专利名称：抑制lgE产生的物质和方法
技术领域：
本发明作为一项由国立卫生研究所支助的许可号为No.CA69959和R37AI25904的研究项目在政府的支持下完成。
与相关申请的相互参考本申请要求了于1999年8月27日申请的美国监时申请No.60/151026的优先权。
背景技术：
干扰素被分为不同的两个组I型干扰素，包括IFNα、IFNβ和IFNω(也被称作IFNαII)；II型干扰素，以IFN γ为代表(由DeMaeyer等评述，1998)。估计人体内具有至少17个IFNα非等位基因，至少约2或3个IFNβ非等位基因和1个IFN γ基因。
各种IFNα已表现出对各种类型的细胞增殖具有抑制作用。IFNα尤其对治疗血液恶性肿瘤如多毛细胞白血病(Quesada等，1984)有用。而且，这些蛋白质还显示出抗多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞白血病、低级淋巴瘤、卡波西肉瘤、慢性骨髓白血病、肾细胞瘤、膀胱瘤和卵巢癌的活性(Bonnem等，1984；Oldham，1985)。还研究了干扰素和干扰素受体在某些自身免疫和炎症疾病的致病过程中的作用(Benoit等，1993)。
各种IFNα还对治疗各种类型的病毒感染有用(Finter等，1991)。IFNα还显示出抗人类乳头瘤病毒感染、乙型肝炎和丙型肝炎感染的活性(Finter等，1991；Kashima等，1988；Dusheiko等，1986；Davis等，1989)。另外，对IFNα和IFNγ的研究表明IFNα和IFNγ可抑制过敏性疾病中IgE的产生(Noh等，1998；Hofstra等，1988；Lack等，1996；Dolen等，1995；Kimata等，1995；Gruschwitz等，1993)。
然而，最明显地是，各种IFNα的有用性受到其本身毒性的限制干扰素在用于治疗癌症和病毒性疾病的过程中产生严重的副作用，诸如发烧、寒战、厌食、体重下降和疲乏(Pontzer等，1991；Oldham，1985)。这些副作用通常需要(i)将干扰素的剂量降到限制有效治疗的水平，或者(ii)解除病人的治疗。这种毒性降低了那些对抗病毒和抗增殖有效的蛋白质在减轻人类和动物疾病的治疗过程中的有用性。
干扰素-tau(IFNτ)是I型干扰素家族中的一员，但是不同于IFNα和IFNβ，当IFNτ在体外和用于动物体内研究时，在很高浓度下都不具有毒性(Bazer等，1989；Pontzer等，1991；Soos，Johnson，1995；Soos等，1995；Soos等，1997；Khan等，1998)。IFNτ最初被认为是一种由反刍动物如羊和牛胎盘的滋养层细胞产生的妊娠识别激素(Bazer等1991；Godkin等，1982；Imakawa等，1987；Johnson，1994)。据报道已发现了人IFNτ(Whaley等，1994)，但是这一现象还未被证实。因此，目前还不知道是否具有人IFNτ。IFNτ显示出非常类似于IFNα和IFNβ的抗病毒和细胞抑制特性(Bazer等，1989；Pontzer等，1991；Soos，Johnson，1995)。然而，IFNτ不具有与高浓度的IFNα和IFNβ有关的细胞毒性(Bazer等，1989；Pontzer等，1991)。而且，与给个体施用高剂量的IFNα和IFNβ有关的体重下降和骨髓抑制没有发生在施用了IFNτ的动物系统中(Soos，Johnson，1995；Soos等，1995；Soos等，1997)。研究表明I型干扰素的N-末端在决定IFN是否具有毒性方面发挥作用(Pontzer等，1994；Subramaniam等，1995)。
已经报道过IFNτ可抑制实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)(一种用于自身免疫疾病、多发性硬化症的动物模型)中的体液和细胞应答(Mujtaba等，1998)。已经表明IFNτ抑制淋巴细胞对促细胞分裂素如伴刀豆凝集素A(Con A)和超抗原如SEA和SEB的应答(Soos，Johnson，1995；Soos等，1995；Khan等，1998)。还报道了，也是在EAE模型中，IFNτ和其它I型IFN能够诱导已被抗原提呈细胞激活的细胞产生IL-10和TGFβ，但不能诱导产生IL-4(Soos，Subramaniam等，1995；Mujtaba等，1998；Mujtaba等，1997)。IFNτ已被建议用于治疗人的多发性硬化症。
IgE免疫球蛋白的产生对于介导变态反应性疾病如过敏性鼻炎、遗传过敏性皮炎、支气管哮喘和食物过敏相当重要。通过腹膜内(ip)注射作为变应原的卵白蛋白(OVA)以及作为佐剂的氢氧化铝而引起的小鼠变应性致敏是一种已很好表征的刺激体内产生IgE的方法(Mancino等，1980；Miguel等，1977；Beck等，1989)。当被OVA免疫的小鼠受到雾化的OVA的攻击时，这些小鼠在肺的粘膜下层发生炎症细胞的浸润 (Kay等，1992；Hamelmann等，1996；Hamelmann等，1997)。IgE能够刺激肥大细胞释放出趋化介质，能够引起巨噬细胞和粒细胞在该位置上的有效积累。并且，由这些细胞产生的另一种炎症分子可以引起过敏性哮喘。因此，由B细胞产生的变应原特异性IgE对变态反应性疾病的发病起着相当重要的作用。
治疗变态反应性疾病的传统方法由减充血剂和抗组胺组成，这两种药物的作用是减轻发生变应性应答后的症状。因此，本领域仍然需要一种治疗变态反应性疾病的方法，该方法没有副作用并且能够阻断变应性应答，从而在产生症状前就能发挥作用。
本发明的概述本发明涉及对患有变态反应性疾病的患者进行治疗的新型方法和药物，所述变态反应性疾病如过敏性鼻炎(allergic rhinitis)、遗传过敏性皮炎(atopic dermatitis)、支气管哮喘(bronchial asthma)和食物过敏(food allergy)。本发明的方法包括给患有变态反应性疾病的人施用I型干扰素，如干扰素tau(IFNτ)，或嵌合性IFN(例如，羊IFNτ(1-27)/人IFNαD(28-166))。用药后，所述干扰素抑制变应原-特异性IgE抗体的产生，而不产生副作用。本发明还涉及可以用于本发明方法的嵌合羊/人IFN。
附图的主要描述
