酶切鉴定。1 :pAdeno-HIF-l α native.2 :pAdeno-HIF-l α nativediges ted by Xho I.M λ -Hind III digest.图14、pAdeno-HIF-1 α native 经突变区引物 PCR 鉴定。1 :pAdeno-HIF-l α nativePCR 产物(引物 l、2，380bp)；2 :pAdeno-HIF-l α nativePCR 产物(引物 3、4，460bp)；3 :pAdeno-HIF-l α nativePCR 产物(引物 5、6，214bp)；图15、pAdeno-HIF-1 α native 经 BD. Clontech 所提供引物 PCR 鉴定(引物 A、B)。图 16、pAdeno-HIF-1 α -Ala402-Ala564-Ala803 经 Xho I 酶切鉴定。1 :pAdeno-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 ；2 :pAdeno-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803 经 Xho I 切；3 :Marker λ -Hind III ；图17、pAdeno-HIF-1 α -Ala402-Ala564-Ala803 经突变区引物 PCR 鉴定。M :Marker I ；1 :PShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803PCR 产物(引物 A、B, 287bp)；2 :pShuttle2-HIF-l α -Ala4ci2-Ala564-Ala8ci3PCR 产物(引物 l、2，380bp)；3 :pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564-Ala803PCR 产物(引物 3、4，460bp)；4 :pShuttle2-HIF-l α -Ala4ci2-Ala564-Ala8ci3PCR 产物(引物 5、6，214bp)；
图18、三突变HIF-I α在常氧条件下的表达以及其对下游促血管新生基因的转录 活性。图18Α =HIF-I α的mRNA的表达水平；图18B
VEGF的mRNA的表达水平；图18C =PLGF的mRNA的表达水平；图18D =PAI-I的mRNA的 表达水平；图18E =PDGF的mRNA的表达水平；图19、三突变HIF-I α常氧条件下的稳定性以及其对下游促血管新生基因的稳定 性的影响。图19Α =HIF-I α的半衰期；图19Β =VEGF的半衰期；图19C =PLGF的半衰期；图 19D =PAI-I的半衰期；图19Ε =PDGF的半衰期；图20、三突变HIF-I α基因在常氧条件下的促血管新生作用。图20Α 三突变型 HIF-I α对HMVEC-L细胞增殖的影响；图20Β 三突变型HIF-I α对HMVEC-L迁移的影响； 图20C 三突变型HIF-I α对HMVEC-L管样形成能力的影响；图20D-E 三突变型HIF-I α对 HMVEC-L血管渗漏的影响。图21、辅助激活因子08 / 300在!1正-1(1诱导的促血管新生基因转录中的作用。图2IA =VEGF的mRNA的表达水平；图21B =PLGF的mRNA的表达水平；图21C =PAI-I 的mRNA的表达水平；图21D =PDGF的mRNA的表达水平；图22、辅助激活因子HDAC在HIF-I α诱导的促血管新生基因转录中的作用。图22Α =VEGF的mRNA的表达水平；图22B =PLGF的mRNA的表达水平；图22C =PAI-I 的mRNA的表达水平；图22D =PDGF的mRNA的表达水平；图23、辅助激活因子CBP/p300和HDAC在HIF-1 α诱导的促血管新生基因转录中 的作用。图23Α =VEGF的mRNA的表达水平；图2!3B =PLGF的mRNA的表达水平；图23C =PAI-I 的mRNA的表达水平；图23D =PDGF的mRNA的表达水平；
图24、病毒滴度测定(终点稀释实验法)示意具体实施例实施例1三突变型HIF-I α重组腺病毒载体的构建1、重组 pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α native 的构建(1)、以 Kpn I、Xba I 酶切 pcDNA3. l/V5-HisA-HIF_l α native,用 Omega 凝胶回收 试剂盒(具体步骤参照试剂盒使用说明)胶回收目的基因片段(HIF-1 α nativecDNA片段)， 约2500bp大小，回收后取适量进行琼脂糖凝胶(1% )电泳，其结果见图6。酶切反应体系如下
pcDNA3. l/V5-HisA-HIF-l α native约 μ g
Kpn I1 μ L
Xba I1 μ L
IOXM酶切缓冲液2μ L
