含有HIF-1α和HIF-2α表达抑制物质的药物的制作方法

专利名称：含有HIF-1α和HIF-2α表达抑制物质的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有HIF-I α和HIF-2 α表达抑制物质的药物。具体涉及含有可诱导 RNA干扰的核酸等的视网膜疾病的治疗药。
背景技术：
低氧诱导因子1和2(HIF_1和HIF-2)是含有α和β亚单元的杂合二聚体，是 共通具有碱性螺旋-环-螺旋蛋白(bHLH)结构域和PAS结构域的转录因子。细胞内氧浓 度减少，则HIF的表达和转录活性显著增加。已鉴定出由HIF反式激活的靶基因有编码 VEGF(血管内皮细胞生长因子)、促红细胞生成素、葡萄糖转运体、以及糖酵解酶的基因等 (参照非专利文献1)。糖尿病性视网膜病变以及老年性黄斑变性是导致后天失明的原因疾病，目前，人 们需求用于抑制两种疾病中可见的新生血管的药物的开发。特别是已知眼内的VEGF的增 加是诱发新生血管的原因之一，目前正在开发几种VEGF拮抗药。HIF是控制VEGF的表达的 转录因子，HIF抑制剂也有望作为血管新生抑制剂应用。作为HIF抑制剂，使用siRNA进行的研究中报导在HeLa细胞、!fep3B细胞和Kelly 细胞中，通过HIF-I α的siRNA抑制VEGF的表达(参照非专利文献2)。还有报道称乳腺 癌细胞(MDA468)中，只有HIF-I α的siRNA抑制低氧对VEGF表达的诱导，HIF-2 α的siRNA 不抑制(参照非专利文献3)。在该实验体系中，即使使用HIF-I α和2α两种异构体的 siRNA,与只使用HIF-I α的siRNA时相比，只是同程度抑制VEGF的诱导表达。与此相对， 有报道称肾癌细胞(786-0)中，只有HIF-2a的siRNA抑制低氧对VEGF表达的诱导，以及 在具有癌抑制基因VHL(vonHippel-Lindau)的肾癌细胞(Caki-I)中，HIF-Ια和2a的各 自的siRNA抑制VEGF表达(参照非专利文献4)。这样，关于HIF的哪一种异构体与VEGF 产生强烈相关，可认为是根据细胞而不同。目前报道了老年性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变的治疗药使用HIF-Ia的 siRNA或反义(参照专利文献1-3)，但关于HIF-2ci的siRNA和反义的使用，在本发明人所 了解的范围内尚未有报导。也未见报道过如果抑制HIF-I α和HIF-2ci两种异构体，与抑 制一种异构体相比，VEGF生成抑制作用显著提高；可将含有HIF-I α和HIF-2 α两种异构 体的siRNA或反义的组合物用于视网膜疾病。专利文献1 国际公开第2007/002718号说明书专利文献2 国际公开第2004/042024号说明书专利文献3 国际公开第2006/050734号说明书非专利文献1 =Semenza GL(1999)，Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15 :551_578非专利文献2 =Christina W 等人.，(2004) FASEB J12 :1462_1464
非专利文献3 =Heidi MS 等人.，(2004) Cancer Res 63 :6130_6134非专利文献4:Raju RR 等人·，(2005) Molecular and Cellular Biology25 5675-568
发明内容
发明要解决的问题本发明的目的在于在老年性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变等的伴随血管新生 的视网膜疾病的治疗中，提供治疗效果更高的药品。
解决问题的方法本发明人针对上述问题进行了深入的研究，结果发现使HIF-I α的siRNA以及 HIF-2 α的siRNA作用于视网膜色素上皮细胞、抑制两种异构体的表达时，与一种异构体的 siRNA作用的情形相比，可显著抑制VEGF的生成，从而完成了本发明。即，本发明如下所示。[1]视网膜疾病的治疗药，该治疗药含有特异性抑制HIF-I α表达的物质以及特 异性抑制HIF-2ci表达的物质。[2]上述[1]所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述抑制物质是RNAi诱导性核 酸、反义核酸或核酶或者它们的表达载体。[3]上述[2]所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述RNAi诱导性核酸是siRNA。[4]上述[3]所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述HIF-I α的siRNA由含有对 应于SEQ ID NO. 1的碱基序列的mRNA中17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成；上述HIF-2a的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 3的碱基序列的 mRNA中17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成。[5]上述[4]所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述HIF-I α的siRNA是下述(a) 或(b)，HIF-2 α 的 siRNA 是下述(C)或(d)(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-I α表达抑制活性；(b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-I α 表达抑制活性；(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-2ci表达抑制活性；(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-2 α 表达抑制活性。[6]上述[4]或[5]所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述HIF-I α的siRNA为 下述(1-1)-(1_5)的任意一种，HIF-2a的siRNA为下述(2_1)_(2_3)的任意一种(1-1)由含有SEQ ID N0. 5所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 11所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有SEQ ID N0. 6所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 12所示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-3)由含有SEQ ID NO. 7所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 13所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-4)由含有SEQ ID NO. 8所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 14所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-5)由含有SEQ ID NO. 29所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 30所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-1)由含有SEQ ID N0. 9所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 15所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有SEQ ID NO. 10含有所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 16所示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由含有SEQ ID N0. 33所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 34所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA。[7]上述[1]-[6]中任一项所述的视网膜疾病的治疗药，其中，视网膜疾病为老年 性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、 糖尿病黄斑水肿或青光眼。[8]上述[7]所述的视网膜疾病的治疗药，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性或 糖尿病性视网膜病变。[9]特异性抑制HIF-I α表达的物质和特异性抑制HIF-2 α表达的物质在制备视 网膜疾病的治疗药中的应用。[10]上述[9]所述的应用，其中，上述抑制物质是RNAi诱导性核酸、反义核酸或核 酶、或者它们的表达载体。[11]上述[10]所述的应用，其中，上述RNAi诱导性核酸为siRNA。[12]上述[11]所述的应用，其中，上述HIF-I α的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 1的碱基序列的mRNA中17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义 链；上述HIF-2 α的siRNA由含有对应于SEQ ID Ν0. 3的碱基序列的mRNA中17-25个连续 的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成。[13]上述[12]所述的应用，其中，上述HIF-I α的siRNA为下述(a)或(b)， HIF-2 α 的 siRNA 为下述(C)或(d)(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID N0. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-I α表达抑制活性； (b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID N0. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-I α 表达抑制活性；(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-2ci表达抑制活性；
(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-2 α 表达抑制活性。[14]上述[12]或[13]所述的应用，其中，上述HIF-1 α的siRNA为下述 (1-1)-(1-5)的任意一种，HIF-2a 的 siRNA 为下述(2_1)-(2_3)的任意一种 (1-1)由含有SEQ ID NO. 5所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 11所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有SEQ ID NO. 6所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 12所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-3)由含有SEQ ID N0. 7所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 13所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-4)由含有SEQ ID N0. 8所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 14所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-5)由含有SEQ ID N0. 29所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 30所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-1)由含有SEQ ID N0. 9所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 15所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有SEQ ID NO. 10所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 16所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由含有SEQ ID N0. 33所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 34所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA。[15]上述[9]_[14]中任一项所述的应用，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性、 糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、糖尿病黄斑 水肿或青光眼。[16]上述[15]所述的应用，其中视网膜疾病为老年性黄斑变性或糖尿病性视网
膜病变。[17]视网膜疾病的治疗方法，该方法包含以下步骤对需要进行视网膜疾病治疗 的对象给予有效量的特异性抑制HIF-I α表达的物质以及特异性抑制HIF-2 α表达的物 质。[18]上述[17]所述的治疗方法，其中，上述抑制物质是RNAi诱导性核酸、反义核 酸或核酶、或者它们的表达载体。[19]上述[18]所述的治疗方法，其中，上述RNAi诱导性核酸为siRNA。[20]上述[19]所述的治疗方法，其中，上述HIF-I α的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 1的碱基序列的mRNA中17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的 反义链；上述HIF-2 α的siRNA由含有对应于SEQ ID N0. 3的碱基序列的mRNA中17-25个 连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成。[21]上述[19]所述的治疗方法，其中，上述HIF-I α的siRNA为下述(a)或(b)， HIF-2 α 的 siRNA 为下述(C)或(d)
(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-I α表达抑制活性；(b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-I α 表达抑制活性；(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-2ci表达抑制活性；
(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-2 α 表达抑制活性。[22]上述[19]所述的治疗方法，其中，上述HIF-I α的siRNA为下述(1_1) - (1_5) 的任意一种，HIF-2 α的siRNA为下述(2-1) - (2-3)的任意一种(1-1)由含有SEQ ID NO. 5所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 11所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有SEQ ID N0. 6所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 12所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-3)由含有SEQ ID N0. 7所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 13所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-4)由含有SEQ ID N0. 8所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 14所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-5)由含有SEQ ID N0. 