专利名称：用于治疗骨质疏松症的甲状旁腺激素类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及人体甲状旁腺激素类似物，该药物被发现可以有效治疗骨质疏松症。
背景技术：
骨质疏松症是造成老年人，特别是老年妇女残疾的主要原因。最近已认识到人体甲状旁腺激素(hPTH)和某些类似物是促进骨骼生长的刺激物，其益于治疗骨质疏松症。骨质疏松症是一种不断恶化的疾病，最终导致骨骼总质量的减少和骨骼脆性的增加。这也常常导致了负载骨骼的自发骨折和精神、肉体非移动伤害的退化特征。
绝经后的骨质疏松症是由于雌性激素的消失造成的，雌性激素的消失触发了长达十多年的加速增加旧骨骼消溶与新骨质形成之间的不平衡的骨骼的转变。并导致了负载骨骼变细、孔隙度增加和小梁的损耗。骨质疏松症也和甲状腺机能亢进、甲状旁腺功能亢进、库兴氏综合症和某些类固醇药物使用有关，传统的治疗方法包括在饮食中增加钙质、雌激素治疗和增加维他命D的剂量，但是主要的是具有如抑制破骨细胞吸收作用的反吸收药物的药剂。
甲状旁腺激素(PTH)是由甲状旁腺产生的，是血液中钙含量的主要调节者。PTH是一种多肽，合成的多肽可以通过由Erickson和Merrifield公开的方法来制备，见The Protein，Neurath等人.，Eds.，AcademicPress，New York，1976，Page257，并且通过Hodges等人(1988)PeptideResearch 119或者通过Atherton，E.和Sheppard，R.C.Solid PhasePeptide Synthesis，IRI Press，Oxford，1989的方法改进。
当血清中钙质减少到正常水平以下，甲状旁腺释放PTH并且钙质水平通过骨骼钙质的消溶、通过来自肠的钙质的吸收、通过来自肾小管原尿的钙的肾脏重吸收而增加。虽然连续注入的低水平的PTH能够移去骨骼中的钙质，但是间歇性注入同样低剂量的PTH实际上促进了骨骼的生长。
在美国专利4086196中，Tregear描述了人体甲状旁腺激素类似物并且声称根据在一次体内vitro细胞化验的腺苷酸环化酶的刺激物，起初的27-34个氨基酸是最有效的。在美国专利4771124中，Rosenblatt公开了人体甲状旁腺激素类似物的特征，其中，Trp23由氨基酸苯基丙氨酸、亮氨酸、已氨酸、缬氨酸、酪氨酸、β-萘胺，α-萘胺替代作为一种PTH对抗剂。这些改进的hPTH类似物也去掉了2和6终端氨基酸，导致了在治疗骨质疏松症中失去了促效药大部分活性。这些类似物设计为PTH和与PTH有关的肽的抑制剂。这些类似物被宣称可能对于治疗与某些肿瘤有关的过量血钙有用。
在1993年4月15日公布的WO93/06845中，Pang等人描述了包括hPTH类似物Arg25、Lys26、Lys27替代物，其带有大量氨基酸，包括丙氨基酸、天冬酰胺酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸盐、谷氨酸、氨基乙酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、苯基丙氨酸、脯胺酸、丝胺酸、苏胺酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸。他们同时宣称该类似物对骨质疏松症的治疗有效并且对血压和平滑肌的影响很小，但没有提供来自动物或人体试验的支持数据。
其它公开所关注hPTH类似物的参考文献是Condon和Morze的PCT专利WO9851324，Chorev等人的美国专利5747456，和Rosenblatt等人的美国专利5717062。这些参考文献公开了一些涉及13-17和26-30环化的单环和双环环化物。
PTH通过两个第二信使系统----Gs-蛋白质活性腺苷酸环化酶(AC)和Gq-蛋白质活性磷脂酶Cβ的活性进行控制。后者导致一种由胞结合蛋白质激酶Cs(PKC)活性的刺激。在一老鼠的骨肉瘤(RCO)细胞系中显示，PKC活性需要PTH29-32残基(Jouishomme等人(1994)J.Bone MineralRes.9，(1179-1189))。已经确立骨骼生长的提高，即对于治疗骨质疏松症的效果是通过与肽序列性能的结合来增加AC活性。自然的h(PTH)-(1-34)序列已经显示具有所有这些活性。典型的h(PTH)-(1-34)序列显示为(A)Ser Val Ser Glu Lle Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys HisLeu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys LeuGln Asp Val His Asn Phe-OH(系列ID号1)A以下直线型类似物，hPTH-(1-31)-NH2，仅具有AC-刺激活性并且在切除卵巢的老鼠模形中骨骼损失的恢复中显示是完全活性的(Rixon，R.H.等人(1994)J.Bone Miner.Res.9，1179-1189；Whitfield等人(1996)，Calcified Tissue Int.58，81-87；Willick等人，U.S.Patent No.5556940 issued 17 September 1996)Ser Val Ser Glu Lle Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys HisLeu Asn Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys LeuGln Asp Val-NH2(系列ID号2)B上述分子B可能有一个自由羟基未端替代说明中的氨基未端。