加灭菌去离子水至总体积为20 μ L
(2)、同以上方法以Kpn I、Xba I双酶切pcDNA3. 1 (+)，胶回收线性化pcDNA3. 1 (+)
片段(方法同HIF-I α nativecDNA片段的回收)，约MOObp大小，回收后取适量进行琼脂糖凝 胶(1%)电泳，其结果见图7。 (3)、将获得的HIF-I α nativecDNA片段以及pcDNA3. 1⑴片段在T4DNA连接酶的作用下连接重组为pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α
连接反应体系
native° HIF-I α
native
cDNA片段
6 μ LpcDNA3. 1 (+)片段IOXligase BufferT4 DNA ligase (5ffeiss u/μ L)总体积16 °C
2μ L 1 μ L 0. 5μ L 10. 0μ L 10-12h(4)、将连接产物转化感受态DH5 α，涂布到氨苄青霉素抗性固体培养基平皿。转化 的具体步骤①、取200 μ L贮存于_70°C感受态DH5 α，冰浴融化。②、加入上述连接产物10 μ L，轻轻混勻，冰浴20_30min。③、于42°C水浴中热休克90s，迅速转移至冰浴中，继续冰浴2-aiiin。④、加入LB液体培养基200 μ L，于37°C缓慢振摇培养45min (约100转/min)。⑤、将培养物适量涂于氨苄青霉素抗性琼脂LB平板(约50 100 μ L/平板)，待 平板表面没有液体流动时，37°C孵箱倒置培养12-1他。(5)、重组子筛选及质粒提取，具体步骤如下①无菌接种环挑取平板上生长的中等大小的单菌落约3 5个，分别接种于约5ml 左右的氨苄抗性LB液体培养基，37°C振摇培养(约200转/分)过夜后，各取菌液IOyL 行菌液PCR鉴定，余则暂置于4°C保存。②引物为HIF-I α突变1区或/和突变2区或/和突变3区片段引物，PCR反应 体系及程序如下PCR反应体系菌液10. OyL引物1 或 3 或 5(10D/500yL)2. 0 μ L引物2 或 4 或 6(10D/500y L)2. 0 μ LdNTP4. 0μ L
TaqDNA 聚合酶 0· 25 μ L10 X PCR 缓冲液5. OyL加灭菌去离子水至总体积为50. OyLPCR 反应程序94°C 2min — 94°C 30s — 52°C 30s 72°C Imin — 94°C 30s共30个循环。附引物序列如下①突变1区(Pro402)片段引物上游引物(Primer1) 5' -AGCACGACTTGATTTTCTCCC-3‘下游引物(Primer2) 5' -TTCTTGATTGAGTGCAGGGT-3‘PCR产物片段长380bp②突变2区(Pro564)片段引物上游引物(Primer3) 5' -GACACAGAAGCAAAGAACCC-3‘下游引物(Primer4) 5' -TCAAAGCGACAGATAACACG-3‘
720C Imin — 72°C 5min，其中
PCR产物片段长460bp③突变3区(Asn803)片段引物上游引物(Primer5) 5' -CCAGACGATCATGCAGCTAC-3‘下游引物(Primer6) 5' -GGTTTCTGCTGCCTTGTATAG-3‘PCR产物片段长214bp备注上述所有引物均按照说明书配制成终浓度lOpmol/μ L。③将PCR反应产物各取5 μ L进行琼脂糖凝胶(1.5 2%)电泳，紫外灯下观察电 泳结果正确后(不保存该电泳结果)，取PCR鉴定正确的菌液Iml接种于100 200ml左右 的氨苄青霉素抗性LB液体培养基，37°C振摇培养过夜。④用Omega质粒提取试剂盒提取重组pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α质粒质粒(具体步骤 参照试剂盒使用说明)。(6)、重组 pcDNA3. 1 (+)-HIF-I α native 质粒酶切鉴定。以 Kpn I、XbaI 对所提重组 质粒作单、双酶切鉴定(酶切方法同前)2、重组穿梭质粒 pShuttle2-HIF_l α native 的构建(1)、以 Nhe I, Apa I 双酶切 pcDNA3. 1 ⑴-HIF-l α native，具体步骤如下①先以Apa I单酶切获得线性化的pcDNA3. 1 (+)-HIF-I α native，Apa I单酶切反应 体系如下Apa I单酶切反应体系pcDNA3. 1 (+) -HIF-I α native 约 1· O μ gApa Il.OyL10XL酶切缓冲液2. OyL加灭菌去离子水至总体积为20. OyL酶切约2_3h②、乙醇沉淀法获得Apa I单酶切产物，方法如下a.在酶切产物中加入TE 80 μ L，再加入无水乙醇200 μ L、3Μ 醋酸钠 10yL、糖原 lyL。b.充分摇动混勻，4°C下14000rpm离心5min。c.