29所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 30所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-1)由含有SEQ ID N0. 9所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID N0. 15所示 的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有SEQ ID NO. 10所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 16所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由含有SEQ ID N0. 33所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 34所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA。[23]上述[17]所述的治疗方法，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性、糖尿病性 视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、糖尿病黄斑水肿或青 光眼。[24]上述[23]所述的治疗方法，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性或糖尿病性 视网膜病变。发明效果根据本发明的视网膜疾病的治疗药，通过特异性抑制HIF-I α和HIF-2 α两者的表达，与抑制其中任一种的表达的情形相比，可有效抑制视网膜细胞中VEGF的生成。该VEGF生成的抑制效果是协同性的。本发明视网膜疾病的治疗药与通常的核酸药物相比，有 望获得优异的效果。附图简述

图1是表示RPE细胞中的HIF-I α表达量的图表。图2是表示RPE细胞中的HIF-2a表达量的图表。图3是表示RPE细胞中的VEGF表达量的图表。图4是表示RPE细胞中的HIF-I α表达量的图表。图5是表示RPE细胞中的HIF-2 α表达量的图表。图6是表示RPE细胞中的VEGF表达量的图表。图7是表示RPE细胞中的VEGF表达量的图表。
具体实施例方式VEGF与存在于血管内皮细胞表面的受体(Flt-1、KDR/Flk_l等)特异性作用。是 促进血管内皮细胞的增殖、游走、通过管腔形成来构建毛细血管网的因子，血管新生的发 生过程中起着非常重要的作用(Ferrara, N.等人·，Kidney Int. 1999，56，794-814)。还 已知VEGF是眼组织中的血管形成或血管透过性的重要的控制因子，与抑老年性黄斑变性、 糖尿病性视网膜病变等的视网膜疾病有关(Shams，N.等人.，Ophthalmol. Clin. North. Am. 2006，19,335-344)。本发明的治疗药可以在视网膜色素上皮细胞或放射状胶质(米勒) 细胞等来自视网膜的细胞中，特异性抑制在上游控制VEGF表达的HIF-I α和HIF-2 α的 表达。本发明的治疗药通过抑制VEGF生成、控制血管新生的发生，作为视网膜疾病的治疗 药、特别是伴随血管新生的视网膜疾病的治疗药有效。伴随血管新生的视网膜疾病的具体 疾病有老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网 膜动脉阻塞、糖尿病黄斑水肿、青光眼(特别是新生血管性青光眼)等。已知视网膜色素上 皮细胞中的VEGF的增加是老年性黄斑变性中可见的血管形成的原因之一(Katrina等人.， Am. J. Pathol. 2000,157，135-144)，因此本发明的治疗药通过在视网膜色素上皮细胞发挥 优异的VEGF生成抑制作用，作为老年性黄斑变性的治疗药特别有效。本发明中，HIF-I α和HIF-2 α是来自任意的哺乳动物的转录因子。哺乳动物有 人以及除人以外的哺乳动物，除人以外的哺乳动物例如有小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类 或兔等的实验动物，猪、牛、山羊、马、绵羊等家畜，狗、猫等宠物，猴、猩猩、黑猩猩等灵长类。 在用于人的疾病的治疗方面，优选来自人的HIF-I α和HIF-2 α。HIF-2 α也称为EPASl或 HLF。人HIF-I α和HIF-2 α的碱基序列和氨基酸序列是公知的，例如，HIF-I α的碱基序 列(SEQ ID NO. 1)和氨基酸序歹Ij (SEQ ID N0. 2) (GenBank Accession No. NM 001530)、以 及 HIF-2 α 的碱基序列(SEQ IDN0. 3)和氨基酸序列(SEQ ID Ν0. 4) (GenBank Accession No. NM_001430)等在 GenBank 中登记、发表。本发明的治疗药的特征在于含有特异性抑制HIF-I α表达的物质和特异性抑制 HIF-2 α表达的物质。本发明的治疗药中作为有效成分含有的特异性抑制HIF-I α表达的物质只要是 作用于HIF-I α的转录过程、特异性抑制其表达的物质即可，没有特别限定。本发明的治疗药中作为有效成分含有的特异性抑制HIF-2 α表达的物质只要是作用于HIF-2CI的转录过 程、特异性抑制其表达的物质即可，没有特别限定。所述抑制物质有=RNAi诱导性核酸、反 义核酸或核酶、或者它们的表达载体。上述RNAi诱导性核酸是指可导入到细胞内、诱导RNA干扰的多核苷酸，优选为RNA 或者RNA与DNA的嵌合分子。RNA干扰是指含有与mRNA同一碱基序列(或其部分序列)的 双链结构的RNA抑制该mRNA表达的效果。为了获得该RNAi效果，例如优选使用与至少19 个碱基的连续的靶mRNA具有同一碱基序列(或其部分序列)的双链结构的RNA。不过，只 要具有HIF-Ια或HIF-2ci的表达抑制作用即可，可以被几个碱基置换，也可以是比19个 碱基长度短的RNA。双链结构可以由有义链和反义链这样不同的链构成，也可以是由一个 RNA的茎环结构产生的双链(shRNA)。RNAi诱导性核酸例如有siRNA、miRNA等。从转录抑制活性强的角度考虑，RNAi诱导性核酸优选siRNA。HIF-I α或HIF-2 α 的siRNA可以以HIF-I α或HIF-2 α的mRNA的任意部分作为靶。HIF-1 α或HIF-2 α 的siRNA分子只要可诱导RNAi效果即可，没有特别限定，例如为17-25个碱基长度，优选 17-23个碱基长度，进一步优选17-21个碱基长度。HIF-I α或HIF-2 α的siRNA是含有有 义链和反义链的双链。具体来说，HIF-I α的siRNA由含有对应于SEQ IDN0. 1的碱基序列 的mRNA中17-25个(优选17-23个，进一步优选17-21个)连续的碱基序列的有义链、以及 含有其互补序列的反义链构成。优选由含有以SEQ ID NO. 1的第906号-第1478号为靶 的17-25个(优选17-23个，进一步优选17-21个)连续的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成。HIF-2a的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 3的碱基序列的mRNA 中17-25个(优选17-23个，进一步优选17-21个)连续的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成。优选由含有以SEQ ID NO. 3的第580号-第4242号为靶的17-25 个(优选17-23个，进一步优选17-21个)连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列 的反义链。HIF-Ia或HIF-2ci的siRNA可以在有义链、反义链的一方或双方的5’末端或 3’末端具有突出端(overhang)。突出端通过有义链和/或反义链的末端的1_数个(例 如1、2或3个)碱基的附加形成。siRNA的设计方法是本领域技术人员公知的，可以使用 siRNA的各种设计软件或算法，由上述碱基序列中选择适当的siRNA的碱基序列。HIF-I α 和HIF-2 α的mRNA的同源性高，因此可以选择可同时敲除两者的mRNA的siRNA。这种情况 下，本发明的治疗药中所含的核酸可以只是1种。(I)HIF-I α 的 siRNAHIF-I α的siRNA的具体序列优选为以下述SEQ ID NO. 17-20或31的碱基序列为 基准，由下述(a)或(b)定义的双链RNA。(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID N0. 