3’,5’?环二腺苷酸包合物及其制造方法
【专利摘要】以往，3',5'?环二腺苷酸仅作为冷冻干燥品来提供，通过本发明得到冷冻干燥品以外的固体以及其制造方法。通过在3',5'?环二腺苷酸水溶液中添加酸，使pH降低至pH1～3的工序，可得到3',5'?环二腺苷酸包合物。该制造方法及其简便，无需特殊的仪器等。
【专利说明】3'，5'-环二腺昔酸包合物及其制造方法 【技术领域】
[0001] 本发明设及作为辅助剂有用的物质3'，5'-环二腺巧酸包合物，W及其制造方法。 【【背景技术】】
[0002] 3'，5'-环二腺巧酸是作为细菌的第二信使被发现的物质。近年来有该物质可诱导 1型干扰素的报道等，作为医药品的利用被受期待(非专利文献1)。 目前，作为3'，5'-环二腺巧酸的制造方法，已知有化学合成法(非专利文献2、3)，或者 利用来源于芽抱杆菌属(Bacillus属)或链球菌属(Streptococcus属)等的二腺巧酸环化酶 的酶合成法(非专利文献4、5)，并W冷冻干燥品的形式被提供。 【现有技术文献】 【非专利文献】
[0003] 【非专利文献 l】Science, 328,1703-1705(2010) 【非专利文献 2】SYNT 肥 SIS，24，4230-4236 (2006) 【非专利文献3】Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,32,1-16(2013) 【非专利文献4】Molecular Cell ,30，167-178(2008) 【非专利文献5】Nagoya J.Med.Sci. ,73,49-57(2011) 【
【发明内容】
】 【发明所要解决的问题】
[0004] W往3'，5'-环二腺巧酸是作为冷冻干燥品被提供的，冷冻干燥品W外的制备品尚 未已知。但是，冷冻干燥品在其制造过程中需要冷冻干燥，为大量生产而扩大规模自然也存 在限制。 因此，本发明的课题在于，在不使用特殊的装置和工序的情况下，提供与冷冻干燥品不 同的崭新的3 '，5 环二腺巧酸的制备品。 【解决问题的技术手段】
[0005] 本发明的发明人等针对与冷冻干燥品不同的3'，5'-环二腺巧酸的制备品进行了 研究。结果新发现，通过在3'，5'-环二腺巧酸水溶液中添加酸使P邮華低至pHl~3运种极其 简便的方法，可制造与冷冻干燥品具有完全不同的物理性质的3 '，5 环二腺巧酸包合物。 【发明的效果】
[0006] 本发明提供一种与W往的冷冻干燥品完全不同的3'，5'-环二腺巧酸包合物。本发 明的包合物是结晶性物质，操作简便(例如，无吸湿性且稳定性、溶解性优异等）。另外，本发 明的3 '，5 环二腺巧酸包合物的制造方法不需要制备所需的特殊装置或者工序，可有效地 大量生产3'，5'-环二腺巧酸。 【【附图说明】】
[0007] 【图1】图1为3'，5'-环二腺巧酸包合物(非结晶性)照片。 【图2】图2为3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品照片。 【图3】图3为3'，5'-环二腺巧酸锭盐的冷冻干燥品照片。 【图4】图4为3'，5'-环二腺巧酸包合物(非结晶性)的热重测定/差示热分析结果。 【图5】图5为3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品的热重测定/差示热分析结果。 【图6】图6为3'，5'-环二腺巧酸锭盐的冷冻干燥品的热重测定/差示热分析结果。 【图7】图7为3'，5'-环二腺巧酸包合物的核磁共振波谱(1?。 【图8】图8为3'，5'-环二腺巧酸包合物的核磁共振波谱(i3C)。 【图9】图9为3'，5'-环二腺巧酸包合物的核磁共振波谱(3中）。 【图10】图10为3 '，5 环二腺巧酸包合物的红外线吸收光谱。 【图11】图11为3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品的红外线吸收光谱。 【图12】图12为3'，5'-环二腺巧酸锭盐的冷冻干燥品的红外线吸收光谱。 【图13】图13为3'，5'-环二腺巧酸包合物(结晶性)照片。 【图14】图14为3'，5'-环二腺巧酸包合物(结晶性)的热重测定/差示热分析结果。 【图15】图15为3'，5'-环二腺巧酸包合物(结晶性)的X射线衍射光谱。 【【具体实施方式】】
[000引本发明提供由W下结构是所示的3'，5'-环二腺巧酸包合物。
[0009] [化学式1]
