通过用烷基阳离子处理来降低蛋白质制剂中的染色质含量的方法
【专利摘要】降低具有靶蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法包括使所述制剂与烷基阳离子接触以形成混合物，和使所述混合物与至少一种官能化固体接触以去除过量的烷基阳离子。
【专利说明】通过用烷基阳离子处理来降低蛋白质制剂中的染色质含量的 方法
【背景技术】
[0001] 本文所公开的实施方案设及用于增强包括抗体的蛋白质的纯化的方法。它们特别 设及用于降低聚集物的水平的方法，并且可W与细胞培养收获物澄清方法组合。它们进一 步设及运些能力与其它纯化方法的整合W实现期望的蛋白质纯度水平。
[0002] 聚集物去除是蛋白质纯化的一个重要方面。已证明低浓度的黄色巧光杂环染料依 沙叮晚降低抗体制剂的聚集物含量，并且运一结果可能部分地归因于染色质去除(Gan等， J.C虹omatography A 1291(2013)33-40)。依沙日丫晚具有作为蛋白质沉淀剂的悠久历史。
[0003] 表面活性剂西曲漠锭（cetrimonium bromide)被用作局部抗菌剂。它还被用于产 生金纳米粒子，并且广泛地用于护发产品。它被用于蛋白质分析和DNA提取领域，在蛋白质 分析领域中，它提高了复合糖蛋白在聚丙締酷胺凝胶电泳中的解析率。已知它没有应用于 蛋白质分级分离领域中。
【发明内容】
[0004] -种降低包含祀蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法，所述方法包括使所述制剂 与烷基阳离子接触W形成混合物和使所述混合物与至少一种官能化固体接触W去除过量 的烷基阳离子。
【具体实施方式】
[0005] 本文所公开的方法提供了通过用烷基阳离子处理含有期望蛋白质的样品来降低 所述样品中的蛋白质聚集物的手段。在一些实施方案中，可W利用超低水平的烷基阳离子 来实现复合物和/或聚集物的降低。在一些实施方案中，可升高的电导率值(使用升高 的盐浓度)处理所述样品。在一些实施方案中，随后可W使处理的样品暴露于带有化学部分 的固体材料，所述化学部分从所述蛋白质制剂选择性地去除烷基阳离子和聚集物。
[0006] 另外，提供用于通过本文所公开的方法纯化蛋白质的试剂盒。在一些实施方案中， 所公开的方法提供通过使此类期望的蛋白质与一种或多种烷基阳离子接触而从抗体或其 它蛋白质制剂降低聚集物。在一些实施方案中，所公开的方法可W在所谓的生理条件到为 此类条件最高达=倍或更高倍的电导率值的电导率水平范围下实施。此类升高的电导率水 平可W允许将所述方法应用到酸性蛋白质，而不会有它们在处理期间发生沉淀的风险，且 由此增加可W应用所公开的方法的期望蛋白质物种的多样性。作为参考点，生理电导率通 常被理解为包括约12mS/cm(毫西口子/畑〇到约17mS/cm的范围。
[0007] 在一些实施方案中，所公开的方法可W利用超低浓度的烷基阳离子来实施;所述 浓度如约0.01 %到约0.05%，包括其间的任何值和范围。在一些实施方案中，所公开的方法 提供使所述处理的蛋白质制剂与增强所述处理降低聚集物含量的总体能力的固体材料接 触，所述降低聚集物含量通常与降低宿主蛋白质污染并行;并且提供去除过量烷基阳离子 的额外优点。在一些实施方案中，所述烷基阳离子是嫁蜡基=甲基漠化锭。
[0008] 在一些实施方案中，所公开的方法提供降低相比于期望蛋白质具有高分子量的聚 集物如均质聚集物的水平，并且还提供降低流体动力学大小仅适度大于期望蛋白质的聚集 物如异质聚集物的水平。在一些实施方案中，聚集物包括期望蛋白质和污染物的异质聚集 物并且在某些此类实施方案中，所述污染物是核酸、核巧酸、内毒素、金属离子、蛋白质、月旨 质或细胞培养基组分。在一些实施方案中，基本上消除了期望蛋白质的均质聚集物的存在。 在一些实施方案中，基本上消除了期望蛋白质和污染物的异质聚集物的存在。在一些实施 方案中，基本上消除了不包含期望蛋白质的均质聚集物和异质聚集物的存在。
[0009] 在一些实施方案中，所公开的方法另外提供污染物如DNA、内毒素和病毒水平的降 低连同聚集物的降低。在一些实施方案中，所公开的方法通过另外包含除烷基阳离子自身 W外的抗病毒剂来实施。
[0010] 在一些实施方案中，目标蛋白质物种(例如，待纯化的期望蛋白质)是重组来源的， 并且所述蛋白质制剂可W包括含细胞的细胞培养收获物、细胞培养物上清液、澄清的细胞 培养物上清液、来自色谱柱的洗脱物或从前一纯化阶段获得的含蛋白质的溶液。在一些实 施方案中，所述蛋白质制剂含有抗体，并且在某些此类实施方案中，所述抗体是IgG、IgM或 其片段形式，或抗体或抗体片段的融合蛋白质，如Fc-融合蛋白质。在一些实施方案中，所述 期望蛋白质可W是凝血蛋白质，如因子VIII。在一些实施方案中，所述期望蛋白质可W是肤 激素，如人生长激素。