发明内容
本发明的目的是生产新型PTH类似物，其具有较大的新陈代谢的稳定性，提高的骨骼恢复活性，提高的AC活性并且有很小的临床副作用。
根据本发明的一个方面，提供了新型的人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物，及其配药学上容许的盐，其具有氨基酸序列R-NH-Val-Ser-Glu-Lle-Gln-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-R14-R15-R16-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID号7)其中，R＝氢或任何直线型或支链型羟基，酰基或芳香基团，R1＝Ser，Ala或Aib，R8＝Met，Nle或一种自然发生的疏水性氨基酸，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys(碳环化合物)，R14＝His或一种水溶性的氨基酸，R15＝Leu或一种水溶性的氨基酸，R16＝Asn或一种水溶性的氨基酸，R17＝Ser，Glu，Asp，Lys，Orn，Cys，Hcys(碳环化合物)或一种水溶性的氨基酸，R18＝Met，Nle或一种自然发生的疏水性氨基酸，R22＝G1u，Lys，Orn，Cys，Asp或Hcys(碳环化合物)，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Cys，Asp或Hcys，R27＝Lys，Leu或一种自然发生的疏水性或极性氨基酸，X＝OR或NHR，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gin-Asp-Val-X，如果当Y＝X或Y＝Gln-X，一对或两对氨基酸R13，R17及R22，R26环化和当Y＝Gln-Asp-X或Y＝Gln-Asp-Val-X，两对氨基酸R13，R17和R22，R26环化时，所述氨基酸对的每个氨基酸都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥。
根据本发明的优选的方面，新型的hPTH类似物及其配药学上容许的盐具有氨基酸序列R-NH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gln-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID号8)其中，R＝氢或任何直线型或支链型羟基，酰基或芳香基团，R8＝Met或Nle，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Ala或Nle，Y＝X或Gln-X，X＝OR或NHR，当氨基酸对R22和R26发生环化后，所述氨基酸对的每个氨基酸都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥。
根据本发明的优选方面，新型的双环hPTH类似物及其配药学上容许的盐具有氨基酸序列RNH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gln-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-His-Leu-Asn-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID号9)其中，R＝氢或任何直线型或支链型羟基，酰基或芳香基团，R8＝Met或Nle，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R17＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Nle或一种自然发生的疏水性或极性氨基酸，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gln-Asp-Val-X，X＝OR或NHR，当两个氨基酸对R13、R17和R22、R26发生环化后，每个氨基酸残基R13和R17都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥。