17-20或31的任一个所示的碱基序 列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有 突出端，且具有HIF-I α表达抑制活性； (b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID N0. 17_20或31的任一个所示的碱基序 列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-I α 表达抑制活性。这里，从HIF-I α表达抑制活性的保持的角度考虑，在SEQ ID Ν0. 17_20或 31的任一个所示的碱基序列的5’末端和/或3’末端有1-数个(例如1-5个，优选1-3个，更优选1或2个)碱基附加和/或缺失可实现与编码HIF-I Cl基因的有义链及其反义 链的部分碱基序列确保同一性。[表 1] *反义链的序列表示与左栏的有义链序列对应的一个具体例子。优选HIF-I α的siRNA内，具有突出端的siRNA为下述(1_1)-(1_5)的任意一种 (下划线表示突出端)(1-1)由含有 SEQ ID NO. 5 (5'-ggaac cugau gcuuu aacutt-3')所示的碱基序列 的有义链、以及含有SEQ ID NO. 11 (5’-aguua aagca ucagguucctt-3')所示的碱基序列的 反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有 SEQ ID NO. 6 (5'-gggua aagaa caaaa cacatt-3')所示的碱基序列 的有义链、以及含有SEQ ID N0. 12(5’-ugugu uuugu ucuuuaccctt-3')所示的碱基序列的 反义链构成的双链RNA ；(1-3)由含有 SEQ ID N0. 7(5' -ggcagcagaaaccuacugctt-3‘)所示的碱基序列的 有义链、以及含有SEQ ID N0. 13 (5‘ -gcaguagguuucugcugcctt-3')所示的碱基序列的反义 链构成的双链RNA ；(1-4)由含有 SEQ ID N0. 8(5，-gcacgacuugauuuucucctt-3‘)所示的碱基序列的 有义链、以及含有SEQ ID N0. 14(5' -ggagaaaaucaagucgugctg-3')所示的碱基序列的反义 链构成的双链RNA ；(1-5)由含有 SEQ ID N0. 29 (5‘-ccucaguguggguauaagatt-3‘)所示的碱基序列的 有义链、以及含有SEQ ID N0. 30 (5' -ucuuauacccacacugaggtt-3')所示的碱基序列的反义 链构成的双链RNA。(2)HIF-2a 的 siRNAHIF-2 α的siRNA的具体的序列优选为以下述SEQ ID N0. 21、22或35的任一个为 基准、由下述(c)或(d)定义的双链RNA。(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序 列有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突 出端，且具有HIF-2ci表达抑制活性；(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有 其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-2 α 表达抑制活性。这里，从保持HIF-2a表达抑制活性的角度考虑，在SEQ ID NO. 21、22或35 的任一个所示的碱基序列的5’末端和/或3’末端有1-数个(例如1-5个，优选1-3个， 更优选1或2个)碱基附加和/或缺失可实现与编码HIF-2 α基因的有义链及其反义链的 部分碱基序列确保同一性。[表 2] *反义链的序列表示与左栏的有义链序列对应的一个具体例子。HIF-2 α的siRNA内，具有突出端的siRNA优选为下述(2_1)_(2_3)的任意一种 (下划线表示突出端。)(2-1)由含有 SEQ ID NO. 9 (5，_cggag guguu cuaug agcutt-3')所示的碱基序列 的有义链、以及含有SEQ ID NO. 15(5'-agcuc auaga acaccuccgtc-3')所示的碱基序列的 反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有 SEQ ID N0. 10(5，-gguuu uguug cuagc ccuutt-3')所示的碱基序 列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 16 (5’-aaggg cuagc aacaaaacctt-3')所示的碱基序列 的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由L SEQ ID N0. 33(5' -ggaca uagua ucuuu gacutt-3' ) 的―· 列的有义链、以及含有SEQ ID N0. 34(5'-aguca aagau acuaugucctg-3')所示的碱基序列 的反义链构成的双链RNA。HIF-I α的反义核酸或HIF-2 α的反义核酸是指，由在表达HIF-I α或HIF-2 α的 转录产物(mRNA或初期转录产物)的细胞的生理条件下可与该转录产物杂交的碱基序列构 成，且在杂交的状态下，可抑制该转录产物所编码的多肽的翻译的多核苷酸。反义核酸的种 类可以是DNA，也可以是RNA，或者是DNA/RNA嵌合。反义核酸可以具有天然型的磷酸二酯 键，也可以是对分解酶稳定的硫代磷酸型(磷酸键P = 0取代为P = S)或2’-0_甲基型等 的修饰核苷酸。反义核酸的设计中很重要的其它要素有提高水溶性和细胞膜透过性等，这 可通过使用脂质体或微球体等剂型的改进来克服。反义核酸的长度只要是可与HIF-I α或 HIF-2 α的转录产物(例如对应于SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 3碱基序列的mRNA)特异性 杂交即可，没有特别限定，可以是含有短至约15个碱基左右、长至与转录产物的全序列互 补的序列的序列。基于的容易程度或抗原性的问题等，可列举例如含有约15个碱基以上、 优选约15-约30个碱基、更优选约18个碱基-约30个碱基的寡核苷酸。并且反义核酸不 仅与HIF-I α或HIF-2 α的转录产物杂交，抑制翻译，还与双链DNA结合，形成三链(三链体)，可抑制转录为mRNA。HIF-Ia的反义核酸优选包含SEQ IDNO. 17_20、23_26、31、32的 任一个所示的碱基序列(反义核酸为DNA时，U为T)。HIF-2 α的反义核酸优选包含SEQ ID NO. 21、22、27、28、35、36的任一个所示的碱基序列(反义核酸为DNA时，U为T)。本说明书中，“互补的”是指碱基序列之间具有约70%以上、优选约80%以上、更 优选约90%以上、进一步优选约95%以上、最优选100%的互补性。本说明书中的碱基序 列的同源性可以使用同源性计算算法NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic LocalAlignment Search Tool)，按以下的条件(期望值=10 ；允许空 位；过滤=ON ；匹配得分=1 ；错配得分=-3)计算。上述“核酶”是指具有切断核酸的酶活性的RNA，最近已明确，该具有酶活性部位的碱基序列的寡DNA也同样具有核酸切断活性，因此，本说明书中，只要具有序列特异性的核 酸切断活性，也作为包含DNA的概念使用。具体来说，核酶可在编码区的内部(为初期转录 产物时包含内含子部分)特异性切断编码HIF-I α或HIF-2ci的mRNA或者初期转录产物。 作为核酶，常用性最高的有类病毒或拟病毒等的感染性RNA中可见的自剪切RNA，已知有锤 头型或发夹型等。锤头型以约40个碱基左右发挥酶活性，通过使与锤头结构的部分相邻的 两端的数个碱基(共约10个碱基左右)制成为与mRNA的所需切断部位互补的序列，可以 只特异性切断靶mRNA。并且，以含有编码该核酶的DNA的表达载体的形式使用核酶时，为了 促进转录产物向细胞质转移，可以制成进一步与使tRNA改变了的序列连接得到的杂交核 酶(Nucleic Acids Res. ,29(13) :2780_2788(2001))。HIF-I α和HIF-2 α特异性抑制物质也可以以表达载体的形式提供。所述表达载 体含有编码HIF-I α和HIF-2 α特异性抑制物质的多核苷酸、以及可与该多核苷酸功能性 连接的启动子。上述启动子可根据在其控制下的表达对象核酸的种类适当选择，例如有polIII 启动子(例如tRNA启动子、TO启动子、Hl启动子)、哺乳动物用启动子(例如、CMV启动子、 CAG启动子、SV40启动子)。