图1A和1B表示在OVA-致敏的小鼠体内IFNτ处理抑制产生OVA-特异性IgE抗体。通过腹膜内注射卵白蛋白(OVA)与氢氧化铝的混合物免疫BALB/C小鼠并在7天后进行加强免疫。免疫后第19天和20天将所述小鼠在雾化的OVA(1％w/v)中暴露20分钟。从免疫前3天开始每天给小鼠腹膜内注射IFNτ(5×105U/天)或PBS。进行雾化OVA暴露前24小时(图1A)或后24小时(图1B)采血。直接进行ELISA来测定OVA-特异性IgE的浓度。每组使用2到3只小鼠，显示平均的吸光度。从每一稀释度点值减去利用正常小鼠血清测定的对照吸光度。通过Student’st检验，检查与PBS处理相比，在IFNI处理的所有稀释度水平下(10,000稀释度除外)，OVA-特异性IgE抗体产生所受抑制作用的统计学显著性水平(p＜0.05)。
图2A-2C表示OVA-免疫的小鼠经PBS或IFNτ处理后的组织学评定。用OVA免疫BALB/C小鼠并在免疫后的第20天暴露于雾化的OVA然后按照上述方法用PBS或IFNτ进行处理。经雾化的OVA处理24小时后，对来源于未被免疫的(图2A)、经PBS处理的(图2B)、和IFNτ处理的(图2C)小鼠的肺进行提取、固定、石蜡包埋、切片和用苏木精以及曙红进行炎症细胞染色。箭头表示细支气管的上皮。
图3表示OVA-免疫的小鼠经PBS或IFNτ处理后血清中的IL-4浓度。按照上面图1的描述用OVA免疫BALB/C小鼠并暴露给雾化的OVA然后用PBS或IFNτ处理。雾化OVA暴露24小时后采血，进行夹心ELISA以便测定IL-4。每组使用2到3只小鼠，显示了IL-4的平均含量(ng)。从PBS和IFNτ组水平中减去未免疫小鼠血清中的对照水平。
图4A和4B表示用IFNτ对OVA-免疫小鼠进行体内处理降低了脾细胞的OVA-刺激程度。按照上述图1的说明用OVA-免疫BALB/C小鼠并暴露给雾化的OVA然后用PBS或IFNτ进行处理。利用100μg/ml的OVA对脾细胞(5×105细胞/孔)进行72小时的培养，然后利用含氚胸苷对培养物进行脉冲。将PBS处理的脾细胞与BSA和MBP 100μg/ml进行培养(图4B)。12小时后利用β闪烁计数仪对细胞有关放射性进行计数，由三个实验中的一个得到的数据被表示为一式四份的孔中的平均cpm±SD。IFNτ处理对OVA所诱导细胞增殖的抑制相对于PBS处理的统计学显著性水平通过Student’st检验来表示(p＜0.001)。
图5表示利用I型IFN对脾细胞进行的体外处理可抑制OVA-特异性增殖。通过腹膜内注射OVA与氢氧化铝的混合物来免疫BALB/C小鼠并且7天后进行加强免疫。在第19天和20天将所述小鼠在雾化的OVA(1％w/v)中暴露20分钟。采用15000U/ml的各种IFN和含有或不含100μg/ml OVA的培养基将脾细胞(5×105细胞/孔)培养84小时，然后利用含氚胸苷对培养物进行脉冲。12小时后利用β闪烁计数仪对细胞相关放射性进行计数，由三个实验中的一个得到的数据被表示为一式四份的孔中的平均cpm±SD。Student’s t检验显示，所有IFN处理对OVA特异性脾细胞增殖的抑制相对于OVA致敏的培养基-处理细胞中的OVA特异性脾细胞增殖有统计学显著性(p＜0.001)。
图6A-6C表示对来源于经各种IFN或培养基处理的卵白蛋白(OVA)致敏小鼠的脾细胞或人骨髓瘤B细胞的培养上清液中小鼠和人IgE的免疫印迹测定。图6A包括泳道1对照小鼠IgE；泳道2补加了10％FBS的RPMI 1640；泳道3和4在没有OVA存在或有OVA存在的条件下分别培养了84小时的未免疫小鼠脾细胞的上清液；泳道5和6在没有OVA存在或有OVA存在的条件下分别培养了84小时的经PBS处理的OVA致敏小鼠脾细胞的上清液；泳道7和8在没有OVA存在或有OVA存在的条件下分别培养了84小时的经IFNτ处理的OVA致敏小鼠脾细胞的上清液；图6B包括泳道1，对照小鼠IgE；泳道2，只含RPMI 1640培养基；泳道3，在没有OVA存在的条件下的84小时脾细胞培养物；泳道4，5，6和7，在分别有培养基、IFNτ、IFNτ/IFNα嵌合体和IFNαD存在的条件下用OVA培养84小时的脾细胞(5×105细胞/孔)培养物；图6C包括泳道1，只含RPMI 1640培养基；泳道2，3，4和5，产生IgE的U266BL细胞，其被饥饿过夜，并分别在有培养基、1.0×104U/ml IFNαD，IFNτ/IFNαD嵌合体，和IFNτ存在的条件下以2×105细胞/孔各培养96小时。
图7表示I型IFN对产生IgE的人骨髓瘤B细胞系U266增殖的抑制。在有1.0×104U/ml的IFNτ，IFNτ/IFNαD嵌合体，IFNαD和培养基存在的条件下以2×105细胞/孔将饥饿过夜的产生IgE的U266BL细胞培养72小时。利用含氚胸苷对培养物进行脉冲，12小时后利用β闪烁计数仪对细胞相关放射性进行计数，由三个实验中的一个得到的数据被表示为一式四份的孔中的平均cpm±SD。通过锥虫蓝排除试验测定的细胞存活百分率被标在每一条形图的上端。各种IFN处理对细胞增殖的抑制相对于培养基-处理对细胞增殖的抑制的统计学显著性水平通过Student’s t检验来表示(p＜0.001)。
图8表示经IFN处理后的人外周血单核细胞(HPBMC)的代谢活性。HPBMC在不同浓度(250至100,000U/ml)的IFNτ，IFN αD，IFNτ/IFNαD嵌合体存在的条件下培养7天。HPBMC的代谢活性通过按照材料和方法中的描述测定细胞的增殖和存活来评价，在本文中表示为相对于未处理对照的百分比。经羊IFNτ和IFNτ/IFNα嵌合体处理的HPBMC的值与未处理对照无显著差异，而利用Wilcoxon signed-rank检验测定经人IFNα处理的HPBMC的值与未处理对照有显著性差异(p＜0.05)。
本发明的详细描述本发明涉及新型的治疗和预防方法，该方法治疗其中对IgE产生的抑制是有效和有利的的任何疾病，这些疾病包括变态反应性疾病和其它与IgE有关的疾病或状况。本发明的方法可以治疗的疾病包括，但不限于过敏性鼻炎、遗传过敏性皮炎、支气管哮喘和食物过敏。在本发明的方法中，对患有临床上需要抑制IgE产生的状况的患者施用有效量的含有I型IFN如IFNα、IFNβ、IFNτ或IFNω或嵌合IFN的组合物。
