一种纯化治疗性蛋白质的方法

一种纯化治疗性蛋白质的方法
【技术领域】 本发明通常涉及一种在包含至少一种治疗性蛋白质的溶液中减少杂质水平的方法并 涉及所得的包含治疗性蛋白质的溶液。更具体地，涉及一种在包含纤维蛋白原和/或因子 VIII和/或血管性血友病因子（VWF)的原料中减少纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶 酶原激活物和/或其它蛋白酶水平的方法。本发明还通常涉及通过这些方法回收的包含纤 维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液和药物制剂，以及它们的应用。
【背景技术】 当前从包含天然存在的或重组的治疗性蛋白质的溶液中纯化所述蛋白质的方法，通常 携带至少某些杂质进入到最终的制剂中。在一些情况下，杂质的存在，如蛋白酶，将使溶液 中治疗性蛋白质不稳定，尤其是在存储期间。基于这个原因，许多治疗性蛋白质被存储为冻 干的或冷冻的制剂。 虽然杂质的不稳定性水平可能会影响许多不同类型的治疗性蛋白，它们特别与那些用 于保持止血的治疗性蛋白质相关。止血是一个重要的生理过程，其防止损害（如破裂）血 管后的出血。促进止血有三个基本的机制：（i)血管收缩，（ii)血小板在破裂部位聚集；和 (iii)凝血。在凝血期间，受损的内皮细胞释放组织因子（因子III)，其在Ca2+的帮助下依 次激活因子VII。通过活化的血小板释放的因子XII激活因子XI。活化的因子VII和因子 XI促进级联的酶促反应，导致因子X的活化。活化的因子X(因子Xa)以及因子III，因子 V，Ca2+，和血小板凝血因子（PF3)级联，激活凝血酶原激活物。凝血酶原激活物转化凝血酶 原为凝血酶，其转化纤维蛋白原（因子I)为纤维蛋白，在损伤部位形成初始网格。该初始 网格随后经由因子XIII而被转变为致密的纤维蛋白凝块，密封破裂直到该位置被修复。在 凝血级联过程中，凝血酶也将激活因子VIII，激活因子VIII是在循环过程中主要络合到血 管性血友病因子（VWF)的一种糖蛋白亲辅因子。因子VIII与因子IXa相互作用以在Ca+2和磷脂存在的情况下激活因子X。 任意一个或多个参与凝血的蛋白的水平缺乏，包含纤维蛋白原，因子VIII，和/或先天 性或后天性的血管性血友病因子（VWF)，可以导致血液凝固的不足和出血的风险。目前的治 疗选择局限于给予一种或多种治疗性蛋白的药物制剂，以恢复所述蛋白质的内源性水平和 保持止血。但是，现有的药物制剂，其通常来自于捐献的血液血浆或重组来源，包含酶原和 蛋白酶（如凝血酶原，纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物（tPA)和/或其它蛋白 酶），其可以在储存过程中使该治疗性蛋白质不稳定，如纤维蛋白原，因子VIII，或VWF。因 此，这样的制剂在水溶液中是相对不稳定的，长期储存限于冻干的或冷冻的制剂。 为了临床应用，纤维蛋白原是通常从人血浆中纯化的，在血浆中它仅占总血浆蛋白的 约2-5% (1.5-4. Og/L)。传统上，纤维蛋白原从血浆的纯化是通过经典的血浆分级实施的， 其中纤维蛋白原是随后用任一种的乙醇，硫酸铵，β丙氨酸/甘氨酸，聚合物（例如，聚乙二 醇）或低离子强度溶液沉淀而从血浆中冷沉淀。这些方法可以达到较高的产量和均匀性。 在需要更高水平的纯度的情况下，经常使用色谱技术。但是，现有的适合于商业规模制造工 艺的沉淀和色谱技术通常生产出包含污染性蛋白质，如酶原或蛋白酶（例如，凝血酶原，组 织纤维蛋白溶酶原激活物（tPA)和纤维蛋白溶酶原）的纤维蛋白原制剂，污染性蛋白质可 以使溶液中纤维蛋白原不稳定。例如，当凝血酶原存在时，它可以被激活成为丝氨酸蛋白 酶凝血酶，这将反转转变纤维蛋白原成纤维蛋白。同样地，当tPA和纤维蛋白溶酶原都存在 时，tPA可以激活纤维蛋白溶酶原成为其活性形式纤溶酶，这反过来将水解纤维蛋白原为纤 维蛋白。其结果是，纤维蛋白原制剂在水溶液中是相对不稳定的，长期储存限于冻干的或冷 冻的制剂。 特定的污染物可以被吸附出来；例如，在固定化明胶上的纤连蛋白和在固定化赖氨酸 上的纤维蛋白溶酶原（Vuento et al. 1979, Biochem. J·，183 (2) :331-337)。然而，具体的 亲和树脂的应用是不适于大规模工业方法的。其原因包含亲和树脂本身不具有足够的强度 以便于被反复使用，并且通常显著增加工艺时间和成本。 EP 1240200 (US6960463)涉及使用离子交换（IEX)色谱法从包含纤维蛋白原的溶液中 纯化纤维蛋白原的方法。具体的方法涉及在下列条件下应用包含纤维蛋白原的溶液至离子 交换基质，使纤维蛋白原结合到基质上，然后用包含至少一种ω氨基酸的溶液冲洗离子交 换基质。这样做是为了促进纤维蛋白溶酶原在树脂上差异化移动。结合在所述基质的纤维 蛋白原随后从基质中洗脱。 W02012038410提供了一种使用阴离子交换树脂纯化纤维蛋白原的方法，该阴离子交换 树脂包含接枝有结合纤维蛋白原的叔胺或季胺的羟基化的聚合物支持物。 ΕΡ1519944教导了在下列条件下使用固定化金属离子亲和色谱基质，纤维蛋白原和纤 维蛋白溶酶原结合到基质中，并且分别选择性地洗脱所述纤维蛋白原和纤维蛋白溶酶原， 使得主要的纤维蛋白原级分包含大约每毫克蛋白质的600ng蛋白溶酶原。 本发明提供了在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或血管性血友病因子（VWF)的 溶液中减少纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶水平的方 法。