[0011] 在一些实施方案中，实施所公开的方法W使得样品的电导率处于足够高的水平W 基本上避免期望蛋白质从所述样品中沉淀出来。可W根据本领域内已知的方法通过添加盐 或稀释剂来调节电导率。在一些实施方案中，所述电导率比被确定为避免期望蛋白质的显 著沉淀所需的水平大511战/畑1、1〇1115/畑1、151115/畑1或2〇1115/畑1。在一些实施方案中，所述电导率 大于 2〇1115/畑1、251115/畑1、3〇1115/畑1、351115/畑1、4〇1115/畑1、451113/畑1或大于451115/畑1。所述方法在升 高的电导率下去除重要的污染物亚群的能力代表了所公开的方法的令人惊讶的特征之一， 因为已知运些体系中的电荷相互作用在升高的电导率下会降低。在例如25mS/cm和更高的 电导率下，已知仅少数带负电荷的蛋白质结合到正电性表面。除了本方法W外，对IgG抗体 制剂应用最具正电性的试剂在小于5mS/cm的电导率下进行，并且通常有碱性抑值的额外操 作要求。运样的操作pH值并不是本方法的要求。对于本领域普通技术人员将显而易见的是， 升高的电导率可能具有减弱聚集物内的内部静电缔合的作用，且由此增加所述方法实现聚 集物的离解和/或与期望蛋白质缔合的污染物的去除的能力。
[0012] 在一些实施方案中，所述烷基阳离子是嫁蜡基S甲基漠化锭（IUPAC名称:N，N，N- =甲基-1-十六烷基漠化锭）、其类似物或盐。嫁蜡基=甲基漠化锭也被称为西曲漠锭。类似 物包括具有不同碳残基（carbon residue)数的烷基阳离子，如12个、13个、14个、15个、16 个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个或24个碳，所述碳可W呈支链或直链构型。阳离 子基团可W由季胺、伯胺、仲胺、叔胺或如由= (2-氨乙基)胺体现的正电荷的组合组成。
[0013] 在一些实施方案中，所述烷基阳离子W足W促进聚集物的期望降低程度的基本上 最低浓度被提供。在一些实施方案中，所述烷基阳离子的浓度可W小于重量/体积计） 1%、0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.04%、0.025%或0.001%。在一些实施方案中，正电性 有机添加剂W0.01-0.04 %或0.02-0.025%的浓度被提供。
[0014] 在一些实施方案中，所公开的方法可W在所选的抑水平下被实施W避免或限制期 望蛋白质的沉淀，同时降低样品中的聚集物的量。所述抑水平可w通过常规手段加 w调节 并且可W结合电导率的选择来选择。在一些实施方案中，所述样品的pH值为大约4到大约9、 大约5到大约8或大约6到大约7.5。
[0015] 在一些实施方案中，另外使所述样品与除烷基阳离子自身W外的抗病毒剂接触。 在某些此类实施方案中，所述抗病毒剂是非多价有机阳离子，如苯扎氯锭、氯己定、依沙叮 晚或憐酸S(正下基)醋。此类抗病毒剂可小于大约l%(w/v)、小于大约0.1%(w/v)、或 小于大约0.01 % (w/v)或小于大约0.001 %的量存在。
[0016] 在一些实施方案中，所述方法另外包括使所述样品与酷脈接触的步骤，所述酷脈 的量足W使所述酷脈不溶于所述样品中。然后可W将含有期望蛋白质的上清液与包含沉淀 污染物的剩余样品分离。在某些此类实施方案中，在使所述样品与所述正电性有机添加剂 接触的步骤之前供应所述酷脈，在其它实施方案中，将所述酷脈基本上与使所述样品与所 述正电性有机添加剂接触的步骤同时供应，并且在其它实施方案中，在使所述样品与所述 正电性有机添加剂接触的步骤之后供应所述酷脈。在某些此类实施方案中，酷脈可W是W 下中的任一种:尿酸、乙内酷脈(咪挫烧-2，4-二酬）、尿囊素氯径侣、尿囊素侣、hemocane、脈 基乙内酷脈、5-脈基乙内酷脈、乙醒酷基酷脈、乙醒酸二酷脈、2,5-二氧代-4-咪挫烷基脈 (尿囊素）、咪挫烷基脈、二咪挫烷基脈和嚷岭。在一些实施方案中，酷脈是尿囊素，并且在一 些运样的情况下，尿囊素 W大于〇.56%(*八）、1%、1.5%、2%或更大的浓度存在。在一些实 施方案中，酷脈是尿酸，并且在一些运样的情况下，尿酸W大于0.0025 % (w/v)、0.005 %、 0.01%、0.05%、0.1%、1%或更大的浓度存在。