在本发明的一个技术方案中，有效量的IFNτ被施用给患有或易患变应性疾病或其它IgE相关疾病的人或动物。本发明方法所使用的IFN可以来自于任何产生IFN的动物，包括但不限于灵长类动物、羊、牛和其它动物。在本发明的另一个技术方案中，哺乳动物IFN被用于本发明的方法中以便治疗患有或易患变应性疾病的或其它需要抑制IgE产生或应答的状况或疾病的人或动物，所述哺乳动物IFN含有能够提供IFNτ的低毒性而具有其它I型IFN的生物活性的氨基酸序列。在一个优选的技术方案中，将有效量的含有哺乳动物IFNτ氨基端和人I型IFN羧基端(如来源于IFNα)的嵌合体IFN施用给患有或易患变应性疾病或其它IgE相关疾病的人或动物。更优选地，嵌合体IFN蛋白含有羊IFNτ的1-27位氨基酸残基和人IFNα的28-166位氨基酸残基。在一个举例性的技术方案中，所述IFNα是IFNαD。
本发明还涉及利用I型干扰素抑制体内和体外IgE产生和细胞增殖的方法。如本文的实例，来源于经卵白蛋白(OVA)免疫的动物的脾细胞通过IFNτ或嵌合IFNτ蛋白可抑制OVA诱导的增殖和IgE的产生。因此，本发明的方法可以被用于抑制动物或人中IgE的产生。本发明的方法还可用于体外抑制IgE产生。
本发明还涉及用于抑制包括细胞增殖和细胞因子产生在内的B细胞和T细胞应答的方法。如本文实施例，I型IFN可以被用于抑制IL-4的产生。细胞因子IL-4在B细胞向IgE产生的同种型转换中起重要作用。
本发明多肽的生物活性突变蛋白(mutein)以及其它具有与本发明IFN多肽基本相同的抑制IgE的生物活性的分子如片段、肽和变体被认为是在本发明的方法范围内。例如，具有与天然多肽相比突变体多肽的生物活性和功能没有发生实质性降低的氨基酸取代、插入或缺失的IFNτ多肽就在本发明的保护范围内。具体地讲，被认为在本发明的保护范围内的是仍保留了与全长IFN基本相同的生物活性的I型IFN片段。IFN的突变蛋白和片段可以通过利用本技术领域已知的标准技术来制备。例如，技术人员通过利用Bal31外切核酸酶(Wei等，1983)能够从所述多核苷酸的一端或两端系统地去除核苷酸以便产生一系列的多核苷酸片段，这些多核苷酸片段被表达时就产生了由该多核苷酸编码的IFN片段。
本发明的多肽以及含有该多肽的组合物的治疗应用可以通过任何现有的或本技术领域的技术人员能预知的合适治疗方法和技术来实现。所述多肽可以通过本技术领域已知的任何适当途径来进行用药，包括例如口服、肠胃外、皮下或静脉内的用药途径。本发明多肽的用药可以是能够由本技术领域的技术人员容易确定的连续用药或在不同间隔时间用药。
本发明还涉及嵌合体IFN多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。在一个技术方案中，嵌合体IFN含有羊和人IFN区域。优选地，一种本发明的嵌合体IFN蛋白含有羊IFNτ氨基端和人IFNa羧基端。在一个举例性的技术方案中，嵌合体IFN蛋白含有羊IFNτ的1-27位氨基酸残基和人IFNαD的28-166位氨基酸残基。编码本发明的嵌合体IFN的多核苷酸序列可以由本技术领域知晓本发明多肽氨基酸序列的技术人员方便地进行构建。正如本技术领域的技术人员可以得知的，由于遗传密码的简并性，可以构建出许多不同的多核苷酸序列。特定核苷酸序列的选择取决于例如特定表达系统的密码子用法。
可用于本发明的化合物可以按照制备药用组合物的已知方法来配制。配制方法已被详细地记载在许多对于本技术领域的技术人员来说是已知的和容易获得的文献资料中。例如，由E.W.Martin编写的雷明顿制药科学(Remington’s Pharmaceutical Science) 记载了可以用于本发明的配制方法。总而言之，本发明的组合物将以有效量的生物活性多肽与合适载体混合的方式来配制从而方便和有效地进行所述组合物的用药。用于本发明方法的组合物还可以是多种形式。这些形式包括，例如固体、半固体和液体的剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体溶液或悬浮液、栓剂、可注射的和可灌输的溶液，以及喷雾。首选的剂型决定于将要进行的用药方式和治疗应用。所述组合物还优选地包括本技术领域技术人员熟知的、常规的药学上可接受的载体和稀释剂。
还可以通过利用脂质体技术、缓释胶囊、包埋泵和可生物降解容器来进行本发明化合物的用药。这些递送方法可以在一段延续的时间内有效地提供均匀的剂量。
与本发明的多肽一起使用的载体或稀释剂的实例包括乙醇、二甲亚砜、甘油、氧化铝、淀粉以及等同的载体和稀释剂。为了提供适合于所需治疗方法的配药施用方法，有利地是，本发明新型药物组合物可包含总体上占包括载体或稀释剂在内的组合物总重量大约0.1％至45％，具体地1％至15％的一种或多种多肽。
本文参考或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物被全文引入进行参考从而使它们与本说明书的详细教导一致。
材料和方法干扰素利用一种合成基因构建物(Heeke等，1996)在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中表达羊干扰素tau(IFNτ)基因。IFNτ被分泌到培养基中并且通过连续的DEAE-纤维素和羟基磷灰石层析法被纯化到由SDS-PAGE和银染色分析法所测定的电泳级均一度。纯化的蛋白具有的比活性是2.9-4.4×107U/mg蛋白，该比活性为测定的抗病毒活性，该活性通过利用MDBK的标准病毒微小噬菌斑减少分析方法来测定。(Pontzer等，1991)。重组人IFNαD来源于BiosourceInternational，Camarillo，CA。所述“人源化的”IFNτ/IFNαD嵌合体蛋白通过利用羊IFNτ的1-27位残基和人IFNαD的28-166位残基来构建并且如羊IFNτ所述在巴斯德毕赤氏酵母中进行表达。
