)存在的条 件下，包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液或原料通过阴离子交换色谱树脂。 在这些类型的条件下，预期因子VIII和/或vWF将结合到阴离子交换色谱树脂上。 因子VIII和/或VWF可以用包含至少300mM的盐，如NaCl，的洗脱缓冲液从阴离子交 换树脂上洗脱。在一个具体的实施方案中，因子VIII和/或VWF用约500mM NaCl从阴离 子交换树脂上进行洗脱。在纤维蛋白原和因子VIII和/或VWF结合至阴离子交换树脂的 情况下，可以进行洗脱步骤，使得纤维蛋白原首先被洗脱（例如使用在上述实施方案中描 述的条件），然后使用更高浓度的盐，如500mM NaCl，将因子VIII和/或VWF洗脱。 在使用阴离子交换色谱步骤的情况下，它可以在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/ 或VWF原料通过该HCIC树脂之前和/或之后进行。在本文所公开的一个实施方案中，该方 法进一步包含使在步骤（ii)回收的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液通 过阴离子交换色谱树脂。在另一个实施方案中，其中如本文所述使用第一和第二HCIC色谱 步骤，所述方法还包含使在步骤（ii)和/或步骤（iv)回收的包含纤维蛋白原和/或因子 VIII和/或VWF的溶液通过阴离子交换色谱树脂。 在本文公开的一个实施方案中，该方法进一步包含在步骤（i)之前，使包含纤维蛋白 原和/或因子VIII和/或VWF的溶液通过阴离子交换色谱树脂。 本领域技术人员将理解，按照本发明使用附加的色谱步骤的数量将取决于最终制剂所 需的纯度水平。例如，本发明的方法可以如本文所公开的包含2,3,4或5个色谱步骤。例 如，其中该方法包含2个色谱步骤，步骤的顺序将是HCIC/IEX或HCIC/HCIC或IEX/HCIC ; 其中该方法包含3个层析步骤，步骤的顺序将是HCIC/IEX/HCIC或HCIC/HCIC/IEX或HCIC/ HCIC/HCIC 或 HCIC/IEX/IEX 或 IEX/HCIC/HCIC 或 IEX/HCIC/IEX 或 IEX/IEX/HCIC ;其中该 方法包含4个层析步骤，步骤的顺序将是HCIC/IEX/HCIC/HCIC或HCIC/HCIC/IEX/HCIC或 HCIC/HCIC/HCIC/IEX 或 HCIC/HCIC/HCIC/HCIC 或 HCIC/IEX/IEX/HCIC 或 HCIC/IEX/IEX/ IEX 或 HCIC/HCIC/IEX/IEX 或 HCIC/IEX/HCIC/IEX 或 IEX/HCIC/IEX/HCIC 或 IEX/HCIC/ HCIC/IEX 或 IEX/HCIC/HCIC/HCIC 或 IEX/HCIC/IEX/IEX 或 IEX/IEX/HCIC/HCIC 或 IEX/IEX/ HCIC/IEX或IEX/IEX/IEX/HCIC;等等（其中"IEX"表示阴离子交换色谱法）。纯度所需的 水平可以通过溶液的预期用途（例如，用于治疗纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF缺 乏的患者）和/或作为水性制剂所需的较长的贮存期而规定。 可以使用本领域技术人员所公知的任何方法来实施色谱法。例如，根据本发明的色谱 步骤可以使用轴流的柱子，例如可以从GE Heal thcare，Pall公司和Bio-Rad公司获得的， 或径流的柱子，如可以从Proxcys获得的。根据本发明的色谱步骤还可以使用膨胀床技术 进行。 在一个实施方案中，在包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的回收溶液中纤维 蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶的浓度，相比于原料减少 了至少60%，至少70%，至少80%，或至少90%或至少95%。 最大限度地去除杂质是特别有利的，杂质如纤维蛋白溶酶原和/或组织纤维蛋白溶酶 原激活物和/或其它蛋白酶，因为决定性的改善了溶液中纤维蛋白原和/或因子VIII和/ 或VWF的稳定性和效力，特别是在长期储存中。液体形式存储对于包含纤维蛋白原和/或 因子VIII和/或VWF的溶液是特别有利的，因为使得在患者中即时使用成为可能。这是在 相比于纯化的纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的冻干制剂的应用，冻干制剂在施用 到有此需求的受试者之前需要立即使用注射用适宜的缓冲液和/或水重构冻干蛋白。 