[0017] 在一些实施方案中，所述方法另外包括使所述样品与一定量的酷脈接触的步骤， 在所述量下，所述酷脈完全溶解。在某些此类实施方案中，可溶性酷脈可W是脈、咪挫烷基 脈或另一酷脈。在一些实施方案中，酷脈是脈，并且在一些此类情况下，脈W大于0.5M、或大 于1M、或大于2M、或大于4M、或大于6M、或大于8M的浓度存在。运再次强调了所述方法令人惊 讶的性质，其中避免沉淀是所述方法的特定目的。高可溶性酷脈如脈具有增加许多化合物 的溶解度的一般作用，也就是说它们的存在阻碍沉淀物的形成。
[0018] 在一些实施方案中，W下事实增强了所公开的方法的实用性:它们还加速细胞培 养收获物中细胞碎片的沉降，并且显著降低DNA、内毒素和病毒（当存在时）的水平。实验数 据表明，一些酷脈优先与聚集物、内毒素和病毒相互作用的能力促成了运些结果，并且相比 于在酷脈不存在的情况下用多价阳离子进行的处理，低水平的溶解酷脈可W促成它们所支 持的更高抗体回收率。在处理之后，可W通过沉降或过滤去除固体材料，留下上清液中基本 上无聚集物的蛋白质。
[0019] 在一些实施方案中，可W利用使所述样品与可溶性有机调节剂如非离子型有机聚 合物、有机溶剂、表面活性剂或酷脈接触的额外步骤来实施所公开的方法。在某些此类实施 方案中，使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在使所述样品与所述正电性有机添加剂 接触的步骤之前发生。在其它实施方案中，使所述样品与所述有机调节剂接触的步骤基本 上与使所述样品与所述正电性有机添加剂接触的步骤同时发生。在其它实施方案中，使所 述样品与所述有机调节剂接触的步骤在使所述样品与所述正电性有机添加剂接触的步骤 之后发生。在一些实施方案中，有机调节剂是非离子型有机聚合物，如聚乙二醇、聚丙二醇 和聚下二醇，并且在某些此类实施方案中，非离子型有机聚合物具有大约1000D或更小、 500D或更小，250D或更小，或lOOD或更小的平均分子量。在一些实施方案中，有机调节剂是 有机溶剂，如乙二醇、丙二醇、下二醇、二甲亚讽、乙醇或苯氧乙醇。在一些实施方案中，有机 调节剂W大约l%(w/v)或更大的浓度被提供。在一些实施方案中，有机调节剂是表面活性 剂，如吐溫(Tween)、化iton、CHAPS、CHAPSO或辛基葡糖巧，并且在某些此类实施方案中，表 面活性剂W大约l%(w/v)或更小、大约0.1%或更小或大约0.02%(w/v)或更小的浓度被提 供。在一些实施方案中，有机调节剂是W亚饱和量提供的酷脈，并且在某些此类实施方案 中，酷脈是脈、乙内酷脈或尿囊素。
[0020] 在一些实施方案中，所公开的方法提供用于方便实施所公开的方法的某些方法的 试剂盒。此类试剂盒可W提供可用于实施所公开的方法的试剂，如多价有机阳离子、酷脈、 有机调节剂、抗病毒剂和用于调节电导率的试剂中的一种或多种。所述试剂盒可W提供适 于实施用于纯化蛋白质的所公开的方法的量和浓度的材料。此类试剂盒可W适用于某些蛋 白质如IgG或IgM抗体，并且可W适应于适合某些规模的蛋白质制剂和纯化的量。
[0021] 在一些实施方案中，在所公开的方法之后可W使所述样品与固体材料接触，目的 是所述固体具有在另外加工之前从所述样品选择性去除过量烷基阳离子或其它样品组分 的效果。
[0022] 在一些实施方案中，所公开的方法可W与常规的蛋白质纯化方法组合，W实现更 高的纯化水平或去除其它污染物。例如，所公开的方法可W被实施W为设及沉淀、色谱和 液-液萃取法的常规纯化方法作准备。研发用于运些方法的适当条件并且将它们与本文所 述的所公开方法整合W实现对产品的期望纯化，在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0023] 在一些实施方案中，操作条件可W相对于pH值和/或随着存在的馨合剂、有机聚合 物或溶剂、表面活性剂、离液剂和各种盐物种而变化，W调节聚集物降低到的程度并且期望 蛋白质保留于溶液中。
[0024] 在一些实施方案中，提供了降低包含祀蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法，所 述方法包括使所述制剂与烷基阳离子接触W形成混合物和使所述混合物与至少一种官能 化固体接触W去除过量的烷基阳离子。
[0025] 在一些实施方案中，所述方法可W进一步包括使混合物与芳基阳离子接触。在一 些实施方案中，芳基阳离子可W是依沙叮晚或亚甲蓝。在一些实施方案中，烷基阳离子和芳 基阳离子的组合浓度可W与烷基阳离子单独使用时的浓度相同。在此类实施方案中，烷基 阳离子W非零量存在。
[0026] 在一些实施方案中，本文所公开的方法可W进一步包括使混合物同时或依序与至 少一种正电性固体接触W进一步降低所述制剂的聚集物含量。