盐的例子包括无机酸盐和如蚁酸，醋酸，酒石酸，柠檬酸的有机酸盐，无机酸盐碱基如钠和氨，和有机酸盐碱基如三乙胺、乙胺和甲胺。
根据本发明的另一特征，通过内酰胺的形成发生环化作用，包括所选氨基酸对如残余基22和26的侧链耦合。同时也可能发生其它类型的环化作用，如包含类似物Cys22-Cys26的Cys之间的二硫化物桥的形成。
许多氨基酸替代物也被发现是有效的。Lys27可以用Leu或各种别的自然发生的疏水性或极性残余基取代。另一种因素是残余基适合受体情况如何。Ala并不和Leu一样具有疏水性。Lys和Tyr总的认为是极化的，但是和受体有疏水性的相互影响。例如，Lys能够拆叠以使疏水性部分与疏水性残余基或部分残余基在PTH受体中相互作用，并且其侧链NH2官能团仍然暴露在溶剂当中。对于Lys而不是优选的Leu的可能替代物包括极性残余基如鸟氨酸和瓜氨酸，疏水性残余基如丙胺酸、已氨酸、异氨酸和酪氨酸或者任何直线型或侧链上有2-10个碳的支链α-氨基脂肪酸，和任何一个在脂肪链的末端具有极性或带电荷基团的类似物。极性或带电荷基团的例子包括氨基、羧基、乙酰胺基、胍基和酰脲基。虽然Len27好像是最好的替代物，但是许多其它Pos27的替代物也保留近乎全部活性，并且也有值得赞赏的特征，如提高的蛋白水解稳定性或水溶性。Lle、已氨酸、Met和鸟氨酸可能是最活跃的。
我们已经显示虽然任何至少包含PTH的N-端的28个残余基的类似物都有腺苷酸环化酶刺激活性(Neugebauer，W.，Barbier，J.R.，Sung，W.L.，Whitfield，J.F.，Willick，G.E.(1995)，“溶解结构和腺苷酸环化酶-C端刺激活性截短了人体甲状旁腺素类似物”，Biochemistry，348835-8842)，直线型自然序列中完全的合成代谢活性至少需要N-端的31个残余基(whitfield，J.F.，Morley，P.，Willick，G.E.，Ross，V.，Barbier，J.R.，Isaaces，R.J.，and Ohannessian，Barry L.，(1996)，“在切除卵巢的老鼠中，股小梁骨骼的生长刺激物依靠新型的甲状旁腺激素片断，hPTH(1-31)NH2(Ostabolin)”，Calcif.Tissue Int.5881-87)，并且，合成代谢的刺激物很可能带有hPTH(1-30)NH2，但是，仅仅比带有(1-31)类似物的剂量大一些(whitfield，J.F.，Morley，P.，Willick，G.E.，Maclean，S.，Ross，V.，Barbier，J.R.，and Isaacs，R.J.，(1999)，“在切除卵巢的老鼠中，股小梁骨骼的生长刺激物依靠人体甲状旁腺激素hPTH(1-30)NH2)”，Calc.Tiss.Int.，65143-147)，这样我们料想，较短的直线型类似物hPTH(1-28)和hPTH(1-29)也仅仅含有弱的合成代谢活性。HPTH(1-28)NH2的低活性将在以下例子中显示。
进一步，我们现在已经有证据包括在以下例子中带有Leu的替代物Lys-27和在残余基22和26之间的内酰胺的形成将腺苷酸环化酶激活活性引到与hPTH(1-34)相当的水平上，并且将合成代谢(骨骼生长刺激)活性引到与hPTH(1-34)相当的水平上。
NMR研究已经显示，即使一个由CD发现是典型的高度螺旋状的肽也具有许多非螺旋的结构。这样，一个受体结合肽激素的结构，如PTH，不能从它在溶解状态下的自由结构中可靠地推断。结合肽激素类似物已被用于限制对肽可用的构态的数目。hPTH序列的检查显示了在稳定或不稳定α-螺旋的残余基17-29上的3种可能的盐桥。这些是在Glu22和Lys26及Lys26和Asp30之间，他们都可能稳定α-螺旋，但在Lys27和Asp30之间，其不能稳定α-螺旋。在这些残余对之间的内酰胺的形成将在螺旋范围内限制hPTH的可能的结构。进一步，其中的两个可能稳定α-螺旋结构的内酰胺Glu22-Lys26和Lys26-Asp30位于α-螺旋的两性分子部分的极化面上。第三个内酰胺Lys27-Asp30可能至少部分破坏α-螺旋的稳定性并且包括一个残余基Lys27，该内酰胺位于由残余基21-31所束缚的两性分子螺旋的疏水面上。如果Lys或Orn取代位置25的Arg，Glu或Asp取代Gln29，在位置25和29之间内酰胺的环化也能够发生。
用Leu替代Lys27导致了在两性分子螺旋的疏水面上的更多疏水残余基。这就导致了在ROS细胞系中的腺苷酸环化酶激发活性的提高。通过那些现有技术，以上讨论的这些替代物很可能导致具有同样或提高的活性。
替代物和内酰胺结构的组合效果可能稳定了α-螺旋，而且提高了生物活性，并且使这个分子的区域不致于蛋白酶解降解。尽管一些肽酶能够使肽水解，但在C-端的氨基化合物的存在作为优选，其原因是可能进一步保护肽不致于超蛋白酶解(exoproteolytic)降解。(Leslie，F.M.andGoldstein，A.(1982)Neuropeptides 2，185-196)。