本发明的表达载体可进一步含有选择标志基因(产生对四环素、氨苄青霉素、卡 那霉素、潮霉素、膦丝菌素等药物的抗性的基因、使营养突变互补的基因等)。本发明的表达载体的主链(backbone)只要是可在人等的哺乳动物细胞中产生 HIF-I α和HIF-2CI特异性抑制物质即可，没有特别限定，例如有质粒载体、病毒载体。适合 给予哺乳动物的载体有反转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、痘苗病毒、痘病毒、脊 髓灰质炎病毒、新培斯病毒、仙台病毒等的病毒载体。其中优选来自反转录病毒、腺病毒、腺 伴随病毒、痘苗病毒的病毒载体。本发明的治疗药的给予量根据有效成分的种类或活性、作为给予对象的动物种 类、给予对象的病症的严重程度、药物接受性、体重、年龄等而不同，通常成人每天的有效成 分量可列举约0. 0001-约1000mg/kg。本发明的治疗药的给予对象有人以及除人之外的哺乳动物，除人之外的哺乳动物 例如有小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠等啮齿类，或兔等的实验动物，猪、牛、山羊、马、绵羊等家畜， 狗、猫等宠物，猴、猩猩、黑猩猩等的灵长类。本发明的治疗药可以对患者口服或非口服给予，给予形式有口服给予、眼部局部 给予(滴眼给予、玻璃体内给予、结膜下给予、眼球肌膜囊下给予等)、静脉内给予、透皮给予等，还可根据需要，与制药学可接受的添加剂一起，制成适合给予的制剂。适合口服给予 的剂型例如有片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂等，适合非口服给予的剂型例如有滴眼剂、目艮 软膏、注射剂、贴剂、洗剂、乳膏剂等。它们可采用该领域常用的常规技术制备。本发明的治 疗药只要可发挥上述治疗效果即可，其给予途径和剂型没有特别限定，优选给予途径是眼 部局部给予，其剂型是注射剂或滴眼剂。
本发明的治疗药除这些制剂之外，还可以制成眼内植入用制剂或微球体等的 DDS(药物传递系统)化的制剂。例如使用本发明的治疗药作为注射剂或滴眼剂时，可以加入稳定剂(例如有亚硫 酸氢钠、硫代硫酸钠、乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、抗坏血酸、二丁基羟基甲苯等)、溶解助剂 (例如甘油、丙二醇、聚乙二醇、聚氧乙烯氢化蓖麻油等)、悬浮剂(例如聚乙烯基吡咯烷酮、 羟丙甲基纤维素、羟基甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠等)、乳化剂(例如聚乙烯基吡咯烷 酮、大豆卵磷脂、卵黄卵磷脂、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚山梨酯80等)、缓冲剂(例如磷酸缓 冲液、乙酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、Tris缓冲液、谷氨酸、ε -氨基 己酸等)、增稠剂(例如甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟基丙甲基纤维素、羧甲基纤维素等水 溶性纤维素衍生物，软骨素硫酸钠、透明质酸钠、羧基乙烯基聚合物、聚乙烯基醇、聚乙烯基 吡咯烷酮、聚乙二醇等)、防腐剂(例如有苯扎氯铵、苄索氯胺、葡萄糖酸氯己定、氯丁醇、苄 醇、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸酯类、乙二胺四乙酸钠、硼酸等)、等渗剂(例如氯化钠、氯化 钾、甘油、甘露醇、山梨醇、硼酸、葡萄糖、丙二醇等)、ρΗ调节剂(例如盐酸、氢氧化钠、磷酸、 乙酸等)、清凉剂(例如、1-薄荷醇、d-樟脑、d-冰片、薄荷油等)、软膏基质(白色凡士林、 精制羊毛脂、液体石蜡、植物油(橄榄油、香椿油、花生油等)等)等作为添加剂。这些添加 剂的添加量根据要添加的添加剂的种类、用途等而不同，可以添加可达到添加剂的目的的 浓度。本发明的治疗药可以采用脂转染法将SiRNA等核酸制成制剂。脂转染法中通常使 用磷脂酰丝氨酸制成的脂质体。磷脂酰丝氨酸具有负电荷，因此，优选使用更容易制成稳定 的脂质体、被称为N-[l-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)的阳离 子性脂质(商品名卜，> ^ 7工夕夕么、1^ 0作(^膽士1^(脂转染胺试剂))作为磷脂酰丝 氨酸的代用品。这些阳离子性脂质与带负电荷的siRNA等核酸形成复合物，则整体带正电 荷的脂质体可吸附在带负电荷的细胞的表面，与细胞膜融合，由此可以将核酸导入细胞内。实施例以下给出实施例，进一步详细说明本发明，但本发明并不受此限定。制剂例1 玻璃体内给予用注射剂按照常规方法制备如下所示的玻璃体内给予用注射剂。HIF-IasiRNA:有义-GGAACC UGA UGC UUU AAC UTT (SEQ ID NO. 5) Img反义-AGUUAA AGC AUC AGG UUC CTT (SEQ ID NO. 11) ImgHIF-2 a siRNA 有义-CGGAGG UGU UCU AUG AGC UTT (SEQ ID NO. 9) Img反义-AGCUCA UAG AAC ACC UCC GTC (SEQ ID NO. 15) Img磷酸二氢钠0. Ig氯化钠 氢氧化钠 无菌纯净水
0. 9g
适量 适量
总量100mL (pH7)
制剂例2 玻璃体内给予用注射剂
按照常规方法制备以下所示的玻璃体内给予用注射剂。
HIF-1a siRNA
有义-GGG UAA AGA ACA AAA CAC ATT(SEQ ID NO. 6)0. lmg
反义-UGU GUU UUG UUC UUU ACC CTT(SEQ ID NO. 12)0. lmg HIF-2a siRNA
有义-GGU UUU GUU GCU AGC CCU UTT(SEQ ID NO. 10)0. lmg
反义-AAG GGC UAG CAA CAA AAC CTT(SEQ ID NO. 16)0. lmg
磷酸二氢钠0. lg
甘油2. 5g
氢氧化钠适量
无菌纯净水适量
总量100mL (pH 7)
制剂例3 眼球肌膜囊下给予用注射剂
按照常规方法制备以下所示的眼球肌膜囊下给予用注射剂。
HIF-1a siRNA
有义-GGC AGC AGA AAC CUA CUG CTT(SEQ ID NO. 7) 5mg 反义-GCA GUA GGU UUC UGC UGC CTT(SEQ ID NO. 13) 5mg HIF-2a siRNA
有义-GGA CAU AGU AUC UUU GAC UTT(SEQ ID NO. 33) 5mg 反义-AGU CAA AGA UAC UAU GUC CTG(SEQ ID NO. 34) 5mg 磷酸二氢钠0. lg
氯化钠0.9g
氢氧化钠适量
无菌纯净水适量
总量100mL (pH7)
试验例1 :HIF siRNA对于诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞中的VEGF表达的效果 1.方法
1)HIF siRNA对RPE细胞的转染
在6孔板中接种RPE细胞(ATCC制备，细胞名ARPE_19，目录编号CRL-2302)， 培养至30-50%的细胞密度后更换为低血清培养基(含有0. FBS的DMEM/F12培养基， Invitrogen制备)。下述的各HIF siRNA使用Ambion公司的产品(下划线表示由脱氧体 构成的突出端)。HIF-1 a siRNA 有义-GGAACC UGA UGC UUU AAC UTT(SEQ ID NO. 5)、反义-AGUUAA AGC AUC AGG UUC CTT(SEQ ID NO. 11)、HIF-2 a siRNA 有义-CGGAGG UGU UCU AUG AGC UTT(SEQ ID NO. 9)、以及反义-AGCUCA UAG AAC ACC UCC GTC(SEQ ID NO. 15)转染试剂(RNAi MAX, Invitrogen制备)的复合物的形成是通过将各种siRNA和 转染试剂在Opti-MEM(Invitrogen制备)中搅拌，然后温育25分钟来制备。然后，在调节 成各siRNA的终浓度为5nM的培养基中将RPE细胞培养24小时，进行siRNA的转染。分组 情况如下所述。(a)正常组(b)低氧组(c)低氧 + 药物组(HIF-1 a siRNA 5nM)(d)低氧 + 药物组(HIF-2 a siRNA 5nM)(e)低氧 + 药物组(HIF-1 a siRNA 5nM+HIF_2 a siRNA 5nM)2)低氧系统中的RPE细胞的培养将HIF siRNA转染RPE细胞后，使用AnaeroPack for Cell (三菱气体株式会社制 备)进行1天的低氧培养。另外以正常氧浓度下培养的细胞作为正常组。