[0027] 在一些实施方案中，烷基阳离子包括选自由W下组成的组的季锭阳离子的漠化物 盐或氯化物盐：西曲锭（cetrimonium)、嫁蜡基S甲基锭、N，N，N-S甲基-1-十六烷基锭、N, N，N-S甲基-1 -十屯烷基锭、N，N，N-S甲基-1 -十八烷基锭、N，N，N-S甲基-1-十五烷基锭和 N，N，N-S甲基-1-十四烷基锭。
[00%]在一些实施方案中，烷基阳离子W选自由W下组成的组的浓度范围存在：（a)约 0.001 % 到约1 %; (b)约 0.01 % 到约1 %;和(C)约 0.02% 到约 0.03%。
[0029]在一些实施方案中，尿囊素 W选自由W下组成的组的浓度范围存在：（a)约0.6% 到约50%; (b)约1 %到约10%;和(C)约1 %到约2%。
[0030] 在一些实施方案中，操作电导率处于选自由W下组成的组的范围：（a)约0.1 mS/cm 到约 50mS/cm; (b)约 ImS/cm到约 30mS/cm;和（C)约 5mS/cm到约 15mS/cm。
[0031] 在一些实施方案中，操作pH值处于选自由W下组成的组的范围：（a)约4到约10; (b)约5到约9;和约6到约8。
[0032] 在一些实施方案中，所述混合物进一步包含不为烷基阳离子的抗病毒剂，所述抗 病毒剂选自由W下组成的组:氯己定、苯扎氯锭、亚甲蓝、依沙日丫晚和憐酸=(正下基)醋。
[0033] 在一些实施方案中，至少一种官能化固体的表面促进选自由W下组成的组的化学 相互作用:静电相互作用、疏水相互作用、氨键合和金属亲和。
[0034] 在一些实施方案中，至少一种官能化固体是颗粒物。
[0035] 在一些实施方案中，祀蛋白质包括选自由重组蛋白质、抗体、生长激素和凝血因子 组成的组中的一种。
[0036] 在一些实施方案中，蛋白质制剂是选自由W下组成的组中的一种:含细胞的细胞 培养收获物、基本上无细胞的细胞培养收获物和部分纯化的蛋白质。
[0037] 在一些实施方案中，提供用于方便实施本文所公开的方法的试剂盒。此类试剂盒 可W包括用于实施所述方法的所有必要试剂W及说明书。
[0038] 对W下术语进行了定义，使得可W更容易地理解所公开的方法。另外的定义在整 个【具体实施方式】中有陈述。
[0039] "聚集物"是指在生理条件下稳定并且可在较广的pH值范围和电导率条件下保持 稳定的两个或更多个分子的缔合物。聚集物通常包含至少一个生物分子如蛋白质、核酸或 脂质和另一分子或金属离子。缔合可W通过任何类型或任何组合的化学相互作用发生。抗 体的聚集物可W分为两个类别："均质聚合物"是指两种或更多种相同组成的蛋白质的稳定 缔合物；"异质聚集物"是指一种或多种相同或不同组成的蛋白质任选地与一种或多种非蛋 白质分子的稳定缔合物。所述非蛋白质组分可W由来自由W下组成的组的一种或多种实体 组成:核巧酸、内毒素、金属离子、脂质或细胞培养基组分。
[0040] "抗体"是指免疫球蛋白质、其复合形式或片段形式。该术语可W包括但不限于源 于人或其它哺乳动物细胞系的IgA、I曲、I巧、IgG和IgM类别的多克隆或单克隆抗体，包括天 然形式或遗传修饰形式，例如人源化抗体、人抗体、单链抗体、嵌合抗体、合成抗体、重组抗 体、杂合抗体、突变抗体、移植抗体和体外产生的抗体。"抗体"还可W包括复合形式，包括但 不限于含有免疫球蛋白质部分的融合蛋白质。"抗体"还可W包括抗体片段，例如Fab、F (ab'）2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其它组分，不论它们是否保留抗原结合功能。
[0041] "内毒素"是指存在于革兰氏阴性细菌的外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、 热稳定性的脂多糖物质。
[0042] "非离子型有机聚合物"是指由连接的缺少带电荷基团的重复有机亚基构成的天 然存在的或合成的碳氨化合物。它可为直链的，具有一些支链的主要直链的，或主要支链 的。适于实施所公开的方法的示例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙締化咯烧 酬(PVP)。阳G具有结构式册-(C此-C此-〇)n-H。示例包括但不限于平均聚合物分子量范围为 小于100道尔顿到超过1000道尔顿的组合物。
[0043] "烷基阳离子"是指由呈连续直链或支链构型的12个或更多个碳原子组成的有机 阳离子，其带有至少一个正电荷，其中所述正电荷可W包括额外的碳原子。一个示例是嫁蜡 基=甲基漠化锭。烷基阳离子可w被用作盐，尤其包括漠化物、氯化物和硬脂酸盐。