已经发现，能够有效地制造其它氨基酸替代物。特别地，根据日本专利公告61-24598，我们已经用自然发生的疏水残余基Nle取代了在位置8，18上的氧化敏感Met残余基。根据Nakagawa等人的美国专利5393869，其它的疏水残余基如Leu、Ile、Val、Phe和Trp也可能是有用的。
反转的内酰胺也有可能。例如，我们已经显示了一个22-26的转变如Lys22-Glu26转变的效力。所以类似的其它内酰胺之间的转换可能有效地取得，如13-17内酰胺的转换。
在Nakagawa等人的美国专利5393869和Fukuda等人的美国专利5434246中，报告一些替代hPTH类似物有显著的AC活性，并且已经提高了对蛋白水解侵蚀的稳定性。特别地
1.Ser-1代替Aib(α-氨基异丁酸)；2.Lys-27代替Gln(报告有2.5×AC活性)；3.据该报告，代替Lys的残余基14，15，16，17的全部或部分活性提高达8×(这个可能由于残余基在水中溶解度的增加。在Vivo中，这些对于胰岛素酶将更不稳定)。他们宣称，这四肽中(包括残余基14-17)至少有一个水溶性的氨基酸。可能性包括His-14或Lys-14；Leu-15，Lys-15或Arg-15；Asn-16，Orn-16，Hci-16，Asp-16，Arg-16，Lys-16，D-Dlys-16，Ser-16或Gly-16；和Ser-17，Lys-17，Asp-17，Arg-17或Glu-17。因为我们的内酰胺，特别是在位置27上带有Leu或者另一个疏水氨基酸，能够成为微溶的和难溶的，所以可以预料，在内酰胺中同样的替代物是有用的。
4.Arg25代替His使蛋白酶侵蚀最小化；现有技术中，虽然1-28hPTH环被优选，但从此处显示的数据来看，环1-29片断将也有可能是有效的。特别是，在文献中没有证明其它氨基酸的存在将影响激素的生物特性，也没有证实美国申请系列号08/904760中包括1-30到1-34的数据，该专利的公开在此处一并作为参考。
已经发现具有两个环的类似物在激活腺苷酸环化酶的细胞培养基中是十分活跃的。一种类似物包括的内酰胺环在残余基22和26之间而另一种类似物包括的内酰胺环在残余物13和17之间。一个例子是带有两个独立环Glu22-Lys26和Lys13-Glu17的hPTH分子和一个优选的Leu27替代物。这种类似物，即使在AC-刺激物中不是很活跃，但是在如口服时是优选的。
根据本发明的类似物可以由下述已知程序来制备，并且可以用于刺激骨骼生长，骨骼恢复，在许多情况下促进骨骼愈合，如治疗骨质疏松症和通常的骨折。
图1显示了自然hPTH的结构，残余基1-34.(序列号1)；图2显示了hPTH-NH2的结构，残余基1-31.(序列号2)；图3显示了〔Leu27〕cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-28)-NH2的结构(序列号3)；图4显示了〔Leu27〕cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-29)-NH2的结构(序列号4)；图5显示了〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)-hPTH-(1-31)-NH2的结构(序列号5)；图6显示了〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)-hPTH-(1-28)-NH2的结构(序列号6)；图7显示了按照小梁骨骼厚度表达的，根据本发明(1-28)环化类似物的合成代谢活性；图8显示了按照小梁骨骼厚度表达的，根据本发明双环化类似物的合成代谢活性。
具体实施例方式
激素类似物的制备由R.B.Merrifield开发的固相肽的合成技术(“固相肽合成”，Advances in Enzymology 32，221-296，1969)广泛而成功地用于多肽的合成如甲状旁腺激素，该技术在此处一并作为参考。其策略是基于附着固体支持物上肽的末端带有羧基的氨基酸。然后，以高产出率连续加入氨基酸。N端α-氨基可以通过将其移开而不从固体支撑物移开肽来得到保护。此处用到的化学药剂包括改进的Merrifield方法，称作Fmoc方法。Fmoc(fluorenylmethoxycarbonyl)基团能够在弱碱条件下去除，留下了碱基稳定侧链保护基团和未动过的支撑物连接。这种技术由E.Atherton和R.C.Sheppard描述，见“固相肽合成一个实用的方法”，IRL Press，N.Y.，在此处一并作为参考。
本发明的类似物可以由恒温哺乳动物在其需要时服用，特别是人通过注射、点滴、或者直肠用法，或者通过吸入或口服来服用。类似物传统上以注射剂量形式计算，按照容许的配药经验的规定以每单位剂量约1到300mg的量与传统的赋形剂(vechicle，excipent)、结合剂、保护剂、稳定剂、色素(color)、剂(agent)及其类似物复合。
