用于pth的纯化方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明提供了用于纯化重组甲状旁腺激素(recombinant parathyroid hormone)(rhPTH1—34或特立帕肽)的改善方法。根据本发明的纯化PTH的方法包括在使用任何阳离子交换色谱(阳离子交换层析，cat1n exchange chromatography)之前在第一步骤中使用阴离子交换色谱(阴离子交换层析)。这样的纯化方法产生具有大于99%纯度的高度纯化的rhPTH1—34，而没有在纯化方法中采用任何HPLC柱步骤。
【背景技术】
[0002]重组人类甲状旁腺激素(rhPTH1—34)或特立帕肽(teriparatide)是内源人甲状旁腺激素(PTH)的生物活性的N-端片段(N-terminal fragment)。在治疗上，特立帕肽用于治疗具有骨质疏松症的处于高骨折风险的男人和绝经后的女人。其增加了骨无机盐密度并且降低了脊椎骨折和非脊椎骨折的风险。
[0003]本发明的发明人通过使用基因工程大肠杆菌(E.coli)细胞作为宿主系统的重组DNA技术已经固有地开发了特立帕肽。包含34天然氨基酸的特立帕肽具有4117.8Da的理论分子量。特立帕肽是不含半胱氨酸的多肽链。
[0004]在人体中，PTH主要通过甲状旁腺的主细胞作为包含单个多肽链的84个氨基酸(9.5kDa)来合成和分泌。在释放到血流中之后，PTH与主要存在于骨质和肾脏中的特定膜受体结合以维持血清Ca2+水平。激素-受体相互作用导致具有典型的级联系统的cAMP依赖性蛋白激酶A以及钙依赖性蛋白激酶C信号通路两者的激活。
[0005]在循环中，内源的天然PTH具有2至5分钟的半衰期并且其大于90%的清除由肝脏和肾脏介导。
[0006]已经通过几种生化和结构的研究观察到，重组地或合成地生产的PTH的N-端的1-34个氨基酸片段在结合受体中完全保持了活性以及它的活化作用。对于最佳的受体结合活性，发现PTH1—34多肽链的N-端部、1-27个氨基酸对于生物活性是必要的。PTH1—34的N-端部在结合于它的受体之后引起cAMP的刺激作用，然而PTH1—34的C-端部帮助提供大部分的结合能量而不导致cAMP的活化。
[0007]PTH在Ca2+内稳态中发挥重要的作用。当在血液循环中Ca2+浓度较低(低血钙)时，经由质膜结合钙传感器由甲状旁腺细胞触发PTH的释放。如果持续低血钙，那么出现甲状旁腺的过度生长和增生。在另一方面，通过负反馈机制在血浆中Ca2+浓度的升高抑制PTH的释放。
[0008]本发明涉及重组PTH的纯化。在现有技术中存在一些已知的纯化方法。这样的纯化方法包括使用昂贵的并且在操作期间需要大量有机溶剂的高效液相色谱(HPLC)。高的仪器成本、要求耐火的生产装置以及要求大量昂贵的优质有机溶剂用作流动相是在由HPLC在工业规模上纯化PTH情况中的主要局限性。
[0009]W02009019715公开了用于rhPTH(l-34)的两步正交纯化法，包括阳离子交换色谱可选地接着是选自HIC或RP-HPLC的制备色谱以产生>98%纯度的靶蛋白。
[0010]W02003102132涉及用于蛋白纯化的方法，包括将非亲和色谱与HPTFF组合。
[0011]印度申请2991/MUM/2010公开了包括阳离子交换色谱和凝胶过滤色谱的PTH纯化方法。
[0012]本发明中所描述的用于纯化PTH的方法在所述多肽分子的纯化方法期间不包括其中将有机溶剂用作流动相的任何柱色谱或任何HPLC柱色谱。因此，本发明公开了简单的、成本有效的、高度可规模化的(highly scalable)、工业可行的和环境有利的纯化方法以获得高度纯化的rhPTH1—34。在本发明中公开的纯化方法可以用于从通过任何方法产生的包含rhPTH1—34的粗混合物(crude mi xture)中纯化PTH。
【发明内容】
[0013]本发明提供了用于纯化甲状旁腺激素(甲状旁腺素)(PTH)、优选重组PTH的方法。
[0014]在一个方面，本发明提供了用于纯化PTH、优选重组PTH的非HPLC的方法，包括在含水相中使用多重色谱步骤(multiple chromatography step)。