纯化的蛋白质作为液体制剂在存储过程中是稳定的，并且可用于临床或兽医应用，包含 治疗或预防与所述蛋白质水平缺乏相关的病症。 发明简介 在本发明的一个方面，提供了一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和 血管性血友病因子（VWF)组成的组蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织 纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含： (i) 在选择的条件下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的 组的蛋白质的原料通过疏水性电荷诱导的色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料 (feedstock)中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白 酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和 (ii) 回收通过树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组 的蛋白质的溶液，其中该溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶 原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50%。 在本发明的另一个方面，提供了一种减少包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII 和血管性血友病因子（VWF)组成的组的蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋白溶酶原， 组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质水平的方法，该方法包含： (i) 使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的原料通 过第一疏水电荷诱导色谱树脂； (ii) 回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因 子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液； (iii) 使所述在步骤（ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和 (iv) 回收通过第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因 子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液； 其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维 蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂上，和其中 在步骤（iv)回收的溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激 活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于所述原料减少了至少50%。 在另一个方面，提供了一种经由如本文所述的本发明的方法所回收的包含至少一种选 自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液。 在另一个方面，提供了一种包含至少5mL稳定的药学上可接受的纤维蛋白原溶液的容 器，其中纤维蛋白原的浓度为至少20mg/mL。 在另一个方面，提供了一种药物制剂，包含包括经由如本文所述的本发明的方法所回 收的至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的蛋白质的溶液，和药学上可 接受的载体。 在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含： (a) 至少75%总蛋白质的纤维蛋白原； (b) 少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或 (c) 少于1 μ g/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。 在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含： (a) 至少90%总蛋白质的纤维蛋白原； (b) 少于50pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或 (c) 少于150ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。 在本发明的另一个方面，提供了一种溶液，其包含： (a) 至少90%总蛋白质的纤维蛋白原； (b) 少于20pg/mg总蛋白质的组织纤维蛋白溶酶原激活物；和/或 (c) 少于10ng/mg总蛋白质的纤维蛋白溶酶原。 