免疫前96小时，IFNτ以5×105U/小鼠。每天的剂量进行腹膜内(ip)用药并且从此以后每天持续用药维持一个月。对照鼠使用PBS。小鼠的免疫采用在100μl总体积中被5mg氢氧化铝凝胶沉淀的10μg卵白蛋白(OVA)(Sigma，St.Louis，MO)对BALB/C小鼠进行腹膜内免疫。氢氧化铝凝胶是按照已述方法制备的(Revoltella等，1969；Warner等，1968)。初始免疫后7天采用同样的方案再次对该小鼠进行免疫。免疫后的第19天和20天将所述小鼠暴露给由PBS中的1％OVA(w/v)雾化的OVA。利用Parils Jet+雾化器和压缩机(Pari RespiratoryEquipment，Inc.，Midlothian，Virginia)进行20分钟的雾化。小鼠被圈养在动物资源中心(Animal Resource Center)(弗罗里达大学)，并且所有试验动物的使用都得到公共机构的动物饲养和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC))的批准。组织学评价从气管内给已被暴露给雾化OVA的OVA-免疫小鼠的肺灌注4％的多聚甲醛溶液。所述肺被固定在同样的溶液中2-3天，然后将肺样品包埋在石蜡中并切片。接着用苏木精和曙红将所述样品染色。并且用玻片制备来源于同样小鼠的血涂片，利用“LEUKOSTAT”染色试剂盒(FisherScientific，Pittsburgh，PA)将所述玻片染色以便进行分化白血细胞的计数测定。总共评估了150个白血细胞。增殖的分析从经PBS或IFNτ处理小鼠免疫后21天取出的脾细胞在有OVA存在的条件下于含10％FBS的RPMI 1640培养基中以5×105细胞/孔培养72至84小时。在另一种分析方法中，将PBS-处理的小鼠脾细胞在有OVA和各种IFN(10,000至15,000U/ml)存在的条件下以5×105细胞/孔培养72至84小时。所述培养物用[3H]-胸苷(1.0uCi/孔；Amersham，Indianapolis，IN)进行脉冲并在12小时后利用细胞收集器将培养物收集到滤纸盘上。细胞相关放射性通过利用β-闪烁仪来进行定量并以cpm表示活性。利用U266BL骨髓瘤B细胞进行的增殖分析是按照以下方式进行的在RPMI 1640培养基中将细胞培养过夜，然后在含4％FBS的RPMI 1640中以10,000至15,000U/ml的各种IFN培养4×105细胞/孔。所述培养物被培养72-84小时后用[3H]-胸苷对细胞进行脉冲，并在12小时后收集细胞。细胞相关放射性通过利用β-闪烁仪进行定量并以cpm表示活性。从患者外周血中分离的U266BL细胞系(一种产生IgE的骨髓瘤)提供了一种可用于评估IFNτ对IgE生成细胞所产生的直接作用的体系(Nilsson等，1970)。该细胞系使得人们能够研究IFNτ对具有不间断IgE合成的B细胞的作用。酶联免疫吸附分析OVA被悬浮在结合缓冲液(0.1M碳酸盐/重碳酸盐，pH9.6)中并以2μg/孔的浓度被吸附到96-孔塑料组织培养板的孔底上并于4℃下过夜，然后蒸发干燥。所述板用封闭缓冲液，含5％奶粉的PBS处理2小时以便封闭非特异性结合，然后用含有0.05％Tween 20的PBS清洗三遍。将从经IFNτ-处理的或PBS-处理的BALB/C小鼠或未被免疫的(未接触抗原的)小鼠身上取到的血清以各种稀释度加到孔中并于室温下培养3小时。彻底清洗后，加入兔抗小鼠IgE抗体(Accurate，NY)。在加入1∶1000稀释度的与辣根过氧化物(HRP)缀合的山羊抗兔免疫球蛋白(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway NJ)前将板清洗三遍。在加入底物溶液(0.002M邻苯二胺二盐酸盐，0.012％H2O2，0.05M柠檬酸钠，0.05M柠檬酸)后，在490ηm下通过ELISA平板计数器(BioRad，Richmond，CA)监测染色的形成，用2M H2SO4终止反应。
为了测定血液中的IL-4，从PBS或IFNτ处理的小鼠身上采集血清样本并在结合了兔抗小鼠IL-4多克隆抗体(BiosourceInt.，Camarillo，CA)的96-孔板中孵育。清洗后，加入25μg/ml的大鼠单克隆抗小鼠IL-4的生物素化抗体并培养1小时。培养和清洗后加入1∶1000稀释度的缀合HRP的抗生物素蛋白，按照上述方法监测底物颜色的生成。IL-4 ELISA的检测极限是7ng/ml。蛋白质印迹将IFN或培养基处理的OVA-致敏脾细胞和U266BL骨髓瘤B细胞的培养上清液分别以10μg/泳道的量加样到15％和10％SDS-PAGE READY凝胶上(BioRad，Richmond，CA)，在100伏特的电压下跑胶。过夜转移到硝酸纤维素膜上，然后用配制在pH7.5的Tris缓冲盐水，0.1％Tween 20中的5％牛奶将所述膜封闭1小时。用1∶1000稀释度的偶联到HRP上的山羊抗人IgE(Biosource Int.，Camarillo，CA)或兔抗小鼠IgE(Accurate，NY)温育免疫印迹膜。小鼠IgE印迹在清洗三次后进一步用缀合了HRP的抗兔Ig(Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NY)温育1小时。印迹被清洗后通过膜显影进行分析。IFN的毒性分析通过在有各种浓度IFNτ、IFNαD和嵌合IFNτ/IFNαD存在的条件下将HPBMC培养7天来进行利用人外周血单核细胞(HPBMC)的毒性分析。HPBMC的代谢活性利用 WST-1(Boehringer-Mannheim，Indianapolis，IN)来评估，该评估方法是依据活细胞中线粒体脱氢酶的酶活性测定细胞增殖以及存活力。
下面是对实现本发明的方法进行说明的实施例。这些实施例不应被理解为对本发明的限制。除了另有说明，所有百分比都是指重量百分比，所有溶剂混合物的比例都是指体积比。实施例1 IFNτ抑制小鼠中的OVA-特异性IgE抗体的产生如图1A所示，注射(ip)OVA-氢氧化铝前开始每天注射5×105单位的IFNτ结果阻断了超过50％的IgE产生。甚至该阻断一直持续到所述小鼠受到雾化OVA的攻击(图1B)。因此，在通过注射OVA对小鼠进行免疫和吸入OVA进行刺激的条件下，IFNτ抑制了OVA特异性IgE抗体的产生。实施例2 经IFNτ处理的小鼠的炎症细胞浸润被减弱OVA免疫的小鼠在用IFNτ处理后采用雾化OVA进行攻击以便确定IFN处理是否抑制炎症细胞向肺部的浸润。IFNτ对细胞浸润的抑制如图2所示，其中比较了未接触抗原的(图2A)、PBS处理的(图2B)和IFNτ处理的(图2C)小鼠的肺切片。PBS处理小鼠的细支气管内侧的上皮组织完整性的破坏(图2B)相对于IFNτ处理小鼠的保护性(图2C)是明显的。评估经IFNτ和PBS处理的(对照)小鼠的细支气管和血管周围的嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和淋巴细胞的浸润情况。很明显，与PBS处理小鼠相比，经IFNτ处理的小鼠的细支气管更少发生细支气管周围粒细胞聚集，前者为64％，后者为20％(表I)。表I.IFNτ减弱了OVA-诱导的炎症细胞向细支气管的浸润肺切片粒细胞聚集 淋巴细胞聚集处理 (％气管(Airways))(％气管)PBS 64±6.0 78±7.0IFNτ20±7.0 34±3.0未接触抗原 00
