结晶性3’,5’?环二鸟苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供不含有钴或者镁等金属盐的3’,5’?环二鸟苷酸的游离酸结晶。另外，探索可简便且大量地获取该结晶的方法。通过包括在3’,5’?环二鸟苷酸水溶液中添加酸使pH降低至pH1～3的工序的制造方法，可以简便且大量地获取3’,5’?环二鸟苷酸结晶。该结晶是不含有钴或镁等金属盐的游离酸结晶。
【专利说明】结晶性3'，5'-环二鸟昔酸 【技术领域】
[0001] 本发明设及作为辅助剂有用的物质3'，5'-环二鸟巧酸的结晶W及该结晶的制造 方法。 【【背景技术】】
[0002] 3'，5'-环二鸟巧酸是参与细菌的生物膜形成的信号传达物质，近年来作为辅助 剂、抗病毒剂、抗癌剂的应用被受期待(非专利文献1)。至今，作为3'，5'-环二鸟巧酸的制造 方法，例如已知利用来源于Geobacillus属的二鸟甘酸环化酶的、基于酶的合成方法(专利 文献1)。 另外，W往，3 '，5 环二鸟巧酸是作为冷冻干燥品或者与钻或儀的金属盐的共晶而得 到的(非专利文献2、3)。 【现有技术文献】 【专利文献】
[0003] 【专利文献1】W02013-129427号 【非专利文献】
[0004] 【非专利文献 1】化 ccine，28,3080-3085(2010) 【非专利文献 2】Proc. Natl. Acad. Sci. USA ,87,3235-3239 (1990) 【非专利文献3】阳BS Letters，264，223-227(1990) 【
【发明内容】
】 【发明要解决的问题】
[0005] 现有的3'，5'-环二鸟巧酸是作为含有钻等的金属盐的共晶而提供的，在将该结晶 应用到医药品原料等领域时，有可能发生安全性等的问题。但是，对于不含有运些金属盐的 3'，5'-环二鸟巧酸的游离酸结晶，包括其获取方法在内至今仍为未知。另外，现有的结晶获 取方法都是利用蒸汽扩散法，因此，不适合在短时间内获取大量的结晶，因此能简便且大量 获取的方法的开发一直被人们所期待。 【用于解决问题的方案】
[0006] 本发明人对3'，5'-环二鸟巧酸的结晶化进行了深入研究，首次得到了3'，5'-环二 鸟巧酸的游离酸结晶。
[0007] 另外，对于该结晶的制造方法，还发现了，能够W在3'，5'-环二鸟巧酸的水溶液中 添加酸使抑降低至pHl~3运样的、与现有的金属盐共晶的制造方法相比极其简便的工序进 行制造。 【发明效果】
[000引通过本发明方法得到的3'，5'-环二鸟巧酸结晶显示出不逊色于现有结晶的稳定 性，且不含多余的金属离子，因此在各种用途中容易操作，作为医药品原料等也很实用。 【【附图说明】】
[0009] 【图1】图1为3'，5'-环二鸟巧酸结晶的结晶照片。 【图2】图2为3'，5'-环二鸟巧酸的儀共晶的结晶照片。 【图3】图3为3'，5'-环二鸟巧酸的钻共晶的结晶照片。 【图4】图4为3'，5'-环二鸟巧酸结晶的热重测定/差示热分析结果。 【图5】图5为3'，5'-环二鸟巧酸的儀共晶的热重测定/差示热分析结果。 【图6】图6为3'，5'-环二鸟巧酸的钻共晶的热重测定/差示热分析结果。 【图7】图7为3'，5'-环二鸟巧酸结晶的红外线吸收光谱。 【图8】图8为3'，5'-环二鸟巧酸的儀共晶的红外线吸收光谱。 【图9】图9为3'，5'-环二鸟巧酸的钻共晶的红外线吸收光谱。 【图10】图10为3'，5'-环二鸟巧酸结晶的X射线衍射光谱。 【图11】图11为3'，5'-环二鸟巧酸的儀共晶的X射线衍射光谱。 【图12】图12为3'，5'-环二鸟巧酸的钻共晶的X射线衍射光谱。 【【具体实施方式】】
[0010] 本发明提供由W下结构式所示的3'，5'-环二鸟巧酸的结晶。
[00川【化学式1】
[0012] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶是在结晶化工序中完全不利用钻或儀等金属而 得到的不含金属盐的游离酸结晶。此外，在本发明中的"3'，5'-环二鸟巧酸结晶"在没有特 别限定的情况下，是指该不含金属盐的游离酸结晶。
[0013] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶在通过高效液相色谱法进行纯度测试时，具有 97% W上、更优选99% W上的纯度。
[0014] 针对本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶利用卡尔费休法测定时的水分为9.3~ 13.9%。即，本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶中，相对于1分子的3'，5'-环二鸟巧酸键合或 者附着有4~6分子、更详细而言3.9~6.2分子的水分子。