3) RNA提取和实时PCR使用lmL TRIzol溶液(Invitrogen制备，目录编号15596-026)，从接种于6孔 板的RPE细胞中提取总RNA。提取方法按照TRIzol溶液中附属的说明书流程进行。接 着使用DNA-free (Ambion制备)除去混在提取后的总RNA中的基因组DNA，然后使用 SuperScript II (Invitrogen 制备)禾口 Random primer (Ambion 制备)进行反转录反应。然 后使用 TaqManUniversal PCR master mix (Applied Biosystems 制备)将所得 cDNA溶液进 行实时PCR反应。引物使用Applied Biosystems制备的TaqMan实时PCR引物(HIF-1 a Hs00153153_ml, HIF-2a :Hs01026142_ml，VEGF :Hs00173626_ml)。2.结果和考察分别添加HIF-1 a siRNA、HIF-2 a siRNA和由两者构成的异构体的混合siRNA，使 用RPE细胞，对于是否抑制低氧处理导致的VEGF表达亢进进行研究。图1表示HIF-1 a的表达量。通过添加单独的HIF_1 a siRNA、或者由两者异构体 构成的混合siRNA，观察到HIF-la表达的抑制。图2表示HIF_2 a的表达量，通过添加单 独的HIF_2a siRNA、或者由两者异构体构成的混合siRNA，可见HIF_2a表达的抑制。在相 同条件下可见VEGF表达的抑制的是图3。单独添加HIF-1 a siRNA可见VEGF表达的抑制效 果，但其抑制效果不充分，抑制率为35%。而单独添加HIF-2 a siRNA时则完全未见抑制效 果。不过，在添加HIF-la和2a两者的异构体的组中，单独添加时可见未予想到的显著的VEGF表达的抑制效果，其抑制率显示为89%。以上结果表明，通过抑制HIF来抑制视网膜 中的血管新生时，与其它的细胞不同，抑制两种异构体是理想的。试验例2 :HIF siRNA对于诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞中的VEGF表达的效果1.方法1)HIF siRNA 对 RPE 细胞的转染在96孔板中接种RPE细胞(ATCC制备，细胞名ARPE_19，目录编号CRL_2302)， 为了进行siRNA的转染，将细胞培养至30-50%的细胞密度。接着，将siRNA和转染试剂 (RNAi MAX，Invitrogen 制备)在 Opti-MEM(Invitrogen 制备)中搅拌，然后温育 20 分钟， 制备siRNA-RNAiMax复合物。HIF siRNA使用下述的Ambion公司的产品(下划线表示由脱氧体构成的突出端)。HIF-1 a siRNA 有义-CCUCAG UGU GGG UAU AAG ATT(SEQ ID NO. 29)、反义-UCUUAU ACC CAC ACU GAG GTT(SEQ ID NO. 30)、HIF-2 a siRNA 有义-GGACAU AGU AUC UUU GAC UTT(SEQ ID NO. 33)、以及反义-AGUCAA AGA UAC UAU GUC CTG(SEQ ID NO. 34)将培养基更换为无血清培养基(DMEM培养基或DMEM/F12培养基，Invitrogen制 备)，然后向RPE细胞中加入各siRNA，使终浓度为lOnM，进行转染。分组情况如下所述。(a)正常组(b)低氧组(c)低氧 + 药物组(HIF-1 a siRNA 5nM)(d)低氧 + 药物组(HIF-2 a siRNA 5nM)(e)低氧 + 药物组(HIF-1 a siRNA 5nM+HIF_2 a siRNA 5nM)2)低氧系统中的RPE细胞的培养对RPE细胞转染HIF siRNA，然后使用AnaeroPack for Cell (三菱气体株式会社 制备)，为了诱导VEGF的表达而进行1天的低氧培养。以在正常氧浓度下培养的细胞作为 正常组。3)RNA提取和实时PCR低氧培养结束后,使用 50ii L 的 Lysis 溶液(TaciMan Gene ExpressionCell-to-CT 试剂盒，Applied Biosystems制备，目录编号AM1728)，从RPE细胞中提取总RNA。提 取方法按照TRIzol溶液所附的说明书的流程进行。接着，使用lxRT缓冲液和lxRT酶 Mix(与上述试剂盒在同一包装中)进行反转录反应，所得cDNA溶液使用TaqMan Gene ExpressionMaster Mix (与上述试剂盒在同一包装中)进行实时PCR反应。引物使用 Applied Biosystems 公司的 TaqMan 实时 PCR 引物(HIF-1 a :Hs00153153_ml, HIF-2 a Hs01026142_ml, VEGF :Hs00173626_ml)。2.结果和考察分别添加HIF-1 a siRNA、HIF-2 a siRNA以及由两者的异构体构成的混合siRNA， 使用RPE细胞对于是否抑制低氧处理导致的VEGF表达亢进进行研究。图4表示HIF-la的 表达量。通过添加单独的HIF-1 a siRNA、或者由两者的异构体构成的混合siRNA，观察到显著的HIF-la表达的抑制。图5表示HIF_2a的表达量，通过添加单独的HIF_2 a siRNA、或 者由两者的异构体构成的混合siRNA，可见HIF-2 a表达的抑制。在相同条件下可见VEGF 表达的抑制的是图6。HIF-1 a在单独添加siRNA或HIF_2 a siRNA的组中，未见VEGF表达 抑制的效果。与此相对，在添加了由两者的异构体构成的混合siRNA的组中，可见显著的 VEGF表达抑制效果。试验例3 :HIF siRNA对于诱导视网膜色素上皮(RPE)细胞中的VEGF表达的效果1.方法1)HIF siRNA 对 RPE 细胞的转染试验方法按照试验例2进行，使用下述的Amibon制备的siRNA实施试验(下划线 表示由脱氧体构成的突出端)。HIF-1 a siRNA 有义-gca cga cuu gau uuu cuc cTT(SEQ ID NO. 8)、EX "gga gaa aau caa guc gug cTT(SEQ ID NO. 14)、HIF-2 a siRNA 有义—ggu uuu guu g cu age ccu uTT(SEQ ID NO. 10)、以及反义-aag ggcuag caa caa aac cTC(SEQ ID NO. 16)2.结果和考察如图7所示，在单独添加HIF-1 a siRNA或HIF-2 a siRNA的组中，未见VEGF表达抑 制效果。而在添加由两者的异构体构成的混合siRNA的组中，显著可见VEGF的抑制效果。产业实用性本发明的视网膜疾病的治疗药可以有效地抑制视网膜细胞中的VEGF的生成，在 老年性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变等的伴随血管新生的视网膜疾病的治疗中，与通常 的核酸药物相比有望获得优异的量效关系。本申请是以在日本提出的特愿2007-204585 (申请日2007年8月6日)为基础， 其内容全部包含在本说明书中。序列表自由文本
SEQIDNO.5 人 HIF-1a的siRNA的有义链
SEQIDNO.6 人 HIF-1a的siRNA的有义链
SEQIDNO.7 人 HIF-1a的siRNA的有义链
SEQIDNO.8 人 HIF-1a的siRNA的有义链
SEQIDNO.9 人 HIF-2a的siRNA的有义链
SEQIDNO.10人 HIF-2 (1的siRNA的有义链
SEQIDNO.11人 HIF-1 (1的siRNA的反义链
SEQIDNO.12人 HIF-1 (1的siRNA的反义链
SEQIDNO.13人 HIF-1 (1的siRNA的反义链
SEQIDNO.14人 HIF-1 (1的siRNA的反义链
SEQIDNO.15人 HIF-2 (1的siRNA的反义链
SEQIDNO.16人 HIF-2 (1的siRNA的反义链
SEQIDNO.17人 HIF-1 (1的siRNA的有义链
SEQIDNO.18人 HIF-1 a的siRNA的有义链
SEQIDNO.19人 HIF-1 a的siRNA的有义链
SEQIDNO.20人 HIF-1 a的siRNA的有义链
SEQIDNO.21人 HIF_2a的siRNA的有义链
SEQIDNO.22人 HIF_2a的siRNA的有义链
SEQIDNO.23人 HIF-1 a的siRNA的反义链
SEQIDNO.24人 HIF-1 a的siRNA的反义链
SEQIDNO.25人 HIF-1 a的siRNA的反义链
SEQIDNO.26人 HIF-1 a的siRNA的反义链
SEQIDNO.27人 HIF_2a的siRNA的反义链
SEQIDNO.28人 HIF_2a的siRNA的反义链