对于注射用法，通过一个超精确的30个刻度的注射针头根据病情进行1到2ml无痛皮下注射1到2年，一天至多注射一次，注射的物质将在水状液的、等渗的、无菌的溶液或者悬浮液中(注意选择一种保护剂如酚类或者一种溶解剂如已二胺四乙基酸(EDTA))包含本发明的其中一种。在运用容许的赋形剂和溶剂中是水，弱酸水，林格液和等渗的氯化钠溶液。此外，传统上也用无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。人造单甘油脂，二甘油脂，脂肪酸(如油酸)可以用作可注入药物制备的不挥发油。
对于直肠用法，本发明的类似物以栓剂的形式来制备，其通过与一种适合的非刺激性赋形剂如可可油或聚乙二醇混合。
对于局部的使用，本发明的类似物可以以软膏、胶状物、液剂、悬浮剂或皮肤粘性膏药的形式来制备。
对于吸入用法，能够通过如公告号W094/07514的PCT专利(此处其公开文本一并作为参考)所述的方法来制备。
每日用量不超过每公斤体重0.05mg的量或者大约70公斤体重3.5mg的量，其用法依赖于特殊成分的活性、年龄、体重、性别及治疗对象的情况。
众所周知，和载体物质结合产生一种单一剂量的活跃成份的量，根据治疗者和特别的服用模式是不同的。实施例第一实施例[Leu27]cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-28)-NH2和[Leu27]cyclo(Glu22-Lys26)-hPTH-(1-29)-NH2的合成；这个肽通过如Barbier，J.R.，Neugebauer，W.，Morley，P.，Ross，V.，Soska，M.，Whitfield，J.F.和WilLLLick.G(1997)所述来合成，结合的人体甲状旁腺激素类似物的生物活性和二级结构是受体结合区域的环化内酰胺(J.Med chem.40，1373-1380)。将被环化的残余基Glu22和Lys-26分别被正交地保护作烯丙基酯和异构(alloc)派生物。环化作用在加入残余物17后发生。产品通过C18硅柱上的色谱仪(Vydac)所提纯的纯度大于97％，在0.1％三氟乙酸的水溶液中，乙酰乙酸的生理梯度以每分钟1％的速度洗脱。所监测的分子重量在下面表1中显示出。第二实施例〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2的合成；这种合成物是在和实施例1的类似物的类似方法中获得。Lys-13由异构(alloc)基团保护，Glu-17作为烯丙基酯被保护。在加入残余基17以后首次环化完成，并且残余基13和17之间的环化在全部合成完成之后进行，但是在支撑树脂的裂解和侧基团(非Lys-13和Glu-17)的破坏之前。监测的分子重量在下表1中示出。
表1
第三实施例腺苷酸环化酶激活活性24孔平板中ROS17/2细胞的4-5天培养基中腺苷酸环化酶活性可以从细胞ATP库中〔3H〕-cAMP的形成速率来估计，见Jouishomme，H.；Whitfied，J.F.；Gagon，L.；Maclean，S.；Isaacs，R.；Chakravarthy，B.；Durkin，J.；Neugebauer，W.；Willick，G.；Rixon，R.H.Further Definition ofthe Protein Kinase C Activation Domain of the Parathyroid Hormone.J.Bone Miner.Res.1994，9，943-949。该细胞ATP库在暴露到hPTH或其类似物之前标以〔3H〕-adenine。作为需要获得半最大活性(ED50％)的类似物的浓度，腺苷酸环化酶活性在下表2中示出。
表2
第四实施例在切除卵巢老鼠模型中用于治疗骨质疏松的〔Leu27〕c(Glu22-Lys26)hPTH(1-28)NH2的合成代谢活性一般，假切除卵巢的和切除卵巢的Sprague-Dawley老鼠(3个月大，性成熟)从Charles River Breeding Laboratories(St.Constant，QC，Canada)购买。它们自由分组，每7-8个分成一组。(注射赋形剂注射的、假切除卵巢的、以每100g体重5纳摩尔hPTH-(1-28)NH2注射切除卵巢的、以每100g体重25纳摩尔hPTH-(1-28)NH2，注射切除卵巢的、以每100g体重5纳摩尔〔Leu27〕cyclo(Glu22-Lys26)hPTH-(1-28)NH2注射切除卵巢的)。动物用Purina鼠食(1.0％钙，0.6％磷)喂养。这个实施例使用了一种预防的治疗方案，其中溶解在酸性盐赋形剂(0.15摩尔氯化钠水溶液含有0.001的盐酸)的肽的皮下注射是在一个重要的小梁损失已经开始之前在切除卵巢之后的第二个星期末启动，然后连续6个星期，每星期6天，每天1次(即，在切除卵巢之后的第8个星期末)。在实验的结尾，股骨和L5椎骨从安乐死动物中除去并清洁。将椎骨和股骨的末端部分减去它们的骺，放入10％的醋酸缓冲的福尔马林溶液1个星期，然后在5％的三氯乙酸的溶液中搅拌脱盐9-12天，然后脱水、清洁并包入石蜡中。8-μm厚的脱水、清洁并包裹石蜡的L5椎骨的系列横截面和10-μm厚的包裹石蜡的末端股骨部分的系列纵截面用一个Leica RM-2035切片机切割，并且在55℃下Sanderson’s快速染色剂进行2分钟的染色(Surgipath Medical Industries Inc.，Winnipeg，MB，Canada)。