[0015] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶在使用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升 溫速度5 °C/分钟）进行分析时，在213~217 °C具有吸热峰。该溫度比公知的与金属的共晶 低。
[0016] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶作为立方体结晶而得到。相对于此，已知的与金 属的共晶为六角板状或者双四角锥结晶，本发明的结晶和已知的与金属的共晶在其结构上 有差异。
[0017] 在对本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶测定红外线吸收光谱时，在3136、1712、 1637、1601、1530、1470、1386、1339 (cnfi)附近具有特征峰。
[0018] 另外，在红外线吸收光谱测定中，一般包含小于2(cm-i)的误差范围，因此，除了上 述数值与红外线吸收光谱的峰位置完全一致的结晶W外，峰值在小于2cnfi的误差内一致的 结晶也包括在本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶中。例如，在测定红外线吸收光谱时，在3163 ±1.9、1712±1.9、1637±1.9、1601±1.9、1530±1.9、1470±1.9、1386±1.9、1339±1.9 (cnfi)具有特征峰。
[0019] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶在粉末X射线分析中具有特征峰，例如对本发明 的结晶采用使用了 Cu-Ka射线的粉末X射线衍射装置进行分析时，如后述实施例所示，衍射 角（2 目）在8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0、27.7(°)附近显示 特征峰(参照图10)。
[0020] 此外，一般粉末X射线衍射的衍射角（20)有时包括小于5%的误差范围，因此，除了 粉末X射线衍射中的峰的衍射角完全一致的结晶W外，峰的衍射角在小于5%的误差内一致 的结晶也包括在本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶中。例如在粉末X射线衍射中，衍射角(20) 在 8.1±0.4、8.3±0.4、10.8±0.5、11.8±0.5、16.9±0.8、19.1±0.9、19.5±0.9、22.4± 0.1、25.0±1.2、26.7±1.3、27.0±1.3、27.7±0.3(°)具有特征峰。
[0021] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶在装有饱和食盐水的干燥器中，W50°C保存167 天时的高效液相色谱测定值的纯度降低率低于1%，是稳定性极高的结晶。
[0022] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶可通过在3'，5'-环二鸟巧酸的水溶液中添加酸 使抑降低至抑1~3而得到。
[0023] 用于结晶化的3'，5'-环二鸟巧酸通过酶合成法或者化学合成法等公知的方法合 成即可，但优选通过酶合成法合成。进行酶合成法时可W按照已知的方法进行，例如可利用 专利文献1记载的方法。反应后，在反应液中生成的3'，5'-环二鸟巧酸可通过使用了活性炭 或者离子交换树脂等的通常的色谱处理法进行分离纯化。
[0024] 结晶化时，在3'，5'-环二鸟巧酸的水溶液中添加酸使P邮華低至P化~3,优选降低 至pHl.5~2.0。作为使用的酸，可举出盐酸、硫酸、硝酸等。为了防止因急速加入酸而导致的 非结晶化或者结晶急剧析出，优选缓慢添加。另外，结晶的获得产量低时，可通过从上述结 晶的滤液实施上述析晶处理来回收第二晶体。
[0025] 另外，结晶化可按照由W下工序构成的方法进行：（1)将分离纯化得到的3'，5'-环 二鸟巧酸的水溶液加热至50~70°C的工序；（2)在该溶液中添加酸使P啡華低至P化~3，优选 降低至抑1.5~2.0的工序；W及(3)将该溶液冷却至1~10°C，优选冷却至4~8°C的工序。为 了更可靠地使结晶析出，优选缓慢进行（3)的冷却工序。具体地，优选W溫度梯度-3~-11 °C/虹进行冷却。此外，（1)和(2)工序、（2)和(3)工序可同时进行。