从包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液中消耗蛋白酶或其酶原（如纤 维蛋白溶酶原）的一个优点是，它最大限度地减少了添加抗纤维蛋白溶解剂的需求，抗纤 维蛋白溶解剂抑制任何残留的蛋白酶和或酶原（例如，纤维蛋白溶酶或纤维蛋白溶酶原）。 这些试剂的实例包含抑肽酶，纤维蛋白溶酶的牛蛋白抑制剂；传明酸，其是也与神经毒性副 作用相关的一种合成的纤溶酶抑制剂。 另一个有利的特征是纤维蛋白溶酶原，其已经通过HCIC从包含纤维蛋白原和/或因子 VIII和/或VWF的溶液中分离出来，可以进一步处理以产生纤维蛋白溶酶原浓缩物，用于例 如，临床使用。因此，从单一起始溶液HCIC可用于制备纤维蛋白溶酶原和包含纤维蛋白原 和/或因子VIII和/或VWF的溶液。 另一个有利的特征是，HCIC树脂的生产成本远远比在亲和色谱过程中使用的赖氨 酸-Sepharose?或固定化的赖氨酸树脂的成本更经济。 另一个有利的特征是HCIC可以用来替代用于去除蛋白酶（如凝血因子II)的氢氧化 铝（例如Alhydrogel?)步骤。Alhydrogel?目前广泛用于因子VIII和VWF的商业化生产。 但是，这种材料相对昂贵，通常每批使用IOOKg的数量级别。此外，Alhydrogel?往往需要 人工处理并且在使用一次后该材料就被丢弃。与此相反，HCIC步骤可以完全自动化并且该 树脂可以在多个批次的制造中使用。 另一个有利特征是HCIC树脂是与IM NaOH相容的，IM NaOH可用于在柱子的清洗和树 脂消毒工序期间失活和去除包含病毒和朊病毒的病原体。 从本发明的方法得到的液体制剂也比使用冷冻制剂具有优势，冷冻制剂需要昂贵的储 存和运输装置并且在立即使用之前必须解冻。即使是在纤维蛋白原和/或因子VIII和/或 VWF存储为冻干或冷冻制剂的情况下，重构或解冻的蛋白质稳定较长时间也是有利的。这是 显而易见的，例如，在作为医疗过程的预防措施原料已经被重构的情况下，但是基于医学上 考虑不需要应用它。这种原料通常被丢弃，因为由于凝血酶原和/或t-PA和/或其它蛋白 酶的存在，纤维蛋白原仅在一个短期的期间内是稳定的。 在具体实施方案中，本发明的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的液体制剂 存储为液体或冻干或冷冻制剂。 在本发明的另一个方面，提供了一种用于纯化纤维蛋白原的方法，该方法包含以下步 骤： (i) 在选择的条件下，使包含纤维蛋白原的溶液通过离子交换色谱树脂，所述选择的条 件使得纤维蛋白原单体结合到树脂上； (ii) 用洗脱缓冲液从树脂上洗脱纤维蛋白原单体；和 (iii) 经由具有从约15nm至约35nm范围孔径的过滤器，过滤来自步骤（ii)的所述洗 脱纤维蛋白原单体。 在一个实施方案中，在选择的条件下，在包含纤维蛋白原的原料通过疏水电荷诱导色 谱树脂之后回收包含纤维蛋白原的溶液（步骤（i))，所述选择的条件使得纤维蛋白溶酶原 和/或组织纤维蛋白溶酶原激活物和/或其它蛋白酶结合到树脂上并且纤维蛋白原通过树 脂。 在一个实施方案中，离子交换色谱树脂选自阴离子交换色谱树脂或阳离子交换色谱树 脂。 在一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂是强阴离子交换色谱树脂或弱阴离子交换色 谱树脂。在一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂包含季铵基基团。实例包含季烷基胺和 季烷基烷醇胺，或胺，二乙胺，二乙基氨基丙基，氨基，三甲铵甲基，三甲基苄基铵，二甲基乙 醇基苄铵和聚胺。在一些实施方案中，阴离子交换色谱树脂是接枝有叔胺基或季胺基的聚 合物载体或是接枝有叔胺基或季胺基的羟基化聚合物的载体。在一些实施方案中，阴离子 交换色谱树脂包含甲基丙烯酸酯聚合物载体。在一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂是 MacroPi^p? HQ。在另一个实施方案中，阴离子交换色谱树脂是GigaCap?Q-650M。在其它 实施方案中，阴离子交换色谱树脂被填充到柱子中。 如果需要的话，可以使用阴离子交换层析膜替代阴离子交换色谱树脂。市售的阴离 子交换膜包含，但不限于，来自Sartorius的Sartobind? Q，来自PallTechnologles的 Mustang? Q，来自 Millipore 的 Intercept? Q 膜。 在一个实施方案中，阳离子交换色谱树脂是强阳离子交换色谱树脂或弱阳离子交换色 谱树脂。 市售的阳离子交换色谱树脂包含，但不限于，例如，那些具有磺酸基团的树脂（例如， 来自 Ge Heal thcare 的 MonoS，MiniS，Source? 15S 和 30S，SP Sepharose Fast Flow?