对于在椎骨和末端股骨中刺激小梁生长的hPTH片断的功能通过测量小梁的厚度可以估计(面积μm2/约80次测量的每根骨头周长μm)。小梁面积和周长用一个来自Imaging research Inc.(St.Catherine’s，ON，Canada)的M4摄像系统来测量。用于判断的软件是Imaging Research’smorphometry Version 3.01.7。所有的组织形态度量测量都是由同一“盲”观测者观测末端股骨和L5椎骨来取得。
股骨的数据表达为方法±SEMs，统计比较通过变量的单向分析方法(ANOVA)来取得。Scheffe的实验用作多次比较并且重要的是P＜0.05。
图7显示了假切除卵巢的，切除卵巢的和用5纳摩尔/每100克体重的直线型hPTH(1-28)NH2(直线型(1-28))或者〔Leu27〕c(Glu22-Lys26)hPTH(1-28)NH2(环型(1-28))处理过的切除卵巢的小梁厚度。运用直线型分子的骨骼恢复比用环化的类似物需要25纳摩尔/100g体重(数据未示出)的更大的剂量。第五实施例在切除卵巢(OVX)的老鼠的末端股骨刺激小梁生长的〔Glu17，Leu27〕cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2的功能。
被切除卵巢或者假切除卵巢的老鼠在切除卵巢后(OVX)第9个星期末和第15个星期末之间每天进行赋形剂的皮下注射。注射量是5纳摩尔/100g体重。切除卵巢的老鼠每天收受赋形剂(OVX)，5纳摩尔(直线型)hPTH(1-31)NH2，5纳摩尔(环型)(Leu27)cyclo(Glu22-Glu26)hPTH(1-28)NH2，5纳摩尔(双环型)(Glu17，Leu27)cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2的皮下注射。股骨被脱盐并用Sanderson的快速骨骼染色剂染色。如图8所示，在提高所剩小梁的厚度方面双环类似物(Glu17，Leu27)cyclo(Lys13-Glu17，Glu22-Lys26)hPTH(1-31)NH2比其对应单环类似物(Leu27)cyclo(Glu22-Glu26)hPTH(1-28)NH2要好。并且两者都要比直线型分子hPTH(1-31)NH2要好。这种提高与其亲缘AC-刺激活性并不相关，但是很可能缘于对蛋白水解侵蚀的高度稳定性和注射一侧转移的高度性能。
双环hPTH(1-28)NH2，hPTH(1-29)NH2和hPTH(1-30)NH2与线型和单环形式相比也可能有改进的生物活性。
参考文献下面公开的参考文献在此参照结合。(1)Caulfield，M.P.；McKee，R.L.；Goldman，M.E.；Duong，L.T.；Fisher，J.E.；Gay，C.T.；DeHaven，P.A.；Levy，J.J.；Roubini，E.；Nutt，R.F.；Chorev，M.；Rosenblatt，M.The Bovine Renal Parathyroid Hormone(PTH)ReceptorHas Equal Affinity for 2 Different Amino Acid Sequences-The ReceptorBinding Domains of PTH and PTH-Related Protein Are Located Within the14-34 Region.Endocrinology 1990，127，83-87.(2)Neugebauer，W.；Barbier，J.-R.；Sung，W.L.；Whitfield，J.F.；Willick，G.E.Solution Structure and Adenylyl Cyclase Stimulating Activities of C-TermigalTruncated Human Parathyroid Hormone Analogues Biochemistry 1995，34，8835-8842.(3)Gardella，T.J.；Wilson，A.K.；Keutmann，H.T.；Oberstein，R.；Potts，J.T.；Kronenberg，H.M.，and Nussbaum，S.R.Analysis of ParathyroldHormone′s Principal Receptor-Binding Region by Site-Directed Mutagenesisand Analog Design.Endocrinology 1993，132，2024-2030.