血涂片嗜酸性细胞 嗜碱性细胞 嗜中性细胞 单核细胞 淋巴细胞％) (％) (％)(％) (％)PBS 11±5.0 6.0±1.020±0.710±1.458±6.0IFNτ 2.5±0.71.5±0.715±1.45.0±1.4 72±8.0未接触抗原 0.2±0.30.5±0.719±1.410±0.771±4.0*按照材料和方法部分中描述的方法在OVA免疫前3天开始每天以5×105U的IFNτ处理(ip)小鼠。
计算出具有细支气管周围聚集物的气管并除以每一切片中检测到的细支气管总数。通过血涂片的差示白细胞计数被表示为细胞类型的百分数。对细支气管周围粒细胞和淋巴细胞聚集物的抑制的统计学显著性通过IFNτ处理相对于PBS处理的x2试验来表示(p＜0.001)。IFNτ处理对嗜酸性细胞(p＜0.05)和嗜碱性细胞(p＜0.1)的抑制相比于PBS处理的统计学显著性通过Student’s t检验来表示。
而且，经PBS处理的小鼠有78％的肺细支气管发生淋巴细胞浸润，而IFNτ处理的情况只发生了34％的浸润。另外，对小鼠血进行的差示计数表明IFNτ处理的小鼠与PBS处理组相比具有较低水平的嗜酸性细胞和嗜碱性细胞，而与PBS处理的或未接触抗原的(未被免疫的)小鼠相比，嗜中性细胞、单核细胞和淋巴细胞的水平没有明显的差别。因此，该数据表明当暴露给雾化的OVA变应原时，IFNτ处理抑制了炎症细胞向OVA致敏-小鼠的肺部的浸润。实施例3-经IFNτ-处理的小鼠的IL-4水平低于对照小鼠经过雾化OVA暴露后，测定经PBS、IFNτ处理的小鼠或未被免疫(未接触抗原的)小鼠血清中的IL-4浓度，所述雾化OVA暴露是在免疫后20天进行的。以前已经表明IL-4可能是诱导B细胞中的IgE同种型转换所必需的(Lanzavecchia等，1984；Coffmann，Carty等，1986；Coffmann，Ohara等，1986；Rothman等，1988)。如图3所示，IFNτ-处理组中的IL-4浓度比PBS-处理组中的IL-4浓度低一半多。实施例4-体内IFNτ-处理抑制OVA特异性脾细胞增殖
OVA免疫后20天，从未被免疫(未接触抗原的)小鼠和PBS-或IFNτ-处理的OVA-免疫小鼠身上取出脾以便测定IFNτ处理对由OVA诱导的增殖的抑制效果。将脾细胞在有OVA存在的条件下培养84小时，然后评估增殖情况。如图4所示，与PBS处理的对照小鼠相比，在IFNτ-处理的小鼠的脾细胞中观察到的响应OVA的增殖明显更低。由于牛血清白蛋白(BSA)和髓鞘碱性蛋白(MBP)不激活脾细胞(图4插图)，所以所述增殖活性对于OVA是特异的。因此，变应原-致敏小鼠的体内IFNτ处理抑制了响应变应原的细胞增殖。实施例5 OVA-致敏的脾细胞的体外IFN处理抑制了OVA-特异性脾细胞增殖为了测定各种IFN对预先致敏的细胞的作用，采用各种IFN对OVA致敏的脾细胞进行体外处理。OVA免疫后20天并且在雾化OVA处理后，取出脾并用各种I型IFN培养84小时，然后评估其增殖情况。除了羊IFNτ，还检测了人IFNαD和嵌合体IFNτ/IFNαD对由OVA诱导的增殖的作用。该嵌合体作为一种可以用于人类治疗目的的潜在“人源化的”IFNτ而检测。如图5所示，IFNτ和IFNaD抑制了OVA特异性脾细胞的增殖。而且，IFNτ/IFNαD嵌合体也具有抑制作用，其中所述嵌合体含有羊IFNτ的1-27位氨基酸残基和人IFNαD的28-166位氨基酸残基。因此，采用I型IFN体外处理OVA致敏的脾细胞抑制了细胞增殖。实施例6 I型IFN抑制小鼠和人的IgE产生对从在图4和图5中进行的增殖分析实验中得到的培养上清液进行IgE抗体的免疫印迹检测。如图6A所示，在含有PBS处理的脾细胞并在有OVA存在的条件下培养的培养物中检测到了IgE。在经IFNτ处理的小鼠的脾细胞上清液中很少或没有IgE。免疫印迹检测OVA致敏小鼠脾细胞的体外IFN处理的培养上清液中的IgE，结果表明，相对于培养基对照，所有I型IFN抑制了IgE的产生(图6B)。然而，嵌合体IFNτ/IFNαD蛋白和嵌合体IFNαD蛋白是比IFNτ更好的抑制剂。
为了检测IFN是否对人IgE生成B细胞直接进行作用，采用I型IFN培养U266BL人骨髓瘤细胞系，该细胞系组成性产生IgE抗体。采用包括嵌合体IFNτ/IFNαD在内的各种IFN处理前，先使细胞饥饿过夜。在用IFN培养96小时后，收集上清液并通过免疫印迹测定IgE的浓度。如图6C所示，IFN处理组中的IgE浓度低于培养基对照。因此，I型IFN可抑制U266BL人骨髓瘤细胞和OVA-特异性小鼠B细胞产生IgE抗体。实施例7-IFN抑制人IgE生成骨髓瘤细胞的增殖将U266BL骨髓瘤细胞在有10,000U/ml的IFN存在的条件下培养72小时，然后测定其增殖情况。所有IFN抑制细胞增殖大约50％或更多，其中IFNαD的抑制作用最强而IFNτ的抑制作用最低(图7)。对存活性进行了测定，表明与IFNτ(80％的存活性)和IFNτ/IFNαD嵌合体(75％的存活性)相比，IFNαD的毒性最强(67％的存活性)。IFNτ/IFNαD嵌合体对增殖的抑制作用比IFNτ强，但不如IFNαD强。因此，具有不同毒性水平的I型IFN可抑制人IgE-产生细胞系U266BL的增殖。实施例8-IFNτ/IFNαD嵌合体对人外周血单核细胞(HPBMC)没有毒性比较IFNτ/IFNαD嵌合体与重组羊IFNτ和重组人IFNαD对HPBMC的毒性。用各种浓度的IFN(250至100,000U/ml)处理HPBMC 7天后，依据存活细胞中的线粒体脱氢酶酶活性测定毒性。如图8所示，与在任何浓度下都没有显示出毒性的羊IFNτ和IFNτ/IFNαD嵌合体相比，人IFNαD在1,000至100,000U/ml浓度下具有毒性。因此，如同IFNτ一样，IFNτ/IFNαD嵌合体缺少与人IFNαD有关的毒性。