，SP Sepharose High Performance?，来自 Tosoh 的Toyopearl?SP-650S和 SP-650M，来自 BioRad 的 Macro-Prep Higg? S，来自 Pall Technologies 的 Ceramic HyperD? S，Trisacryl? M 和LS? SP和Spherodex? LS SP);具有磺基基团的树脂（例如，来自EMI)的Fractogel? SE，来自Applied Biosystems的Poros? S-IO和S-20);具有磺基基团的树脂（例如，来自 Tosoh 的 TSK? Gel SP 5PW和 SP-5PW-HR，来自 Applied Biosystems 的 Poros? HS-20 和HS 50);具有sulfoisobutyl基团的树脂（例如，来自EMI)的Fractogel? EMDS03"）；具有亚磺 酰基基团的树脂（例如，来自Whatman的SE52, SE53和Express-Ion S)，具有羧甲基化基团 的树脂（例如，来自 Ge Healthcare 的CM Sepharose Fast Flow?，来自 Biochrom Labs Inc. 的 Hydrocell? CM，来自 BioRad 的 Macro-Prep? CM，来自 Pall Technologies 的 Ceramic HyperD? CM，Trisacryl?M CM，Trisacryl? LS CM，来自 Millipore 的 Matrex Cellufine? C500 和 C200,来自 Whatman 的 CM52?，CM32?，CM23?和 Express ?-Ion C，来自 Tosoh 的 Toyopearl? CM-650S，CM-650M和CM-650C);具有磺酸和羧酸基团的树脂（例如，来自 J. T. Baker 的 BAKERBOND? Carboxy-Sulfon);具有羧酸基团的树脂（例如，来自 J. T. Baker 的 WP? CBX，来自 Dow Liquid Separations 的 DOWEX MAC-3?，来自 Sigma-Aldrich 的 Amberlite?弱阳离子交换剂，DOWEX ?弱阳离子交换，和Diaion ?弱阳离子交换剂和来自 EMD的Fractogel? MMID C00-);具有横酸基团的树脂（例如，来自Biochrom Labs Inc.的 Hydrocell? SP，来自 Dow Liquid Separations 的DOWEX? Fine Mesh Strong Acid Cation Matrix，来自 J. T. Baker 的 UNOsphere? S，WP Sulfonic，来自 Sartorius 的 Sartobind? S membrane，来自Sigma-Aldrich的Amberlite?强阳离子交换剂，DOWEX ?强阳离子和 Diaion强阳离子交换剂）；和具有磷酸基团的树脂（例如来自Whatman的PI 1)。如果需要 的话，可以使用阳离子交换层析膜替代阳离子交换基质，例如，Sartobind? S(Sartorius; Edgewood, NY)〇 在一个实施方案中，包含纤维蛋白原的溶液具有约pH 7至pH 10范围内的pH值。在 一个实施方案中，所述包含纤维蛋白原溶液的PH为约pH 8。在一些实施方案中，在所述阴 离子交换色谱树脂负载纤维蛋白原后，用具有与包含纤维蛋白原的溶液相类似PH的缓冲 液预平衡和冲洗柱子。 在一个实施方案中，洗脱缓冲液具有从约18至约30mS/cm范围的电导率。例如，洗脱 缓冲液的电导率可以是在约18至约25mS/cm的范围内；或约19至约24mS/cm ;或约20至 约24mS/cm ;或约21至约23mS/cm。在一个实施方案中，洗脱缓冲液的电导率为约22mS/cm。 在其它实施方案中，洗脱缓冲液包含NaCl。在一个实施方案中，洗脱缓冲液包含约180mM至 约230mM，或约190mM至约210mM范围浓度的NaCl。在一个实施方案中，洗脱缓冲液中NaCl 的浓度为约200mM。 在一个实施方案中，包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液包含约〇. 5至约10mg/mL浓度的蛋 白质。在一些实施方案中，包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液中蛋白质的浓度范围是从约4至 约8mg/mL。在具体实施方案中，包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液是约6mg/mL。 