SEQIDNO.29人 HIF-1 a的siRNA的有义链
SEQIDNO.30人 HIF-1 a的siRNA的反义链
SEQIDNO.31人 HIF-1 a的siRNA的有义链
SEQIDNO.32人 HIF-1 a的siRNA的反义链
SEQIDNO.33人 HIF_2a的siRNA的有义链
SEQIDNO.34人 HIF_2a的siRNA的反义链
SEQIDNO.35人 HIF_2a的siRNA的有义链
SEQIDNO.36人 HIF_2a的siRNA的反义链
权利要求
视网膜疾病的治疗药，该治疗药含有特异性抑制HIF-1α表达的物质以及特异性抑制HIF-2α表达的物质。
2.权利要求1所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述抑制物质是RNAi诱导性核酸、反 义核酸或核酶或者它们的表达载体。
3.权利要求2所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述RNAi诱导性核酸是siRNA。
4.权利要求3所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述HIF-Iα的siRNA由含有对应于 SEQ ID NO. 1的碱基序列的mRNA中17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序 列的反义链构成；上述HIF-2a的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 3的碱基序列的mRNA中 17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成。
5.权利要求4所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述HIF-Iα的siRNA是下述(a)或 (b)，HIF-2 α 的 siRNA 是下述(c)或(d)(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序列的有 义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端， 且具有HIF-I α表达抑制活性；(b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序列 的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-I α表 达抑制活性；(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列的有 义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端， 且具有HIF-2 α表达抑制活性；(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列 的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-2 α表 达抑制活性。
6.权利要求4或5所述的视网膜疾病的治疗药，其中，上述HIF-Iα的siRNA为下述 (1-1)-(1-5)的任意一种，HIF-2a 的 siRNA 为下述(2_1)-(2_3)的任意一种(1-1)由含有SEQ ID NO. 5所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 11所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有SEQ ID NO. 6所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 12所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-3)由含有SEQ ID NO. 7所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 13所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-4)由含有SEQ ID NO. 8所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 14所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-5)由含有SEQ ID NO. 29所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 30所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-1)由含有SEQ ID NO. 9所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 15所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有SEQ ID NO. 10含有所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 16所 示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由含有SEQ ID NO. 33所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 34所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA。
7.权利要求1-6中任一项所述的视网膜疾病的治疗药，其中，视网膜疾病为老年性黄 斑变性、糖尿病性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、糖尿 病黄斑水肿或青光眼。
8.权利要求7所述的视网膜疾病的治疗药，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性或糖 尿病性视网膜病变。
9.特异性抑制HIF-Iα表达的物质和特异性抑制HIF-2ci表达的物质在制备视网膜疾 病的治疗药中的应用。
10.权利要求9所述的应用，其中，上述抑制物质是RNAi诱导性核酸、反义核酸或核酶、 或者它们的表达载体。
11.权利要求10所述的应用，其中，上述RNAi诱导性核酸为siRNA。
12.权利要求11所述的应用，其中，上述HIF-Iα的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 1 的碱基序列的mRNA中17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构 成；上述HIF-2 α的siRNA由含有对应于SEQ ID NO. 3的碱基序列的mRNA中17-25个连续 的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链构成。
13.权利要求12所述的应用，其中，上述HIF-Iα的siRNA为下述(a)或(b)，HIF_2a 的siRNA为下述(c)或(d)(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序列的有 义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端， 且具有HIF-I α表达抑制活性；(b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序列 的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-I α表 达抑制活性；(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列的有 义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端， 且具有HIF-2 α表达抑制活性；(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列 的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端任选具有突出端，且具有HIF-2 α表 达抑制活性。