[0010] 本发明中提到的包合物是指，化合物和溶剂通过弱的相互作用而形成复合体等， 在固化中溶剂起到辅助作用的状态的固体物，对于包合的形态与固体的结构没有限制。特 别是，在本发明中使用水作为溶剂，因此在没有特殊记载的情况下，本发明的包合物是指与 水的包合物。此外，本发明的包合物包括结晶性物质W及非结晶性物质。
[0011] 本发明的3 '，5 环二腺巧酸包合物可通过在3 '，5 环二腺巧酸水溶液中添加酸 使抑降低至抑1~3而得到。
[0012] 为获得本发明的包合物所利用的3'，5'-环二腺巧酸可通过酶合成法或者化学合 成法等已知的方法合成，优选通过酶合成法的合成的物质。在进行酶合成法时，遵循已知的 方法即可，例如，可利用非专利文献4、5中记载的方法。反应后，在反应液中生成的3'，5'-环 二腺巧酸可通过使用了活性炭或者离子交换树脂等的通常的色谱处理法进行分离纯化。
[0013] 为了获得本发明的包合物，在3'，5'-环二腺巧酸水溶液中添加酸，使抑降低至抑1 ~3，优选降低至pHl. 5~2.0即可。作为所使用的酸，可调整到上述pH的酸即可，具体可举例 为，盐酸、硫酸、硝酸等无机酸。此外，为了防止因加酸过快而导致的非结晶化或者结晶急剧 析出，优选缓慢添加。
[0014] 另外，包合物的获得率低时，也可通过对上述包合物的滤液进反复进行数次相同 的处理而再次获得包合物。
[0015] 此外，本发明的包合物可按照含有W下工序的方法获得：（1)在3'，5'-环二腺巧酸 水溶液中添加酸，使抑降低至抑1~3; (2)将该3 '，5 '-环二腺巧酸水溶液加热至50~70°C ; (3)将该3'，5'-环二腺巧酸水溶液冷却至1~10°C。另外，（1)(2)工序、（2)(3)工序可同时进 行。另外，也可按照由W下工序构成的方法获得：（1)在被稀释的3'，5'-环二腺巧酸水溶液 中添加酸，使P啡華低至1~3; (2)将调整pH后的该3'，5'-环二腺巧酸水溶液加热至50~70 °C; (3)将该3'，5'-环二腺巧酸水溶液冷却至1~10°C。为了更可靠地获得包合物，优选缓慢 进行(3)的冷却。具体地，优选在溫度梯度为-3~-irCAr的条件下进行冷却。
[0016] 对于由上述制造方法得到的3'，5'-环二腺巧酸包合物，在过滤后使其在室溫（25 °C)~70°C下干燥1~10小时，即可得到产品。对于本发明的包合物，通过在干燥时的溫度为 室溫(25°C)~40°C的低溫下干燥，可得到结晶性物质，在40~70°C的高溫条件下干燥，可得 到非结晶性物质。具体地，对于本发明的包合物，通过在干燥时的溫度为室溫(25°C)W上~ 小于40°C的低溫下干燥，可得到结晶性物质，在40W上~70°CW下的高溫条件下干燥，可得 到非结晶性物质。另外，对于得到的包合物，可W在过滤后干燥前利用乙醇适当清洗。在干 燥时，可适当地利用减压干燥法。
[0017] 通过运样的方法得到的本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物，在采用高效液相色谱 法进行纯度检验时，具有97% W上，更优选为99% W上的纯度，且具有W下的物理性质。此 夕h下述的物理性质中，没有特别限定的记载的情况下，表示结晶性物质、非结晶性物质双 方共有的性质。
[001引（1)水分含量 对于本发明的3'，5环二腺巧酸包合物，虽然会因干燥程度而有所不同，但通过热重 测定/差示热分析(TG/DTA)装置测定时的水分在3.5~17%的范围内。即，本发明的3'，5'- 环二腺巧酸包合物中，相对于1分子的3'，5'-环二腺巧酸键合或者附着有1~7分子的水分 子，更具体地，键合或者附着有1.1~6.1分子的水分子。
[0019] (2)热分析 本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物通过热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升溫速 度5°C/分钟)进行分析时，包合物为结晶性物质时在193°C附近具有吸热峰，为非结晶性物 质时在220°C附近具有吸热峰。
[0020] (3)形状 本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物的形状呈针状。
[0021] (4)红外线吸收光谱 本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物（非结晶性）在测定红外线吸收光谱时，在3087、 1686、1604、1504、1473、1415、1328、1213(cm-i)附近具有特征峰。