[0044] "芳基阳离子"是指由呈共面布置的3个环组成的有机阳离子，其带有至少一个可 W通过氮原子或硫原子表示的正电荷。示例包括依沙叮晚（7-乙氧基叮晚-3,9-二胺;2-径 基丙酸）和亚甲蓝（7-(二甲氨基）吩嚷嗦-3-亚基]-二甲基氮偷）W及其类似物、衍生物和 丈h rm. 〇
[0045] "有机溶剂"是指W液体状态存在的天然存在的或合成的有机化合物。适于实施所 公开的方法的示例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亚讽、乙醇和苯氧乙醇。
[0046] "有机聚合物"是指天然存在的有机单体的合成聚合物。示例包括但不限于聚乙二 醇、聚丙二醇、葡聚糖或纤维素等。
[0047] "多核巧酸"是指由链中共价键结的多个核巧酸单体构成的生物聚合物。DNA(脱氧 核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核巧酸的示例。
[004引"蛋白质"是指含有碳、氨、氧、氮且通常含有硫并且主要由一条或多条通过肤键连 接的氨基酸链构成的复杂有机大分子群中的任一种。蛋白质可W是天然或重组来源的。可 用非氨基酸部分对蛋白质进行修饰，例如通过糖基化、聚乙二醇化或与其它化学部分缀合 来修饰。蛋白质的示例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肤激素。
[0049] "不溶酷脈"是指在特定蛋白质制剂通常所用的条件下，含有超过其最大溶解度的 量的酷脈的溶液。在一些实施方案中，所公开的方法提供了运样的具有酷脈的样品，在该样 品的条件下，酷脈存在的量大于该酷脈在该样品中的溶解度，使得该酷脈的一些部分在该 样品中W不溶形式存在。
[0050] "表面活性剂"包括例如通常包含疏水部分和亲水部分、使得它们被称为两亲性的 的一类有机分子的"表面活性的试剂"。在水溶液中足够浓度下，表面活性剂可自缔合成簇， 其疏水部分集中于中屯、W将与水的接触最小化，并且其亲水部分向外福射W将与水的接触 最大化。在生物制剂、特别是含有具疏水特性或具疏水特性区域的材料的那些生物制剂的 存在下，表面活性剂的疏水部分倾向于与疏水物质的一些部分自发缔合，并通过表面活性 剂的亲水部分的影响增加它们的溶解度。它们还可用于调节均溶解于水性溶剂中的不同疏 水材料之间发生的疏水相互作用。适于实施所公开的方法的一些实施方案的表面活性剂的 示例包括但不限于非离子型表面活性剂，例如聚山梨醇醋表面活性剂(例如，吐溫20、聚氧 乙締（20)脱水山梨糖醇单月桂酸醋和吐溫80、聚氧乙締（20)脱水山梨糖醇单油酸醋）和 Triton(例如，聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基下基)-苯基酸）；W及两性离子型表面活性剂， 例如CHAPS(3-[(3-胆酷胺丙基)二甲基氨基]-1-丙横酸盐）、CHAPS0(3-[(3-胆酷胺丙基)二 甲基氨基]-2-径基-1-丙横酸盐)和辛基葡糖巧(例如，（23,35,45,51?，61〇-2-巧圣甲基)-6- 辛氧基环氧乙烧-3，4，5-S醇）。
[0051] "病毒"或"病毒粒子"是指仅在主要为细菌、植物和动物的活宿主的细胞内复制的 超显微的（直径大约为20nm到300nm)、代谢惰性的感染原：其由RNA或DNA核、蛋白质外壳和 在更复杂的类型中包绕的包膜（surrounding envelope)构成。
[0052] 在使用根据一些实施方案的所公开的方法的准备中，将有必要选择烷基阳离子。 实验数据掲示嫁蜡基=甲基漠化锭由于它在降低聚集物方面的有效性W及它使病毒灭活 的能力而是所期望的。它作为抗追疾药和用于治疗高铁血红蛋白血症的治疗剂的用途突出 了它与人体内使用的相容性，并且它被列于美国药典中。
[0053] 在用于一些实施方案中的烷基阳离子的评价过程中，可W对应用条件研究如下。 在一些实施方案中，烷基阳离子的使用对可W用于实施所述方法的条件潜在地构成一些限 审IJ。例如，可能期望采用显著阻止烷基阳离子与目标蛋白质之间的强相互作用的条件。获得 此类条件的近似值的简单方法是将目标蛋白质应用于阴离子交换剂并且将其在盐梯度中 洗脱。正好高于蛋白质洗脱的阀值的盐浓度大致鉴别可W最有效实施所述方法的最低电导 率。该浓度将受抑值影响，pH值可W通过相同手段建模。假定将所述方法应用到细胞培养物 上清液，则IgG抗体可能不需要添加盐或不需要改变pH值W避免显著损失。IgM抗体可能需 要添加盐，甚至对于接近30mS/cm的电导率值（比生理电导率高约2倍)来说。在设及使用不 溶的酷脈和正电性有机添加剂的一些实施方案中，IgG应用可W在低于生理电导率的电导 率下进行，所述电导率潜在地包括ImS/cm或更小的值，在运种情况下，大量宿主蛋白质可W 与离解的聚集物一起被去除。此类应用可能需要增加烷基阳离子的浓度W补偿通过结合到 宿主蛋白质而损失的量。此类情况下更低的操作电导率还可W增强DNA、内毒素和病毒的去 除。在一些实施方案中，所公开的方法通常将支持大于95%且通常为98-99%的抗体回收 率。通常应当在添加酷脈或烷基阳离子之前确定样品的电导率和pH值条件。