在一个实施方案中，在过滤（步骤（iii))之前，用一个或多个氨基酸配制洗脱的纤维 蛋白原单体。在一个实施方案中，氨基酸为精氨酸或甘氨酸或其组合。在一些实施方案中， 在包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液中氨基酸的浓度范围是从约0. 5至约10% (w/w)。在一个 实施方案中，在包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液中氨基酸的浓度是约1%至约6% (w/w)，或 约2%至约6% (w/w)或约2%至约5% (w/w)。在一个实施方案中，用约2%，或约3%，或 约4%或约5% (w/w)的精氨酸配制包含纤维蛋白原的洗脱缓冲液。 在一个实施方案中，洗脱的纤维蛋白原单体的PH是从约pH 7至约pH 9。 在一个实施方案中，步骤（ii)的过滤器具有从约15nm至约35nm范围的孔径；或从约 15nm至约30nm ;或从约15nm至约25nm ;或从约15nm至约20nm。 可以使用切向流过滤（TFF)或"死端（dead-end) "过滤（也称为正常流动过滤）实施 过滤病毒。病毒过滤器最初设计为原料流入相邻的非对称膜的上层而于TFF中应用。通过 扫膜表面以减少极化浓度和污染，TFF提供了高通量。然而，死端过滤的简单性和较低的资 金成本，已经导致了专为死端过滤设计的病毒过滤器的普遍使用。与TFF相对比，这些死端 过滤器通常在膜的朝向进料流的更开放的一面进行操作，使蛋白质聚集体和其它大污物在 大孔亚结构内被捕获从而保护了保持病毒的皮层。使用一次性的死端过滤器的优点包含， 它们既简化系统设计和验证，又降低了劳动力和资金成本。 死端过滤通常涉及使用单个泵使流体从表面通过膜。 切向流过滤通常需要第一个泵以在过滤膜的表面保持恒定的流速和第二个人泵通过 在膜的背面产生一个负压而驱动蛋白质通过所述膜。 在一个实施方案中，过滤是通过死端过滤进行的。 在一个实施方案中，死端过滤过程是使用恒压过滤或等速过滤进行的。在一个实施方 案中，死端过滤过程是使用恒压过滤进行的。 过滤通常在过滤压力下实施的，过滤压力与所述膜可以承受的水平相同或在低于所述 膜可以承受的水平，这取决于这里打算使用的病毒除去膜的材料，例如具有约〇. 2至3. 4巴 的压力。在一个实施方案中，过滤压力保持在约〇.2bar至约3. 4巴。在另一个实施方案 中，过滤压力保持在约1至约3巴；或在约1至约2巴；或在约1. 2到约2巴。在另一个实 施方案中，过滤压力保持在约1. 5巴至约1. 9巴。 温度可能影响病毒除去膜上的蛋白质溶液粘度和过滤的通量。本领域技术人员可以理 解的是，在过滤步骤中使用的溶液将通常具有从约〇°C到至多相关蛋白质变性温度的范围 内的温度。溶液的适宜温度在从约l〇°C至约50°C的范围内。在一个实施方案中，溶液的温 度在从约18°C到上至约35°C的范围内。在另一个实施方案中，溶液在从约18°C至约26°C 的室温下过滤。
[0108] 在一个实施方案中，病毒过滤器容量是过滤器表面积每m2至少0.20kg或至少 0. 50kg或至少0. 75kg或至少1.0 Okg或者至少I. 25kg或至少I. 50kg或至少2kg纤维蛋白 原。 任选地，为了除去宏观尺寸的颗粒，可以在病毒过滤前进行预过滤或净化过滤步骤。 在一个实施方案中，用包含比病毒除去膜孔径更大的膜的预过滤器进行预过滤。在一个实 施方案中，预过滤器是具有约〇. 1 μ m孔径的膜滤器。在另一个实施方案中，预过滤器选自 Pall Nylon膜过滤器（SKL 7002 NTP 0.1 ym或FTKNI)或具有用于除去蛋白聚集体和/或 颗粒的类似性质的市售其它预过滤器。预过滤可以是相对于病毒过滤器在线进行的或者与 病毒过滤器相脱线的。在一个实施方案中，预过滤是相对于病毒过滤器在线进行的。 根据本发明的这个方面的用于病毒过滤方法的适合的过滤器将是本领域技术人员所 公知的。一个实例特别是包含Planova BioEx?。这种过滤器有时被称为"小病毒"去除过 滤器。 在一个实施方案中，过滤膜是一个平板或中空纤维膜。平板膜的实例包含亲水化PVDF 滤膜，如Pegasus?Grade SV4小病毒清除过滤器（Pali公司）。在一个实施方案中，过滤器 是 Pegasus?Grade SV4〇 在其它实施方案中，过滤器是中空纤维膜。中空纤维膜可以包含稻草形的中空纤维束， 每个中空纤维的壁含有由通过细的毛细管互连的孔隙构成的多孔三维网络结构。中空纤维 过滤器的实例包含Planova?BioEX?过滤器（Asahi Kasei Corporation)，其在中空纤维膜 格式中结合亲水改性聚偏二氟乙烯（PVDF)。在一个实施方案中，过滤器是Plan〇Va?Bi〇EX。 在一个实施方案中，串联使用两个或多个小病毒过滤器。在一个实施方