序列表<110>琼-勒内·巴比尔保罗·莫利詹姆斯·惠特菲尔德戈登·威利科<120>用于治疗骨质疏松的甲状旁腺激素类似物。<130>10688-1B<140><141><150>08/904,760<151>1997-08-01<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>34<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val His20 25 30Asn Phe<210>2<211>31<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>这个序列具有一个氨基团C-端(NH2)。<400>2Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn15 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Lys Leu Gln Asp Val20 25 30<210>3<211>28<212>PRT<213>Homo sapins<220><223>环Glu22-Lys26，和该序列具有一个氨基团C-端(NH2)。<400>3Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu20 25<210>4<211>29<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>环Glu22-Lys26，和这个序列具有一个氨基团C-端(NH2)。<400>4Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln20 25<210>5<211>31<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>环Gys13-Glu17，环Glu22-Lys26，和这个序列具有一个氨基团C-端(NH2)。<400>5Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Glu Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu Gln Asp Val20 25 30<210>6<211>28<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>环Lys13-Glu17，环Glu22-Lys26，和这个序列具有一个氨基团C-端(NH2)。<400>6Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Met His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Glu Met Glu Arg Val Glu Trp Leu Arg Lys Leu Leu20 25<210>7<211>31<212>PRT<213>Homo sapiens<220><222>(1)<223>Ser，Ala or Aib<220><222>(8)<223>Met，Nle或一个自然发生的疏水氨基酸<220><222>(13)<223>Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys<220><222>(14)<223>His或一个水溶氨基酸<220><222>(15)<223>Leu或一个水溶氨基酸<220><222>(16)<223>Asn或一个水溶氨基酸<220><222>(17)<223>Ser，Glu，Asp，Lys，Orn，Cys，Hcys或一个水溶氨基酸<220><222>(18)<223>Met，Nle或一个自然发生的疏水氨基酸<220><222>(22)<223>Glu，Lys，Orn，Cys，Asp or Hcys<220><222>(25)<223>Arg or His<220><222>(26)<223>Lys，Orn，Glu，Cys，Asp or Hcys<220><222>(27)<223>Lys，Leu，或一个自然发生氨基酸<220><223>这个多肽也可以包含一个其中C-端带有Gln或Gln-Asp的序列，并且这个序列也可以具有一个C-端NHR(R＝氢或任何直线型或支链烷基、酰基或芳烃基团)<400>7Xaa Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Xaa Xaa Xaa Xaa1 5 10 15Xaa Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val20 25 30<210>8<211>29<212>PRT<213>Homo sapiens<220><222>(8)<223>Met or Nle<220><222>(18)<223>Met or Nle<220><222>(22)<223>Glu，Asp，Lys，Orn，Cys or Hcys<220><222>(25)<223>Arg or His<220><222>(26)<223>Glu，Asp，Lys，Orn，Cys or Hcys<220><222>(27)<223>Lys，Leu，Ala，or Nle<220><223>这个多肽也可以包括一个其中C-端带有Leu的序列，并且这个序列也可以具有一个C-端NHR(R＝氢或任何直线型或支链烷基、酰基或芳烃基团)<400>8Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Lys His Leu Asn1 5 10 15Ser Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln20 25<210>9<211>31<212>PRT<213>Homo sapiens<220><222>(8)<223>Met or Nle<220><222>(13)<223>Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys<220><222>(17)<223>Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys<220><222>(18)<223>Met or Nle<220><222>(22)<223>Glu，Asp，Lys，Orn，Cys or Hcys<220><222>(25)<223>Arg or His<220><222>(26)<223>Lys，Orn，Glu，Asp，Cys or Hcys<220><222>(27)<223>Lys，Leu，Nle或一个自然发生的疏水的或极化的氨基酸<220><223>这个多肽也可以包括一个其中C-端带有Gln或Gln-Asp的序列，并且这个序列也可以具有一个C-端NHR(R＝氢或任何直线型或支链烷基、酰基或芳烃基团)<400>9Ser Val Ser Glu Ile Gln Leu Xaa His Asn Leu Gly Xaa His Leu Asn1 5 10 15Xaa Xaa Glu Arg Val Xaa Trp Leu Xaa Xaa Xaa Leu Gln Asp Val20 25 306/权利要求