[00%]由上述制造方法得到的3'，5'-环二鸟巧酸结晶可通过在过滤后^30~70°(：干燥1 ~10小时而得到产品。在干燥时，可适当地利用减压干燥等方法。 【实施例】
[0027] W下通过实施例具体地说明本发明，但本发明并不限定于此。 (实施例1)3'，5'-环二鸟巧酸结晶的制造 按照公知方法(专利文献1)，利用酶合成法来合成3'，5'-环二鸟巧酸，进行纯化。 将纯化得到的59.9mM的3'，5'-环二鸟巧酸溶液(191ml)在培养器中加溫至60°C，用2小 时边揽拌边添加1N的盐酸溶液27.5ml，使抑达到抑1.9。
[00%]添加盐酸溶液后，利用程控培养器在溫度梯度-7°C/hr下将溶度冷却至5°C使结晶 析出。运样析出的结晶利用玻璃过滤器（17G3)过滤，得到湿结晶。湿结晶在30°C下干燥9小 时，得到干燥结晶8.095g。
[0029] (参考例)3'，5'-环二鸟巧酸金属共晶的制造 参考非专利文献2、3的记载，按如下方式得到了3'，5'-环二鸟巧酸与儀或者钻的共晶。 (参考例1)3'，5'-环二鸟巧酸与儀的共晶 制备结晶化开始液(2mM3'，5'-环二鸟巧酸、20mMMgCl2、20mMglycine-HCl(p肥.l)、 7%(v/v)2-MPD)500mL〇 将该结晶化开始液在55°C下加热，在蒸发器中浓缩，在观察到白浊的时刻再次添加溶 剂至500mL，在55 °C加热30分钟使之完全溶解。对其进行再浓缩，将净化产物在25 °C静置一 晚后，观察到六角平板状结晶的析出，利用蒸汽扩散法充分培养结晶，得到与儀的共晶。
[0030] (参考例2)3'，5'-环二鸟巧酸与钻的共晶 制备结晶化开始液(2mM3'，5'-环二鸟巧酸、llmMCoCl2、20mMglycine-HCl(p肥.l)、 7%(v/v)2-MPD)500ml〇 将该结晶化开始液在55°C下加热，在蒸发器中浓缩后，在25°C静置一晚，观察到双四角 锥结晶的析出，利用蒸汽扩散法进行结晶培养。蒸汽扩散法中，在密闭容器(TLC展开槽）中 添加800mL的50%的2-MPD(水:MPD = 1:1)，将两个烧杯静置6个月，得到与钻的共晶。
[0031] (实施例2)3'，5'-环二鸟巧酸结晶的物理性质 针对上述实施例1中制备的3'，5'-环二鸟巧酸结晶实施的仪器分析结果如下所示。
[0032] (仪器分析） (A)纯度检验 采用高效液相色谱法分析实施例1中得到的3'，5'-环二鸟巧酸结晶的纯度，结果为3'， 5'-环二鸟巧酸的纯度为99.0%。另外，高效液相色谱法是在W下条件下进行的。 (条件） 柱:Hy化OS曲ere C18(YMC社制） 洗脱液:0.1M TEA-P(p册.0) 检测方法:在UV260nm下检测
[0033] (B)结晶形状 将实施例1中制备的3'，5'-环二鸟巧酸结晶，W及参考例中制备的3'，5'-环二鸟巧酸 与儀的共晶和与钻的共晶的代表性照片示于图1~3。如图1所示，本发明的3'，5'-环二鸟巧 酸的结晶为立方体结晶，而图2和3所示的与儀的共晶为六角平板状结晶，与钻的共晶为双 四角锥结晶，本发明的结晶显示出与现有结晶完全不同的结晶形状。
[0034] (C)水分 对实施例1中制备的3'，5'-环二鸟巧酸结晶，利用卡尔费休法测定结晶的水分含量，结 果为水分含量为9.3~13.9%。即，明确了本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶中，相对于1分子 的3'，5环二鸟巧酸键合或者附着有约4~6分子、更具体而言3.9~6.2分子的水分子。
[0035] (D)差示扫描量热分析 利用热重测定/差示热分析(TG/DTA)装置(升溫速度fTC/分钟)进行分析，结果为本发 明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶在213~217°C显示特征吸热峰（图4)。相对于此，3'，5'-环二鸟 巧酸与儀的共晶在22rC附近、与钻的共晶在239°C附近显示特征吸热峰(分别为图5、6)。
[0036] (E)红外线吸收光谱 对本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶，W及参考例的3'，5'-环二鸟巧酸与儀的共晶和 3'，5'-环二鸟巧酸与钻的共晶，利用傅立叶变换红外分光光度计Spectrum One(Perkin Elmer)，采用ATR(Attenuated Total Ref lec1:ance，衰减全反射)法测定红外线吸收光谱。