应当理解本文中记载的实施例和技术方案仅仅是为了说明，任何修改或改动对于本技术领域的技术人员来说都是显而易见的，并且都属于本申请的实质内容和范围，也属于所附权利要求的保护范围。
参考文献Bazer，F.W.，H.L.Johnson，J.K.Yamamoto(1989)″羊滋养层蛋白-1(oTP1)对猫(FIV)和人(HIV)免疫缺陷病毒复制影响(摘要)″，生物复制(Biol.Reprod.)40(增刊(Suppl.))63.Bazer，F.W.，H.M.Johnson(1991)″I型孕体干扰素妊娠信号的母体识别和潜在的治疗药物″，美国复制免疫学杂志(Am.J.Reprod.Immunol.)2619-22.Beck L.，H.L.Spiegelberg(1989)″被注射了明矾或完全弗氏佐剂中的卵白蛋白的小鼠对多克隆和抗原-特异性IgE和IgG亚类的应答反应″，细胞免疫学(Cellular Immunol.)1231-8.Benoit，P.，D.Maguire，I.Plavec，H.Kocher，M.Tovey，F.Meyer(1993)″相对于重组人IFN-α受体的单克隆抗体抑制人IFN-α，IFN-β，IFN-ω的生物活性.细胞的I型IFN受体的多相性检测″，免疫学杂志(J.Immunol.)150(3)707-716.Bonnem，E.M.，R.J.Spiegel(1984)″干扰素α现状与未来″，生物应答反应杂志(J.Bio.Response)第3版(Modifiers)3(6)580-598.Coffman R.L.，J.Carty(1986)″一种增强多克隆抗体IgE产生的T细胞活性以及被干扰素γ的抑制″，免疫学杂志(J.Immunol.)136949-954.Coffman，R.L.，J.Ohara，M.W.Bond，J.Carty，A.Zlotnik，W.E.Paul(1986)″B细胞刺激因子-1增强脂多糖-活化的B细胞产生的IgE应答反应″，免疫学杂志(J.Immunol.)1364538-4541.Davis，G.L.，L.A.Balart，E.R.Schiff等. (1989)″采用重组干扰素-α治疗慢性丙型肝炎.多中心随机的调控实验″，新英格兰药学杂志(N.Engl.J.Med.)321(22)1501-1506.DeMaeyer，E.等.(1988)干扰素和其它细胞调节因子，John Wileyand Sons，纽约(New York)。Dolen，J.G.，A.Mathur(1995)″遗传过敏性皮炎患者血清中的不可测干扰素-α浓度″，干扰素细胞因子研究杂志(J.InterferonCytokine Res.)15(11)973-975.Dusheiko，G.M.，A.C.Paterson，L.Pitcher等.(1986)″重组白细胞干扰素治疗慢性乙肝.两个药学实验的分析方法″，血液学杂志(J.Hematology)3(增刊2)S199-S207.Finter，N.B.，S.Chapman，P.Dowd等.(1991)″α-干扰素在病毒感染中的用途″，药物(Drugs)42(5)749-765.Godkin，J.D.，F.W.Bazer，J.Moffatt，F.Sessions，R.M.Roberts(1982)″由13-21天的羊胚泡滋养层释放的主要低分子量蛋白的纯化和特性″，复制受精杂志(J.Reprod.Fertil.)65141-150.Gruschwitz，M.S.，K.P.Peters，A.Heese，N.Stosiek，H.U.Koch，O.P.Hornstein(1993)″α-干扰素-2b对严重遗传过敏性湿疹患者的临床病程，炎症皮肤浸润和外周血淋巴细胞的影响″，初始变态反应免疫学(Int.Arch Allergy Immunol.)101(1)20-30.Hamelmann，E.，A.Oshiba，J.Paluh，K.Bradley，J.Loader，T.A.Potter等.(1996)″气管致敏鼠模型中气管过强反应形成过程中的CD8+必需T细胞″，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1861719-29.Hamelmann，E.，A.Oshiba，J.Schwarze，K.Bradley，J.Loader，G.L.Larsen等.(1997)″对于变应原-特异性气管过强反应形成必需的IgE和IL-5″，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Respir.CellMol.Biol.)16674-82.Heeke，G.V.，T.L.Ott，A.Strauss，D.Ammaturo，F.W.Bazer(1996)″由巴斯德毕赤氏酵母高表达和分泌羊妊娠识别激素干扰素-tau″，干扰素研究杂志(J.Interferon Res.)16119-126.Hofstra，C.L.，I.Van Ark，G.Hofman，F.P.Nijkamp，P.M.Jardieu，A.J.Van Oosterhout(1998)″内源性和外源性α-干扰素对过敏性哮喘小鼠模型中的免疫球蛋白E细胞浸润和气管反应性的分化作用″，美国呼吸细胞分子生物学杂志(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.)19(5)826-835.Imakawa，K.，R.V.Anthony，M.Kazemi，K.R.Marotti，H.G.Polites，R.M.Roberts(1987)″由胚胎滋养外胚层分泌的羊滋养层蛋白的干扰素类序列″，自然(Nature)330377-379.Johnson，H.M.，F.W.Bazer，B.E.Szente，M.A.Jarpe(1994)″干扰素的抗病机理″，美国科学(Sci.Am.)270(5)68-75.Kay，A.B.，C.J.Corrigan(1992)″嗜酸性细胞和中性细胞(Eosinophils and neutrophils)″英国药学公报(Br.Med.Bull.)4851-64.Khan，O.A.