[0054] 在一些实施方案中，一种评价用于含有IgG单克隆抗体的澄清的细胞培养物上清 液的条件的有效手段是覆盖0.01%到0.1%烷基阳离子的范围，W及一半生理电导率到2倍 生理电导率范围的电导率。如果结果表明运样做可能有益，则所述范围可W进一步被扩大， 或缩小并W更精细的增量加 W评价。
[0055] 在一些实施方案中，用于研发根据用于澄清的细胞培养物上清液的所公开的方法 的纯化程序的方便起点是使用0.025%嫁蜡基=甲基漠化锭。
[0056] 在一些实施方案中，W在添加正电性有机添加剂之前将有机调节剂分散于蛋白质 制剂中开始可W是有利的，因为所述实践可W提高抗体回收率。在添加正电性有机添加剂 之前进行长期解育似乎是不必要的；15分钟或更少是足够的，虽然更长解育时间似乎没有 缺点。实验数据总体上表明添加约1%的过饱和量的尿囊素增加 IgG的回收率。
[0057] 在一些实施方案中，建议在将烷基阳离子添加到样品中之前将它溶解于例如水或 缓冲液中，W促进它们快速分布于整个蛋白质制剂中。应当例如通过将溶解的烷基阳离子 逐渐注入到充分混合的悬浮液中来小屯、避免持久的局部过量。解育时间应当为至少15分 钟，优选30分钟，但似乎不会显著受益于大于60分钟的持续时间。
[0058] 所述方法通常可W在环境溫度下实施，但可W在更高或更低的溫度(例如4°C到37 °C范围）下进行。实验数据表明所述溫度基本上不改变所得结果，运将使蛋白质的稳定性要 求成为选择操作溫度的决定性因素。
[0059] 在一些实施方案中，在将烷基阳离子添加到样品中之前，将其溶解或分散于例如 水或缓冲液中，并且对抑值进行调节。运是因为烷基阳离子的某些制剂如游离碱形式是碱 性的并且具有基本上W意外方式改变实验条件的潜力。
[0060] 在设及使用超饱和酷脈和烷基阳离子两者的一些实施方案中，W在添加烷基阳离 子之前将酷脈分散于蛋白质制剂中开始通常可W是有利的，因为利用酷脈尿囊素的经历表 明该实践可W提高抗体回收率。在添加正电性有机添加剂之前进行长期解育似乎是不必要 的；15分钟或更少是足够的，虽然更长解育时间似乎没有缺点。
[0061 ]无论是在方法研发还是在制造期间，对于监测通过所述方法实现的聚集物离解或 去除都存在多种选择。最简单的是在具有合适的选择性的柱上进行分析尺寸排阻色谱并且 在280nm的UV波长下监测。运可W掲示HMW(高分子量)聚集物，因为它们通常体现合理地符 合非聚集产物的大小的倍数的流体动力学尺寸。异质聚集物通常被该方法忽略，因为它们 的流体动力学尺寸可能仅仅略大于非聚集产物的尺寸。在此类情况下，所述聚集物的异形 组成可W通过W下方式来掲示:计算254nm下的UV吸光度与280nm下的吸光度的比率，然后 比较该值与被认为完全不含缔合污染物的纯化蛋白质的吸光度比率。含有例如DNA的异质 聚集物将通过254/280的升高比率来掲示。
[0062] 在一些实施方案中，所公开的方法可W在随后纯化之前与去除烷基阳离子和样品 的潜在其它组分的处理整合。此类处理可W包括使样品暴露于带有性质与烷基阳离子的特 征互补的化学部分的固体，目标在于它们将来自所述样品的剩余部分的烷基阳离子馨合。 由于烷基阳离子被理解为带正电荷和疏水的，因而断定带负电荷的表面(包括带负电荷的 疏水表面)应当尤其可用于馨合过量的烷基阳离子。可W包括另一表面组成的固体W馨合 样品的其它组分。
[0063] 在一些实施方案中，所公开的方法可W与一种或多种纯化方法整合，所述纯化方 法包括但不限于蛋白A和其它形式的生物亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏 水相互作用色谱、固定化金属亲和色谱、径憐灰石或其它混合模式的色谱、和/或非色谱方 法如沉淀和液-液萃取。研发用于各种方法的适当条件并且将它们与本文所公开的方法整 合W实现特定抗体的必要纯化，在本领域普通技术人员的能力范围内。
[0064] 实施例