[0022] 此外，在红外线吸收光谱测定中，一般存在包含小于2(cnfi)的误差范围的情况，因 此除了上述数值与红外线吸收光谱的峰位置完全一致的包合物W外，峰值在小于2cnfi的误 差内一致的包合物也包括在本发明的3 '，5 环二腺巧酸包合物中。例如，在测定红外线吸 收光谱时，在 3087±1.9、1686±1.9、1604±1.9、1504±1.9、1473±1.9、1415±1.9、1328± 1.9、1213±1.9(cnfi)具有特征峰。
[0023] (5)粉末X射线分析 特别是，本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物为结晶性物质时，本发明的包合物在粉末X 射线分析中具有特征峰。例如，采用使用了 Cu-Ka射线的粉末X射线衍射装置对本发明的包 合物进行分析时，如后述实施例所示，在衍射角（20)9.2、10.2、10.9、11.1、13.7、15.2、 19.0、20.6、22.4、23.1、24.3、26.6、26.8(°)附近、其中特别是衍射角（2目）9.2、15.2、19.0、 20.6、26.8 n附近具有特征峰。
[0024] 此外，通常粉末X射线衍射的衍射角（20)存在包含小于5%的误差范围的情况，因 此，除了粉末X射线衍射中的峰的衍射角完全一致的包合物W外，峰的衍射角在小于5%的 误差内一致的包合物也包括在本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物中。例如，在粉末X射线衍 射中，在衍射角(2目)9.2±0.45、10.2±0.50、10.9±0.54、11.1±0.55、13.7±0.68、15.2± 0.75、19.0±0.94、20.6±1.02、22.4±1.11、23.1±1.15、24.3±1.21、26.6±1.32、26.8± 1.33(° )，特别是，衍射角（2目）9.2±0.45、15.2±0.75、19.0±0.94、20.6±1.02、26.8± 1.33(°)具有特征峰。 包合物为非结晶性物质时，在粉末X射线衍射中不出现明显的峰。 【实施例】
[0025] W下通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限定于此。 (实施例1)3'，5'-环二腺巧酸包合物(非结晶性)的制造 按照公知方法合成3 '，5 环二腺巧酸，进行纯化。 将纯化得到的0D257为709的3'，5'-环二腺巧酸溶液（141mL)用水稀释成0D化7为20。边 揽拌边缓慢添加1N的盐酸溶液，将pH调至P化.8。结果，水溶液中析出白色固体。
[0026] 为了更有效率地得到包合物，利用程控培养器将该溶液加热至60°C。之后，在溫度 梯度-4°CAr条件下，冷却至液溫为呈4°C。将析出物利用玻璃过滤器(17G3)过滤，得到白色 固体。将该白色固体在60°C下干燥6小时，得到了包合物(非结晶性)2.169g。
[0027] (参考例)3'，5'-环二腺巧酸的冷冻干燥品的制造 将1 g酶合成的3 '，5 ' -环二腺巧酸在20mL的水中悬浮后，用1N化0H溶液将pH调成 抑7.0，或者用5 %氨水调成抑7.4，溶解悬浮的3 '，5 环二腺巧酸。 将溶解得到的3'，5'-环二腺巧酸溶液用水进一步稀释成35mL，利用冷冻干燥机进行冷 冻干燥，得到了 3 '，5 环二腺巧酸钢盐或者锭盐的冷冻干燥品。
[002引（实施例2)3'，5'-环二腺巧酸包合物(非结晶性)的物理性质 对上述实施例1中制备的3'，5环二腺巧酸包合物进行仪器分析，结果如下所示。 (仪器分析） (A)纯度检验 采用高效液相色谱法分析实施例1中得到的3'，5'-环二腺巧酸包合物的纯度。结果， 3'，5'-环二腺巧酸的纯度为99.8%。另外，高效液相色谱法是在W下条件下进行的。 (条件） 柱:Hy化OS曲ere C18(YMC社制） 洗脱液:0.1M TEA-P(p册.0) 检测方法:在UV260nm下检测 [0029] (B)形状 3'，5'-环二腺巧酸包合物的代表性照片示于图1。如图1所示，3'，5'-环二腺巧酸包合 物的形状为针状。 另外，3'，5'-环二腺巧酸钢盐W及3'，5'-环二腺巧酸锭盐的冷冻干燥品的照片如图2、 3所示，形状与包合物完全不同。
[0030] (C)水分 利用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升溫速度5X7分钟)进行分析，对于本发明 的3 '，5 环二腺巧酸包合物中的水分，再干燥前的包合物为8.7~9.5%，采用100°C减压干 燥进行再干燥后的包合物为3.5~3.6%，将再干燥的包合物在室溫、湿度40~50%下放置 一晚后的包合物为10.3 %，将再干燥的包合物在溫度30°C、湿度70 %下放置一晚后的包合 物为15.0%，在20°C下进行2小时真空干燥的包合物为17.0%。 良P，通过计算可知，根据干燥程度，本发明的3'，5环二腺巧酸包合物中，相对于1分子 的3'，5'-环二腺巧酸分别键合或者附着有1.1~6.1分子的水分子。