小心弃去上清，此时可见有少量白色沉淀物。d.小心加入300 μ L 75%乙醇，室温下14000rpm离心2min。e.小心吸弃上清，室温约IOmin自然风干(可置超净台内)，避免过度干燥。f.以 15 μ L TE 重新溶解 DNA,即已线性化的 pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α。③、再Nhe I单酶切线性化的pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α native, Nhe I单酶切反应体系 如下Nhe I单酶切反应体系线性化pcDNA3. 1 (+) -HIF-1 α native 约 1· 0 μ gNhe Il.OyLIOXM酶切缓冲液2. OyL加灭菌去离子水至总体积为20. OyL酶切约2_3h
④、酶切产物行琼脂糖凝胶(1%)电泳，胶回收HIF-I CinativeCDNA片段，方法同前， 其结果见图8。O)、以Nhe I、Apa I先后酶切pShuttle2质粒，方法同上，对线性化pShuttle2作 胶回收，以完全去除pShuttle2质粒双酶切后的多克隆位点内小片段DNA，其结果见图8。(3)、连接重组pShuttle2-HIF-lanative，连接产物转化感受态DH5a，重组子筛选 及重组pShuttle2-HIF-l a native质粒提取。方法同前，只是在抗性筛选时改用卡那霉素，终 浓度为50μ g/mL。(4)、重组pShuttle2-HIF-l α native质粒作Nhe I和Apa I单、双酶切鉴定，将酶切 产物进行琼脂糖凝胶(1. 5 2% )电泳，紫外灯下观察电泳结果正确后(不保存该电泳结 果)，取0. 5-1 μ L质粒用HIF-I α突变区片段引物作PCR鉴定，并将PCR产物送基因测序公 司(博亚)测序，测序结果见图9。 3、在pShUttle2-HIF-lanative基因序列的基础上运用 定点突变技术构建 pShuttle2-HIF-l α -Ala402-Ala564_Ala803(1)、将HIF-I α native基因序列上编码HIF-I α native蛋白质第402位脯氨酸残基 (Pro)的密码子CCA突变为丙氨酸(Ala)密码子GCA，反应体系如下
权利要求
1.三突变型HIF-Ια蛋白质是由1-拟6个氨基酸残基组成[SEQID NO. 1编码的蛋 白质]，包含氧依赖降解结构域(ODDD)以及转录激活区(TAD)这两个重要的功能区，其中 ODDD区内第402位上的脯氨酸(ftx))残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，和 第564位上的脯氨酸(ftx))残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)，以及TAD区内 第803位上的天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基(例如丙氨酸)。
2.权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质在常氧条件下的稳定性不再受脯氨酸羟化 酶(PHD)的调控，从而使其在常氧条件下的稳定性不低于野生型HIF-I α蛋白质[SEQ ID NO. 2编码的蛋白质]在低氧条件下的稳定性。
3.权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质在常氧条件下的转录活性不再受HIF-I抑制 因子(FIH-I)的调控，从而其在常氧条件下也具有高效的转录活。
4.权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质，能够与CREB结合蛋白/腺病毒ElA相关 蛋白P300(CBP/p300)以及组蛋白去乙酰酶(HDAC)等辅助激活因子结合促进血管内皮生长 因子(VEGF)、胎盘生长因子(PLGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、纤溶酶原激活物抑制因 子-I(PAI-I)等HIF-I α下游靶基因的表达。
5.编码权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质是三突变型HIF-I α核酸分子[SEQ ID NO. 1中的核酸分子序列]。
6.权利要求5的三突变型HIF-Iα核酸分子，与野生型HIF-I α核酸分子[SEQ ID NO. 2中的核酸分子序列]相比，其编码的三突变型HIF-I α蛋白质在常氧条件下更稳定且 更高的表达水平，该HIF-I α蛋白质与野生型HIF-la蛋白质相比在常氧条件下具有更高 的转录活性。
7.含有权利要求1所述的三突变型HIF-Iα核酸分子的表达载体，优选是病毒载体， 更优选是腺病毒载体，特别是5型腺病毒载体。