[0065] 实施例1.嫁蜡基S甲基漠化锭(CTAB)相对于依沙叮晚的独立作用。通过离屯、和微 滤来澄清含有约2g/L浓度的IgGl单克隆抗体的细胞培养收获物。聚集物含量是21.2%并且 宿主蛋白质含量是每百万225,906份的IgG。在对照系列的实验中，将澄清收获物的不同等 分试样与0.01 %、〇. 02%和0.05%依沙叮晚混合并且揽拌解育2小时。在另一系列中，W相 同浓度添加 CTABW分离等分试样。通过离屯、去除固体。CTAB将聚集物降低到2.5-2.6%。依 沙叮晚将聚集物降低到1.8-2.0%。然而，一致地观测到依沙叮晚将轻链亚群转化为明显的 轻链二聚物，而CTAB则没有。
[0066] 实施例2.与尿囊素混合、之后与官能化固体接触的CTAB。通过离屯、和微滤来澄清 含有约2g/L浓度的IgGl单克隆抗体的细胞培养收获物。聚集物含量是10.5%并且宿主蛋白 质含量是277，98化pm IgG。添加1 %w/v的量的尿囊素。添加0.05 %的量的CTAB漠化物并且 将所述混合物解育2小时。将聚集物降低到2.5%并且将宿主蛋白质降低到156,00化pm。添 加5%v/v的量的带正电荷的粒子(Bio-Works TREN high)并且混合解育4小时。通过离屯、和 微滤去除固体。将聚集物降低到1.2%并且将宿主蛋白质降低到127,959ppm，IgG回收率为 92%。
[0067] 实施例3.在与实施例2平行并且使用相同的源材料，但其中0.05 % CTAB被0.05 % 亚甲蓝替代的实施例中，将聚集物降低到5.4%，相比之下，CTAB将聚集物降低到2.5%，并 且将宿主蛋白质降低到223,61^pm，相比之下，CTAB将宿主蛋白质降低到156,00化口111。在与 TREN粒子接触之后，亚甲蓝将聚集物降低到1.2%并且将宿主蛋白质降低到94,780。
[0068] 实施例4 .在与实施例2和3平行并且使用相同的源材料，但其中0.05 % CTAB被 0.025%依沙叮晚替代的实施例中，将聚集物降低到3.5%并且将宿主蛋白质降低到174， 210ppm，相比之下，CTAB将聚集物降低到2.5%并且将宿主蛋白质降低到156,002。在与TREN 粒子接触之后，依沙叮晚将聚集物降低到1.2%并且将宿主蛋白质降低到93,424ppm，相比 之下，CTAB将聚集物降低到1.2%并且将宿主蛋白质降低到127,959。
[0069] 实施例5.在使用与实施例2-4相同的源材料，但其中将0.01 % CTAB与0.04 %亚甲 蓝组合的实施例中，将聚集物降低到3.4%并且将宿主蛋白质降低到157,483,相比之下，单 独的CTAB将聚集物降低到2.5%并且将宿主蛋白质降低到156，00化pm。在与TREN粒子接触 之后，所述组合将聚集物降低到1.3%并且将宿主蛋白质降低到88,923ppm，相比之下，单独 的0.05 % CTAB将聚集物降低到1.2 %并且将HCP降低到93，424ppm。
[0070] 实施例6.在使用与实施例2-5相同的源材料，但其中将0.01 %CTAB与0.025%依沙 叮晚组合的实施例中，将聚集物降低到3.2%并且将宿主蛋白质降低到155,788,相比之下， 单独的CTAB将聚集物降低到2.5%并且将宿主蛋白质降低到156,00化pm。在与TREN粒子接 触之后，所述组合将聚集物降低到1.2%并且将宿主蛋白质降低到81，669ppm，相比之下，单 独的0.05 % CTAB将聚集物降低到1.2 %并且将HCP降低到93,424ppm。
[0071] 实施例7.在W如通过如实施例2中所述的0.05%CTAB产生的TREN处理后材料开始 的实施例中，然后使所述样品通过一对深度过滤器(PB1和?(：1，53的^1113)。将聚集物降低 到0.2%，并且将宿主蛋白质降低到31，987ppm。
[0072] 本领域普通技术人员应当理解如何将实验结果如上述实施例中所述的那些按比 例放大或按比例缩小到满足它们的特定要求所需的任何体积。
[0073] 本文所引用的所有参考文献均W引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度 就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被明确地且个别地指明出于所有目的W引用 方式整体并入一样。当W引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公 开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