[0031] 此外，对3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品、3'，5'-环二腺巧酸锭盐的冷冻干 燥品同样进行热重测定，对于再干燥前的测定值，钢盐的冷冻干燥品含有16~17%的水分、 锭盐的冷冻干燥品含有13~15%的水分。
[0032] (D)差示扫描量热分析 利用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升溫速度5X7分钟)进行分析，本发明的3'， 5 '-环二腺巧酸包合物在220°C附近显示有特征的吸热峰（图4)。 与此相对，3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品在267°C附近显示吸热峰（图5)、锭盐 的冷冻干燥品在228~229°C附近显示吸热峰（图6)。
[0033] (E)核磁共振波谱 在本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物中添加6N NaO田容液化L使之溶解，利用重水稀释 至浓度为6mg/0.6ml，进行核磁共振光谱测定(1山1化、3中）。将测定结果分别示于图7~9。
[0034] 结果，本发明的3 '，5 ' -环二腺巧酸包合物在1h时于8.37、7.96、6.08、4.98-5.02、 4.86、4.51-4.55、4.17 (邮 m)附近具有峰。另外，在"C 时于157.9、155.4、150.0、141.6、 121.3、93.1、82.8、76.7、73.3、65.2(99111)附近具有峰。在3中时，于-0.91(99111)附近具有峰。
[0035] (F)红外线吸收光谱 对本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物、3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品、3'，5'- 环二腺巧酸锭盐的冷冻干燥品，利用傅立叶变换红外分光光度计Spectrum One (Perkin Elmer)，采用ATR(Attenuated Total Ref lec1:ance，衰减全反射)法测定红外线吸收光谱。
[0036] 将各个包合物中观察到的峰（cnfi)值示于表1。另外，将本发明的3'，5'-环二腺巧 酸包合物、3'，5'-环二腺巧酸钢盐的冷冻干燥品、3'，5'-环二腺巧酸锭盐的红外线吸收光 谱分别示于图10~12。
[0037] 结果，本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物在3087、1686、1604、1504、1473、1415、 1328、1213 (cnfi)附近具有特征峰。
[003引【表1】
[0039] (G)粉末X射线衍射 对本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物，在下述的测定条件下测定X射线衍射光谱。
[0040] (测定条件） 革己:化 X射线管电流:40mA X射线管电压:45kV 扫描范围：20 = 4.0~40.0。 预处理:利用玛瑶制研鉢粉碎
[0041] 测定结果，在X射线衍射光谱的图形中未观察到明显的峰，表明本包合物为非结晶 性。
[0042] (实施例3)
[1 ] 3 '，5 ' -环二腺巧酸包合物的制造（1) 通过已知的方法利用酶合成3'，5'-环二腺巧酸，进行纯化。将纯化得到的0D257为473 的3'，5'-环二腺巧酸溶液(280mL)用水稀释至0D257为40。边揽拌边添加2N盐酸溶液，将pH 调至P化.8。结果，水溶液中析出白色固体。
[0043] 为了更有效率地获得包合物，利用程控培养器将该溶液加热至50°C。之后，在溫度 梯度-3°C/hr下，冷却至液溫为4°C，使固体析出。将析出物通过玻璃过滤器（17G3)过滤，得 到白色固体。将该白色固体在室溫下真空干燥，得到3'，5'-环二腺巧酸包合物。
[0044] [2]3'，5'-环二腺巧酸包合物的制造(2) 通过已知的方法利用酶合成3'，5'-环二腺巧酸，进行纯化。将纯化得到的0D257为758 的3'，5'-环二腺巧酸溶液(400mL)用水稀释至0D257为40。为了更有效率地获得包合物，利 用程控培养器将该溶液加热至50°C，边揽拌边添加2N盐酸溶液，将抑调至P化.8。