，H.Jiang，P.S.Subramaniam，H.M.Johnson，S.S.Dhib-Jalbut(1998)″重组羊干扰素tau的免疫调节功能在多发性硬化症和自身免疫疾病治疗中的潜在用途″，多发性硬化症(MultipleSclerosis)463-69.Kashima，H.，B.Leventhal，K.Clark等.(1988)″少年发作复发性呼吸乳头瘤病中的干扰素-α-nl(Wellferon)在12个合作研究机构中进行的随机化研究结果″，喉镜(Laryngoscope)98(3)334-340.Kimata H.，Y.Akiyama，M.Kubota，K.Furusho(1995)″干扰素-α对严重的遗传过敏性皮炎的治疗作用″，变态反应(Allergy)50(10)837-840.Lack，G.，K.L.Bradley，E.Hamelmann，H.Renz，J.Loader，D.Y.Leung，G.Larsen，E.W.Gelfand(1996)″雾化IFN-γ抑制小鼠体内的次级过敏反应的发生″，免疫学杂志(J.Immunol.)157(4)1432-1439.Lanzavecchia，A.，B.Parodi(1984)″由人同种异体反应性的T-辅助克隆以单一前体浓度体外刺激体IgE的产生″，临床实验免疫学(Clin.Exp.Immunol.)55197-203.Mancino，D.，Z.Ovary(1980)″不定形二氧化硅和氢氧化铝对不同的同系增殖的小鼠品种中IgE和IgGI抗体产生的辅助作用″，初始变态反应应用免疫学(Int.Archs Allergy appl.immun.)61253-258.Miguel，N.M.R.，E.M.Vaz(1977)″氢氧化铝凝胶对小鼠体内次级应答反应的作用″，初始变态反应应用免疫学(Int Archs Allergyappl.Immun.)54382-384.Mujtaba，M.G.，W.J.Steit，H.M.Johnson(1998)″IFNτ抑制患有慢性实验过敏性脑脊髓炎的小鼠的体液和细胞自动反应性免疫并且稳定诱导缓解病症″，细胞免疫(Cellular Immunol.)18694-102.Mujtaba，M.G.，J.M.Soos，H.M.Johnson(1997)″CD4 T抑制细胞介导干扰素tau防御实验性过敏性脑脊髓炎″，神经免疫学杂志(J.Neuroimmunol).7535-42.Nilsson，K.，H.Bennich，S.G.O.Johansson，J.Ponten(1970)″由一种IgE骨髓瘤患者建立产生免疫球蛋白的骨髓瘤(IgE)和淋巴瘤(IgG)细胞系″，临床实验免疫学(Clin.Erp.Immunol.)7477-489.Noh，G.W.，K.Y.Lee(1998)″作为预测γ-干扰素治疗遗传过敏性皮炎预后测定的嗜酸性血细胞和血清IgE″，变态反应(Allergy)53(12)1202-1207.Oldham，R.K.(1985)″用于癌症治疗的生物制品干扰素″，医院实践(Hospital Practice)20(12)71-74.Pontzer，C.H.，F.W.Bazer，H.M.Johnson(1991)″妊娠识别激素，羊滋养层蛋白-I的抗增殖活性″，癌症研究(Cancer Res).515304-5307.Pontzer，C.H.，T.L.Ott，F.W.Bazer，H.M.Johnson(1994)″干扰素-tau的结构/功能研究多活性位点的证据″，干扰素研究杂志(J.Interferon Res)14133-141.Quesada，J.R.，J.Reuben，J.T.Manning，E.M.Hersh，J.U.Gutterman(1984)新英格兰医学杂志(New England Journal ofMedicine)31015.Rovoltella，R.，Z.Ovary(1969)“Preferential production ofrabbit reaginic antibodies”Int Arch Allergy 36282-289.Rothman，P.，S.Lutzker，W.Cook，R.Coffman，F.W.Alt(1988)″促细胞分裂素和白介素-4诱导B淋巴细胞中的Cε转录″，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1682385-9.Soos，J.M.，H.M.Johnson(1995)″I型干扰素抑制超抗原诱导的刺激作用用于治疗超抗原-相关疾病″，IFN细胞因子研究杂志(J.IFN Cytokine Res.)1539-45.Soos，J.M.，P.S.Subramaniam，A.C.Hobeika，J.Schiffenbauer，H.M.Johnson(1995)″干扰素妊娠识别激素、干扰素tau无相关毒性地阻断实验性过敏性脑脊髓炎的发病和超抗原的再活化″，免疫杂志(J.Immunol.)1552747-2753.Soos，J.M.，M.G.Mujtaba，P.S.Subramaniam，W.J.Steit，H.M.Johnson(1997)″口服干扰素τ能够预防实验性过敏性脑脊髓炎的急性和慢性的复发形式″神经免疫杂志(J.Neuroimmunol.)7543-50.Subramaniam，P.S.，S.A.Khan，C.H.Pontzer，H.M.Johnson(1995)″干扰素τ和α对I型干扰素的特异性识别产生完全不同的细胞毒性″，美国国立科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)9212270-12274.Warner，N.L.，N.M.Vaz，Z.Ovary(1968)″小鼠体内抗体反应中的免疫球蛋白种类.I.通过生物特性进行分析″Immunology，Long 14725-34.Wei.C.F.et al.(1983)″具有不同动力学特性的且来源于Alteromonas espejiana的两种分子类型的BAL 31核酸酶的分离和比较″，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)258(22)13506-13512.