在另一个方面，提供了一种治疗或预防与纤维蛋白原缺乏相关的病症的方法，该方法 包含给予有此需求的患者如本文所述的本发明的溶液或药物制剂。 在另一个方面，提供了一种如本文所述的本发明的溶液在制备用于治疗或预防与纤维 蛋白原缺乏相关的病症的药物中的应用。 在另一个方面，提供了一种包含如本文所述的本发明溶液的纤维蛋白胶。 在另一个方面，提供了一种生产稳定的液体纤维蛋白原溶液的方法，该方法包含： (i)在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选 择的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织型纤维蛋白溶酶原激 活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结合至树脂上；和 (ii)回收通过树脂的包含纤维蛋白原的溶液，其中溶液中的所述至少一种选自由纤维 蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原 料减少了至少50%。 在另一个方面，提供了一种生产稳定的液体纤维蛋白原溶液的方法，该方法包含： (i) 使包含纤维蛋白原的原料通过第一疏水电荷诱导色谱树脂； (ii) 回收通过第一疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液； (iii) 使所述在步骤（ii)中回收的溶液通过第二疏水电荷诱导色谱树脂；和 (iv) 回收通过所述第二疏水电荷诱导色谱树脂的包含纤维蛋白原的溶液； 其中色谱步骤的条件使得存在于原料中的至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维 蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质结合到第一和/或第二树脂上，和其中 在步骤（iv)回收的溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激 活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50%。 在本发明的另一个方面，提供了一种用于纯化纤维蛋白原的方法，该方法包含以下步 骤： (i) 在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的溶液通过离子交换色谱树脂，使得纤维蛋白 原单体（fibrinogen monomer)结合到树脂上；所述选择的条件使得纤维蛋白原单体结合 到树脂上； (ii) 用洗脱缓冲液从树脂上洗脱纤维蛋白原单体；和 (iii) 经由具有从约15nm至约35nm范围孔径的过滤器，过滤来自步骤（ii)的所述的 洗脱的纤维蛋白原单体。 附图的简要说明 图1显示出当溶液通过HEA Hypercel?时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH 水平范围，从纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原和t-PA的百分比。每个组 内的条代表（从左到右）：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收和t-PA回收。 图2显示出当溶液通过PPa Hypercel?时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH 水平范围，从纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的百分比。 每个组内的条代表（从左到右）：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收，t-PA回收和因子 IIo 图3显示出当溶液通过MEP Hypercel?时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的pH 水平范围，从纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的回收百 分比。每个组内的条代表（从左到右）：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收，t-PA回收 和因子II。 图4a显示出当溶液通过HEA Hypercel?时，相对于纤维蛋白原在负模式下，在不同的 pH水平范围，从包含纤维蛋白原溶液回收纤维蛋白原，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II的 百分比。每个组内的条代表（从左到右）：纤维蛋白原回收，纤维蛋白溶酶原回收，t-PA回 收和因子II回收。 图4b显示出在室温（约20°C )下，经由6天，从通过HEA Hypercel?柱的直通级分 (图4a)中回收的含纤维蛋白原溶液的稳定性，通过初始可凝固蛋白质％而测量。每个组内 的条代表（从左至右）：T = 1天，T = 3天，T = 6天。 图4c显示出在室温（约20°C )下，经由6天，从通过HEA Hypercel?柱的直通级分 (图4a)中回收的含纤维蛋白原溶液的稳定性，通过可凝固蛋白质％而测量。每个组内的条 代表（从左至右）：T = 1天，T = 3天，T = 6天。 图5显示出得自根据本发明的实施方案的方法，从血浆冷沉淀通过MaCr〇Prep?