8.权利要求7的载体，其是能够表达权利要求6-7的三突变型HIF-Iα核酸分子的表 达载体；优选地，该表达载体与含有野生型HIF-I α蛋白质编码核酸分子的相同载体相比， 能够更稳定、更高水平表达HIF-I α蛋白质；该HIF-la蛋白质优选与野生型HIF-I α蛋白 质相比具有提高的转录因子活性。
9.含有权利要求2中载体的宿主细胞，可以是原核细胞，也可以是真核细胞。
10.提高HIF-Iα蛋白质在常氧条件下的稳定性或者表达水平、和/或提高HIF-I α 蛋白质的转录活性的体外方法，包括同时将野生型HIF-I α蛋白质(优选人HIF-la蛋白 质)分子序列中第402位点、第564位点上的脯氨酸(ftx))残基突变为其他任何氨基酸残 基(例如丙氨酸)，以及第803位上的天冬酰胺(Asn)残基突变为其他任何氨基酸残基(例 如丙氨酸)，其与野生型HIF-I α蛋白质相比，该三突变型HIF-I α蛋白质第402位、第564 位和第803位点上的氨基酸发生了突变，使得该三突变型HIF-I α蛋白质在常氧条件下的 稳定性或者表达水平与野生型HIF-I α蛋白质相比提高了，以及该三突变型HIF-I α蛋白 质的转录活性与野生型HIF-I α蛋白质相比也提高了。
11.提供HIF-Iα核酸分子呈成组型表达的体外方法在允许权利要求1所述三突变 型HIF-I α核酸分子表达的条件下，用该核酸分子转染细胞，从而使核酸分子呈成组型表 达。
12.提高HIF-Iα核酸分子表达的体外方法，在允许权利要求7中载体所携带的核酸分子表达的条件下，通过该载体介导权利要求1的三突变型HIF-I α核酸分子转染细胞，从而 增加HIF-I α核酸分子在该细胞中的表达。
13.提供一个减轻低氧或缺血所导致组织损伤的方法在机体的低氧或缺血部位给 予有效剂量的权利要求1所提供的三突变型HIF-I α核酸分子，该核酸分子由药学上可接 受的载体所介导，从而减轻低氧或缺血所导致的组织损伤。
14.权利要求13所述的低氧或缺血所导致组织损伤与心、脑，或周围循环障碍密切相关。
15.提供一种在哺乳动物体内促进血管新生的方法给予哺乳动物有效剂量权利要求 1的三突变型HIF-I α蛋白质，或权利要求5的三突变型HIF-I α核酸分子，或者权利要求 7或8的载体的组合物；或/和给予CBP/p300以及CBP/p300的激动剂；或/和给予HDAC 以及HDAC的激动剂。
16.权利要求15中的哺乳动物，优选是人。
17.含有权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-I α核酸 分子、或者权利要求7或8的载体的组合物，特别是药物组合物，优选还含有可药用助剂，如 赋形剂；特别是用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病如外周动脉缺血性血 管疾病以及间歇性跛行)的药物组合物，该药物组合物优选可以被配置成注射液或冻干粉 针。
18.权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-I α核酸分 子、或者权利要求7或8的载体在制备用于治疗缺血性疾病(尤其是冠心病、外周血管疾病 如外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行)的药物中的用途。
19.权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-I α核酸分 子、或者权利要求7或8的载体在制备用于促进血管新生或者改善缺血的药物中的用途。
20.权利要求1的三突变型HIF-Iα蛋白质、权利要求5的三突变型HIF-I α核酸分 子、或者权利要求7或8的载体在制备用于提高HIF-I α蛋白质在常氧条件下的稳定性或 者表达水平、和/或提高HIF-I α蛋白质的转录因子活性的药物中的用途。
全文摘要
本发明的发明名称是三突变型低氧诱导因子1α经其辅助激活因子诱导的血管新生及其运用。本发明涉及三突变型低氧诱导因子1α，其编码核酸，含有三突变型低氧诱导因子1α编码核酸的载体，特别是重组腺病毒载体，以及含有它们的药物组合物。三突变型HIF-1α蛋白质，能够与CREB结合蛋白/腺病毒E1A相关蛋白P300(CBP/p300)以及组蛋白去乙酰酶(HDAC)等辅助激活因子结合促进血管内皮生长因子(VEGF)等HIF-1α下游靶基因的表达。本发明的三突变蛋白质、核酸、载体和药物组合物可用于治疗缺血性疾病的促血管新生治疗，例如冠心病、外周动脉缺血性血管疾病以及间歇性跛行等。
文档编号A61K38/17GK102120764SQ20101001930
公开日2011年7月13日 申请日期2010年1月11日 优先权日2010年1月11日
发明者傅锐斌, 刘城, 吴平生, 宾建平, 王月刚, 童锴, 胡英芳, 谢宜军, 赖艳娴, 郭寿贵 申请人:刘城, 吴平生, 王月刚