Whaley，A.E.，C.S.Meka，L.A.Harbison，J.S.Hunt，K.Imakawa(1994)″来源于人胎盘的特定干扰素mRNA的识别和细胞定位″，生物学杂志(J.Biol.Chem.)26910864-10868。
权利要求
1.一种减弱或抑制IgE产生的方法，所述方法包括施用有效量的I型干扰素，或其生物活性突变蛋白、片段、变体或肽。
2.一种如权利要求1所述的方法，其中所述I型干扰素选自IFNα、IFNβ、IFNτ和IFNω。
3.一种如权利要求2所述的方法，其中所述I型干扰素是IFNτ。
4.一种如权利要求1所述的方法，其中所述I型干扰素是含有选自IFNα、IFNβ、IFNτ和IFNω的至少两种IFN的部分的嵌合体IFN。
5.一种如权利要求4所述的方法，其中所述嵌合体IFN含有哺乳动物IFNτ氨基端和除IFNτ之外的人I型IFN的羧基端。
6.一种如权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物IFNτ氨基端来源于选自灵长类、羊和牛的哺乳动物。
7.一种如权利要求5所述的方法，其中所述的嵌合体IFN含有羊IFNτ的从大约1至大约27位的氨基酸残基和人IFNα的从大约28至大约166位的氨基酸残基。
8.一种如权利要求7所述的方法，其中所述的IFNα是IFNαD。
9.一种如权利要求1所述的方法，其中所述I型干扰素被施用给需要减弱或抑制IgE产生的人或动物。
10.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的减弱或抑制IgE产生是通过抑制B-细胞分泌IgE或抑制B-细胞增殖来实现的。
11.一种如权利要求9所述的方法，其中所述I型干扰素通过选自口服、肠胃外用药、皮下用药和静脉内用药的途径来进行施用。
12.一种如权利要求11所述的方法，其中所述人或动物患有或易患IgE相关疾病。
13.一种如权利要求12所述的方法，其中所述IgE相关疾病是选自过敏性鼻炎、遗传过敏性皮炎、支气管哮喘和食物过敏的过敏性疾病。
14.一种如权利要求1所述的方法，其中所述I型干扰素是在体外施用。
15.一种如权利要求1所述的方法，其中所述的I型干扰素与药学上可接受的载体或稀释剂进行配制。
16.含有嵌合体I型干扰素或其生物活性突变蛋白、片段、变体或肽的组合物，其能够减弱或抑制IgE产生，其中所述嵌合体IFN含有选自IFNα、IFNβ、IFNτ和IFNω的至少两种IFN的部分。
17.如权利要求16所述的组合物，其中所述的减弱或抑制IgE产生是通过抑制B-细胞分泌IgE或抑制B-细胞增殖来实现的。
18.如权利要求16所述的组合物，其中所述的嵌合体IFN含有哺乳动物IFNτ氨基端和除IFNτ之外的人I型IFN羧基端。
19.如权利要求18所述的组合物，其中所述哺乳动物IFNτ氨基端来源于选自灵长类、羊和牛的哺乳动物。
20.如权利要求18所述的组合物，其中所述的嵌合体IFN含有羊IFNτ从大约1至大约27位的氨基酸残基和人IFNα从大约28至大约166位的氨基酸残基。
21.如权利要求20所述的组合物，其中所述的IFNα是IFNαD。
22.如权利要求16所述的组合物，其中所述的嵌合体IFN是重组产生的，并在巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)中进行表达。
23.一种编码权利要求16所述嵌合体IFN的多核苷酸。
24.一种减弱或抑制IL-4产生的方法，该方法包括使免疫细胞与I型干扰素或其生物活性突变蛋白、片段、变体或肽接触。
全文摘要
本发明涉及用于治疗过敏性疾病如过敏性鼻炎、遗传过敏性皮炎、支气管哮喘和食物过敏患者的新型方法和物质。本发明的方法包括给过敏性疾病患者施用干扰素tau(IFNτ)或嵌合体IFN(羊IFNτ(1－27)/人IFNαD(28－166))。用药后,IFNτ和嵌合体IFN可抑制IgE抗体的产生而没有毒副作用。本发明还涉及可以用于本发明方法的嵌合体羊/人IFN。
文档编号C07K19/00GK1376165SQ00813481
公开日2002年10月23日 申请日期2000年8月25日 优先权日1999年8月27日
发明者H·M·约翰逊, M·G·姆吉塔巴 申请人:佛罗里达大学