[0015]在另一方面，本发明提供了用于纯化PTH的非HPLC方法，包括作为第一柱用于去除杂质的阴离子交换色谱，接着是用于进一步纯化的阳离子交换色谱以获得以高度纯化形式的所期望的多肽分子。
[0016]在一个优选的方面，本发明提供了在进行位点特异性切割(site-specific(:16&￥&86)之后从融合-伴侣-蛋白复合体(;1^118；[011-口&1'1:1161—口1'0七6；[11 complex)中的 PTH 纯化方法以从复合体中分离期望的PTH多肽链。
[0017]在另一个优选的实施方式中，本发明公开了融合伴侣蛋白复合体的应用，其中融合伴侣通过特异性用于酶促切割(enzymatic c 1 eavage )的特征序列(signaturesequence)与PTH分子连接，使得在切割之后PTH分子从它的N-端位置获得分离。该融合伴侣蛋白可以选自以下蛋白分子的组，该蛋白分子已知具有7.2或小于其的pi值(理论)并且在类似于特异性切割反应需要的序列的多肽链中看来不包含任何特征序列。
[0018]在优选的实施方式中，本发明提供了用于纯化PTH、优选重组PTH的方法，包括以下步骤:
[0019]1.位点特异性切割(site-specific cleavage)
[0020]2.弱阴离子交换色谱
[0021]3.弱阳离子交换色谱
[0022]4.强阳离子交换色谱
[0023]5.超滤并且渗滤((1丨3；1^11:瓜1:;[011)
[0024]6.弱阴离子交换色谱。
[0025]在进一步的实施方式中，可以以任何顺序进行从步骤三至六的任何柱步骤。
[0026]在另一个实施方式中，可以在第一阴离子交换色谱步骤之后进行酶促切割反应。
[0027]在本说明书中使用的缩写定义如下:
[0028]DEAE琼脂糖:二乙氨乙基琼脂糖(Diethylaminoethyl sepharose)
[0029]CM琼脂糖:竣甲基琼脂糖(Carboxymethyl sepharose)
[0030]HPLC:高效液相色谱(高效液相色谱法)
[0031]RP-HPLC:反相-高效液相色谱
[0032]HI C:疏水作用色谱(疏水作用色谱法)
[0033]HPTFF:高效切向流过滤(High performance tangential flow filtrat1n)
[0034]r-Enk:重组肠激酶
[0035]MWCO:截留分子量(molecular weight cut-off)
[0036]WF1:注射用水
【附图说明】
[0037]图1示出了在rhPTH1—34的纯化方法中使用的第一弱阴离子交换柱步骤的色谱曲线。rhPTH1—34产物没有结合于阴离子交换基质并且在柱流过-和-洗涤部分(柱流过-和-洗涤饱分，column f low-through-and-wash fract1n)中出现。用更高的盐浓度(500mMNaCl)将紧密结合的污染蛋白从柱中剥离。
[0038]图2示出了在rhPTH1—34的纯化方法中使用的弱阳离子交换柱的色谱曲线。在结合于基质之后，用200mM NaCl梯度在期望的部分(馏分)(如指出的)差异地将rhPTH1—34从柱中洗脱出来。在洗脱之前，用150mM NaCl缓冲剂洗涤柱。
[0039]图3示出了在rhPTH1—34的纯化方法中使用的强阳离子交换柱的色谱曲线。在加载蛋白溶液之后，首先用平衡缓冲剂洗涤柱基质，并且在比平衡缓冲剂更高的导电性的情况下实施第二次洗涤。使用具有比第二洗涤缓冲剂更高的pH和导电性的缓冲剂进行洗脱。在洗脱期间，收集期望部分的rhPTH1—34，如在图中所指出的，用于进一步处理。
[0040]图4示出了在rhPTH1—34的纯化方法中使用的第二弱阴离子交换柱步骤的色谱曲线。rhPTH1—34产物没有结合于阴离子交换基质并且在柱流过-和-洗涤部分中出现。如指出的，在更高的盐浓度(500mM NaCl)下将紧密结合的残余的污染蛋白从柱中剥离。
[0041]图5示出了通过非还原的SDS-PAGE从第二弱阴离子交换柱恢复的rhPTH1—34的多肽分布。在溶解在凝胶上之后，通过Ag着色将蛋白带显影。根据SDS-PAGE分析，rhPTH1—34的单一带纯度是明显的。去除污染蛋白的残余量已经在泳道(lane)3中示出。
[0042]图6示出了通过RP-HPLC纯化的rhPTH1—34药