1.人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物或其配药学上容许的盐，其具有氨基酸序列R-NH-R1-Val-Ser-Glu-Lle-Gin-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-R14-R15-R16-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu---Y(系列ID号7)其中，R＝氢或任何直线型或支链型羟基，酰基或芳香基团，R1＝Ser，Ala或Alb，R8＝Met，Nle或一种自然发生的疏水性氨基酸，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R14＝His或一种水溶性的氨基酸，R15＝Leu或一种水溶性的氨基酸，R16＝Asn或一种水溶性的氨基酸，R17＝Ser，Glu，Asp，Lys，Orn，Cys，Hcys或一种水溶性的氨基酸，R18＝Met，Nle或一种自然发生的疏水性氨基酸，R22＝Glu，Lys，Om，Cys，Asp或Hcys(碳环化合物)，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Cys，Asp或Hcys，R27＝Lys，Leu或一种自然发生的疏水性或极性氨基酸，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gln-Asp-Val-X，X＝OR或NHR，如果当Y＝X或Y＝Gln-X，一对或两对氨基酸R13，R17及R22，R26环化和当Y＝Gln-Asp-X或Y＝Gln-Asp-Val-X，两对氨基酸R13，R17及R22，R26环化时，所述氨基酸对的每个氨基酸都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥。
2.根据权利要求1的类似物，其中环化作用是内酰胺型的。
3.根据权利要求2的类似物，其包括一个R22-R26内酰胺。
4.根据权利要求3的类似物，其包括一个Glu22-Lys26内酰胺。
5.根据权利要求1的类似物，其中R是H，X是NH2。
6.根据权利要求5的类似物，其中R27是Lys或Leu。
7.人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物或其配药学上容许的盐，其具有氨基酸序列R-NH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gin-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu-Y(系列ID号8)其中，R＝氢或任何直线型或支链型羟基，酰基或芳香基团，R8＝Met或Nle，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Ala或Nle，Y＝X或Gln-X，和X＝OR或NHR，当氨基酸对R22和R26发生环化后，所述氨基酸对的每个氨基酸都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥。
8.根据权利要求7的类似物，其中R27是Lys或Leu。
9.根据权利要求8的类似物，其包括一个R22-R26内酰胺。
10.根据权利要求9的类似物，其具有系列ID号3。
11.根据权利要求9的类似物，其具有系列ID号4。
12.人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物，或其提供的配药学上容许的盐，其具有氨基酸序列RNH-Ser-Val-Ser-Glu-Lle-Gin-Leu-R8-His-Asn-Leu-Gly-R13-His-Leu-Asn-R17-R18-Glu-Arg-Val-R22-Trp-Leu-R25-R26-R27-Leu---Y(系列ID号9)其中，R＝氢或任何直线型或支链型羟基，酰基或芳香基团，R8＝Met或Nle，R13＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R17＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R18＝Met或Nle，R22＝Glu，Asp，Lys，Orn，Cys或Hcys，R25＝Arg或His，R26＝Lys，Orn，Glu，Asp，Cys或Hcys，R27＝Lys，Leu，Nle或一种自然发生的疏水性或极性氨基酸，Y＝X，Gln-X，Gln-Asp-X或Gln-Asp-Val-X，X＝OR或NHR，当两个氨基酸对R13和R17及R22和R26发生环化后，每个氨基酸残基R13和R17都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥，并且每个氨基酸残基R22和R26都有一条侧链能够形成一个内酰胺或者一个侧链之间的二硫化物链桥。
13.据权利要求12的类似物，其中R27是Lys或Leu。
14.根据权利要求13的类似物，其包括一个Glu22-Lys26内酰胺。
15.根据权利要求12的类似物，其具有系列ID号5。
16.根据权利要求12的类似物，其具有系列ID号6。
17.恒温动物需要时服用的复合物，包括根据权利要求1的人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物结合配药学上容许的载体或赋形剂。
18.对于需要治疗的恒温动物的治疗方法，包括对于恒温动物的服用方法和根据权利要求1的人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物的治疗有效量。
19.根据权利要求18的方法，其中类似物具有系列ID号3。
20.根据权利要求18的方法，其中类似物具有系列ID号4。
21.根据权利要求18的方法，其中类似物具有系列ID号5。
22.根据权利要求18的方法，其中类似物具有系列ID号6。
全文摘要
本发明涉及能够提高骨质恢复、生物活性的人体甲状旁腺激素(hPTH)类似物。所述类似物有在氨基酸对13,17和22和26之间环化的单环(1－28)或(1－29)类似物,或者双环(1－28)或(1－31)类似物。单环类似物在氨基酸对R22和R26环化。双环类似物在氨基酸对R13、R17和R22、R26之间环化。同时描述了用于替代其它氨基酸的天然残余基的多种替代物。例如自然Lys
文档编号C07K14/635GK1377371SQ00813217
公开日2002年10月30日 申请日期2000年9月21日 优先权日1999年9月22日
发明者琼－勒内·巴比尔, 保罗·莫利, 詹姆斯·惠特菲尔德, 戈登·E·威利科 申请人:加拿大国家研究院