-HQ洗 脱的级分中纤维蛋白原，t-PA，纤维蛋白溶酶原和因子II的过程回收百分比。每个组内的 条代表（从左至右）：纤维蛋白原，纤连蛋白，纤维蛋白溶酶原，t-PA和因子II。 图6显示出从MaCr〇Prep?-HQ色谱树脂回收的单体纤维蛋白原的纯度，通过分析型尺 寸排阻HPLC色谱法而测量。 图7显示出从MacroPr印?-HQ色谱树脂回收的纤维蛋白原的过滤性，使用具有不同电 导率的洗脱缓冲液（190mM NaCl，21.5mS/cm(菱形）；200mM NaCl，22.5mS/cm(正方形）； 210mM NaCl，23.5mS/cm(三角形）；1% (w/w)精氨酸/200mM NaCl，25mS/cm(交叉））。 图8显示出从MacroPr印?-HQ色谱树脂回收的液体纤维蛋白原存储在2-8°C (菱形） 下9周期限或在30°C (正方形）下7周期限，纤维蛋白原的活性作为在t = 0时初始纤维 蛋白原活性的百分比。 发明详述 在整个本说明书中，除非上下文另有要求，词语"包含（comprise)"，或变体如"包含 (comprises) "或"包含（comprising) "将被理解为暗示包含所述成分或整体或成分或整体 的群组，但是不排除任何其他成分或整体或成分或整体的群组。 在本说明书中涉及的任何现有出版物（或从它衍生的信息），或以任何已知事项，不 是，并且不应该被视为承认或认可或任何形式的建议该现有出版物（或者从它衍生的信 息）或已知的物质形成本说明书涉及的领域中的公知常识的一部分。 必须注意到，在本说明书所使用的，单数形式的"一种（a) "，"一种（an)"和"该（the)" 包含复数方面，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及"一种制剂"包含单一制剂，以 及两种或两种以上的制剂。 在缺乏对相反的任何指示，贯穿于整个说明书中，涉及"％ "的内容是指％ w/w(重量/ 重量）的含义。例如，包含至少80%总蛋白的纤维蛋白原溶液是指包含至少80% w/w总蛋 白质浓度的纤维蛋白原溶液。这可以通过，例如将得自可凝固蛋白测定的纤维蛋白原的量 除以从标准蛋白测定法（例如缩二脲）得到的总蛋白量并乘以100而计算。在可凝固蛋白 测定法中，在样品中加入凝血酶以形成凝块，其几乎全是纤维蛋白。该凝块可以通过离心从 含非可凝固蛋白质上清液中分离。随后用碱性尿素或其它物质冲洗凝块和溶解，并通过分 光光度法测定蛋白质浓度。由于大多数凝块是纤维蛋白，该蛋白质浓度将相当于纤维蛋白 原浓度。因此，一个样本中可凝固蛋白质的量是相当于样品中总蛋白质和非可凝固蛋白质 成分之间的差值。 纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF从原料中的纯化（例如，血浆或细胞培养物上 清液）通常是通过常规级分而实施的，其中所述纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF从 使用的溶液中被沉淀，例如，乙醇，硫酸铵，β丙氨酸/甘氨酸，聚合物（例如，聚乙二醇） 和/或低离子强度溶液。目前采用不同层析步骤的血浆纯化方法可以获得目标蛋白质相对 高的产率和均质制剂。然而，这些方法通常产生包含残余量杂质的制剂，这些杂质可能不适 合用于配制用于临床应用的稳定液体制剂。杂质如凝血酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物 (tPA)和纤维蛋白溶酶原是特别有问题的，因为去稳定化水平的这些杂质可以水解水溶液 中的纤维蛋白原，从而使纤维蛋白原不稳定，特别是在制造和/或长期储存过程中。 基于以下发现，本发明是可以预期的，至少是部分可预期的，即包含纤维蛋白原和/或 因子VIII和/或VWF的原料通过疏水电荷诱导层析（HCIC)树脂并且回收通过该树脂的包 含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液是一种有效替代现有的用于减少溶液中 纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它的蛋白酶不稳定水平的纯化 方法的方法。 因此，在本发明的一个方面，提供了一种减少至少一种包含选自由纤维蛋白原，凝血 因子VIII和血管性血友病因子（VWF)组成的组的蛋白质的溶液中至少一种选自由纤维蛋 白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其它蛋白酶组成的组的蛋白质的方法，该方法包 含： (i) 在选择的条件下，使包含至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组的 蛋白质的原料通过疏水性电荷诱导色谱树脂，所述选择的条件使得存在于原料中的至少一 种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质结 合至树脂上；和 (ii) 回收通过树脂的包含所述至少一种选自由纤维蛋白原，因子VIII和VWF组成的组 的蛋白质的溶液，其中该溶液中所述至少一种选自由纤维蛋白溶酶原，组织纤维蛋白溶酶 原激活物和其他蛋白酶组成的组的蛋白质的浓度相比于原料减少了至少50%。 在一个实施方案中，在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收溶液中，纤 维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减 少了至少60%，至少70%，至少80%，或至