14.权利要求12或13所述的应用，其中，上述HIF-Iα的siRNA为下述(1_1)-(1_5) 的任意一种，HIF-2 α的siRNA为下述(2-1) - (2-3)的任意一种(1-1)由含有SEQ ID NO. 5所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 11所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有SEQ ID NO. 6所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 12所示的碱基序列的反义链构成的双链RNA ； (1-3)由含有SEQ ID NO. 7所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 13所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-4)由含有SEQ ID NO. 8所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 14所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-5)由含有SEQ ID NO. 29所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 30所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-1)由含有SEQ ID NO. 9所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 15所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有SEQ ID NO. 10所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 16所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由含有SEQ ID NO. 33所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 34所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA。
15.权利要求9-14中任一项所述的应用，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性、糖尿病 性视网膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、糖尿病黄斑水肿或 青光眼。
16.权利要求15所述的应用，其中视网膜疾病为老年性黄斑变性或糖尿病性视网膜病变。
17.视网膜疾病的治疗方法，该方法包含以下步骤对需要进行视网膜疾病治疗的对 象给予有效量的特异性抑制HIF-I α表达的物质以及特异性抑制HIF-2CI表达的物质。
18.权利要求17所述的治疗方法，其中，上述抑制物质是RNAi诱导性核酸、反义核酸或 核酶、或者它们的表达载体。
19.权利要求18所述的治疗方法，其中，上述RNAi诱导性核酸为siRNA。
20.权利要求19所述的治疗方法，其中，上述HIF-Iα的siRNA包含SEQ ID NO. 1的碱 基序列所对应的mRNA中含有17-25个连续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反 义链；上述HIF-2 α的siRNA包含SEQ ID NO. 3的碱基序列所对应mRNA中含有17-25个连 续的碱基序列的有义链、以及含有其互补序列的反义链。
21.权利要求19所述的治疗方法，其中，上述HIF-Iα的siRNA为下述(a)或(b)， HIF-2 α 的 siRNA 为下述(C)或(d)(a)双链RNA，该双链RNA由含有SEQID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序列的 有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端可具有突出端， 且具有HIF-I α表达抑制活性f有t易；(b)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQID NO. 17-20或31的任一个所示的碱基序列 的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端可具有突出端，且具有HIF-I α表达 抑制活性；(c)双链RNA，该双链RNA由含有SEQID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列的 有义链、以及含有其互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端可具有突出端， 且具有HIF-2 α表达抑制活性；(d)双链RNA，该双链RNA由含有在SEQ ID NO. 21、22或35的任一个所示的碱基序列 的5’末端和/或3’末端有1-数个碱基附加和/或缺失的碱基序列的有义链、以及含有其 互补序列的反义链构成，该有义链和/或反义链的末端可具有突出端，且具有HIF-2 a表达 抑制活性。
22.权利要求19所述的治疗方法，其中，上述HIF-1a的siRNA为下述(1_1)-(1_5)的 任一项，HIF_2a的siRNA为下述(2_1)-(2_3)的任一项(1-1)由含有SEQ ID NO. 5所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 11所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-2)由含有SEQ ID NO. 6所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 12所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-3)由含有SEQ ID NO. 7所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 13所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-4)由含有SEQ ID NO. 8所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 14所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(1-5)由含有SEQ ID NO. 29所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 30所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-1)由含有SEQ ID NO. 9所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQID NO. 15所示的碱 基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-2)由含有SEQ ID NO. 10所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 16所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA ；(2-3)由含有SEQ ID NO. 33所示的碱基序列的有义链、以及含有SEQ ID NO. 34所示的 碱基序列的反义链构成的双链RNA。
23.权利要求17所述的治疗方法，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性、糖尿病性视网 膜病变、早产儿视网膜病变、视网膜静脉阻塞、视网膜动脉阻塞、糖尿病黄斑水肿或青光眼。
24.权利要求23所述的治疗方法，其中，视网膜疾病为老年性黄斑变性或糖尿病性视 网膜病变。
全文摘要
本发明提供在老年性黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等的伴随血管新生的视网膜疾病的治疗中治疗效果更高的药物。是含有特异性抑制HIF-1α表达的物质以及特异性抑制HIF-2α表达的物质的视网膜疾病治疗药。本发明的治疗药中的药效物质——上述的抑制物质是RNAi诱导性核酸、反义核酸或核酶或者它们的表达载体。
文档编号A61K31/713GK101868251SQ200880109970
公开日2010年10月20日 申请日期2008年8月5日 优先权日2007年8月6日
发明者东光佳, 中岛惠美, 中岛毅 申请人:千寿制药株式会社