[0074] 用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解 为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要求 书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明公开的方法试图获得的所需性能而改变。
[0075] 如对本领域技术人员将显而易见的是，可进行本公开的方法的许多更改和变化， 而不脱离其精神和范围。本文所述的具体实施方案仅W举例方式提供，而不意在W任何方 式进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，所公开的方法的真正范围和 精神由所附权利要求书指明。
【主权项】
1. 一种降低包含靶蛋白质的制剂中的聚集物含量的方法，所述方法包括： 使所述制剂与烷基阳离子接触以形成混合物;和 使所述混合物与至少一种官能化固体接触以去除过量的烷基阳离子。2. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括使所述混合物与芳基阳离子接触。3. 根据权利要求2所述的方法，其中所述芳基阳离子是依沙吖啶或亚甲蓝。4. 根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其进一步包括使所述混合物同时或依序与 至少一种正电性固体接触以进一步降低所述制剂的聚集物含量。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述烷基阳离子包括选自由以下组成 的组的季铵阳离子的溴化物盐或氯化物盐：西曲铵、鲸蜡基三甲基铵、N，N，N-三甲基-1 -十 六烷基铵、N，N，N-三甲基-1-十七烷基铵、N，N，N-三甲基-1-十八烷基铵、N，N，N-三甲基-1-十五烷基铵和N，N，N-三甲基-1 -十四烷基铵。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述烷基阳离子以选自由以下组成的 组的浓度范围存在：（a)约0.001 %到约1 % ; (b)约0.01 %到约1 % ;和（c)约0.02 %到约 0.03%〇7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中尿囊素以选自由以下组成的组的浓度 范围存在：（a)约0.6%到约50%; (b)约1 %到约10%;和(c)约1 %到约2%。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中操作电导率处于选自由以下组成的组 的范围：（a)约0· lmS/cm到约50mS/cm; (b)约lmS/cm到约30mS/cm;和(c)约5mS/cm到约 15mS/ cm〇9. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中操作pH值处于选自由以下组成的组的 范围：（a)约4到约10; (b)约5到约9;和约6到约8。10. 根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述混合物进一步包含不为烷基阳离 子的抗病毒剂，所述抗病毒剂选自由以下组成的组:氯己定、苯扎氯铵、亚甲蓝、依沙吖啶和 磷酸三(正丁基)酯。11. 根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述至少一种官能化固体的表面促 进选自由以下组成的组的化学相互作用：静电相互作用、疏水相互作用、氢键合和金属亲 和。12. 根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述至少一种官能化固体是颗粒物。13. 根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述靶蛋白质包括选自由重组蛋白 质、抗体、生长激素和凝血因子组成的组中的一种。14. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂是选自由以下组成 的组中的一种:含细胞的细胞培养收获物、基本上无细胞的细胞培养收获物和部分纯化的 蛋白质。15. -种供方便实施根据权利要求1-14中任一项所述的方法的试剂盒。
【文档编号】C07K1/16GK106061992SQ201480076388
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2014年2月27日
【发明人】彼得·斯坦利·加尼翁
【申请人】新加坡科技研究局