[0045] 之后，在溫度梯度-4/hr下冷却至液溫为4°C，使固体析出。将析出物通过玻璃过滤 器（17G3)过滤，得到白色固体。将该白色固体在室溫下真空干燥，得到3'，5'-环二腺巧酸包 合物8.5g。
[0046] (实施例4)3'，5'-环二腺巧酸包合物(结晶性)的物理性质 化)形状 将上述实施例3中制备的3'，5'-环二腺巧酸包合物(结晶性)照片示于图13。如图13所 示，3 '，5 环二腺巧酸包合物(结晶性)的形状为针状。 (I) 差示扫描量热分析 利用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升溫速度5X7分钟)进行分析，本发明的3'， 5'-环二腺巧酸包合物在193°C附近显示有特征的吸热峰（图14)。 (J) 水分 利用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升溫速度fTC/分钟)进行分析，将本发明的 3'，5'-环二腺巧酸包合物中的水分在溫度20°C的条件下真空干燥2小时后的水分含量为 17.0%。
[0047] (K)粉末X射线衍射 按照与(G)相同的测定条件对本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物测定X射线衍光谱。 [004引结果，如图15W及表2所示，本发明的3'，5'-环二腺巧酸包合物在衍射角(20)9.2、 10.2、10.9、11.1、13.7、15.2、19.0、20.6、22.4、23.1、24.3、26.6、26.8(°)附近显示特征峰。 [0049]另外，从X射线衍射光谱的图形中判断出，本实施例中得到的3'，5'-环二腺巧酸包 合物为结晶性物质。 「00501 r^9l Luud i J u;乳殷僧避
利用高效液相色谱法分析3'，5'-环二腺巧酸包合物(结晶性)的纯度。结果，3'，5'-环 二腺巧酸的纯度为99.7%。另外，高效液相色谱法的条件与实施例1相同。
【主权项】
1. 一种3'，5'_环二腺苷酸包合物的制造方法，其特征在于，包括以下工序： 在3 '，5 环二腺苷酸的水溶液中添加酸，使pH降低至pHl~3。2. -种3'，5'_环二腺苷酸包合物的制造方法，其特征在于，包括以下（1)~(3)的工序： (1) 在3 '，5 ' -环二腺苷酸水溶液中添加酸，使pH降低至pHl~3; (2) 将3 '，5 环二腺苷酸水溶液加热至50~70°C ;以及 (3) 将3 '，5 ' -环二腺苷酸冷却至1~10 °C。3. -种3 '，5 环二腺苷酸包合物，其特征在于，相对于1分子的3 '，5 环二腺苷酸，键 合或者附着有1~7分子的水分子。4. 如权利要求3所述的3 '，5 环二腺苷酸包合物，其特征在于，高效液相色谱中的纯度 为97%以上。5. 如权利要求3或4所述的3 '，5 环二腺苷酸包合物，其特征在于，高效液相色谱中的 纯度为99%以上。6. 如权利要求3至5中任一项所述的3 '，5 环二腺苷酸包合物，其特征在于，所述包合 物为结晶。7. 如权利要求6所述的3 '，5 环二腺苷酸包合物，其特征在于，在粉末X射线分析中，在 衍射角2Θ为9.2°、15.2°、19.0°、20.6°、26.8°附近显示有特征峰。
【文档编号】C07H1/00GK106061989SQ201580012339
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年3月12日 公开号201580012339.6, CN 106061989 A, CN 106061989A, CN 201580012339, CN-A-106061989, CN106061989 A, CN106061989A, CN201580012339, CN201580012339.6, PCT/2015/57386, PCT/JP/15/057386, PCT/JP/15/57386, PCT/JP/2015/057386, PCT/JP/2015/57386, PCT/JP15/057386, PCT/JP15/57386, PCT/JP15057386, PCT/JP1557386, PCT/JP2015/057386, PCT/JP2015/57386, PCT/JP2015057386, PCT/JP201557386
【发明人】田中寿基, 石毛和也
【申请人】雅玛山酱油株式会社