[0037] 将对各结晶观察到的特征峰(cnfi)的值示于表1。另外，将本发明的3'，5'-环二鸟 巧酸结晶，W及参考例的3'，5'-环二鸟巧酸儀共晶和3'，5'-环二鸟巧酸钻共晶的红外线吸 收光谱分别示于图7、图8、图9。
[0038] 本发明的3'，5'-环二鸟巧酸的结晶在3163、1712、1637、1601、1530、1470、1386、 1339(cm-i)附近具有特征峰。相对于此，与儀的共晶在3226、1702、1634、1597、1531、1477、 1345km-i)附近具有特征峰，与钻的共晶在3179、1638、1576、1534、1487、1383(cm-i)附近具 有特征峰。将其结果示于表1。
[0039] 【表1】
[0040] (F)粉末X射线衍射 对本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶，W及参考例的3'，5'-环二鸟巧酸与钻的共晶和 3'，5'-环二鸟巧酸与儀的共晶，利用乂射线衍射装置乂'？6刊？1?0 1?0(596(3*'18 0〇.， Ltd.)，在W下测定条件下测定X射线衍射光谱。
[0041] (测定条件） 革己:化 X射线管电流:40mA X射线管电压:45kV 扫描范围：20 = 4.0~40.0。 预处理:利用玛瑶制研鉢粉碎
[0042] 如图10和表2所示，本发明的3 '，5 环二鸟巧酸结晶在衍射角（20)为8.1、8.3、 10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0.27.7(°)附近显示特征峰。另外，作为 比较数据将3'，5'-环二鸟巧酸儀共晶的结果示于图11和表3,将3'，5'-环二鸟巧酸钻共晶 的结果示于图12和表4。
[00创【表2】
[0044]【表3】
[00例【表4】
[0046] (G)稳定性 将本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶，W及参考例的与钻的共晶和与儀的共晶放入装有 饱和食盐水的干燥器中在50°C下保存，分别在保存开始后第0、7、31、84、167天后测定HPLC 纯度。将HPLC纯度（％)的测定结果示于下述表5,另外，将第0天测定的HPLC纯度视为100% 时各测定日相对于开始保存时的残存率（％ )示于表6。
[0047] 结果为本发明的3'，5'-环二鸟巧酸在50°C下保存167天时的HPLC纯度降低率低于 1%，表明稳定性极高。该值明确地说明了本发明的3'，5'-环二鸟巧酸结晶不逊色于现有的 与金属的共晶，可W实际应用。
[004引【表5】
【主权项】
1. 一种3'，5'_环二鸟苷酸结晶。2. 如权利要求1所述的结晶，其特征在于，利用高效液相色谱测定时具有97%以上的纯 度。3. 如权利要求1或2所述的结晶，其特征在于，利用高效液相色谱测定时具有99%以上 的纯度。4. 如权利要求1至3中任一项所述的结晶，其特征在于，相对于一分子的3'，5'_环二鸟 苷酸，键合或者附着有约4~6分子的水分子。5. 如权利要求1至4中任一项所述的结晶，其特征在于，利用热重测定/差示热分析装 置，即TG/DTA装置测定时，在213~217°C显示吸热峰。6. 如权利要求1至5中任一项所述的结晶，其特征在于，测定红外线吸收光谱时，在 3136、1712、1637、16015 1530^470^3865 13390^1 附近具有特征峰。7. 如权利要求1至6中任一项所述的结晶，其特征在于，在粉末X射线分析中，在衍射角2 Θ 为8.1、8.3、10.8、11.8、16.9、19.1、19.5、22.4、25.0、26.7、27.0、27.7°附近具有特征峰。8. -种3'，5'_环二鸟苷酸结晶的制造方法，其特征在于，包括在3'，5'_环二鸟苷酸水 溶液中添加酸使pH降低至pHl~3的工序。9. 一种3'，5'_环二鸟苷酸结晶的制造方法，其特征在于，包括以下（1)~(3)的工序： (1) 将3 '，5 环二鸟苷酸水溶液加热至50~70 °C的工序； (2) 在3'，5'_环二鸟苷酸溶液中添加酸使pH降低至pHl~3的工序；以及 (3) 将3 '，5 ' -环二鸟苷酸溶液冷却至1~10°C的工序。
【文档编号】C07H19/213GK106061988SQ201580010888
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2015年2月27日
【发明人】田中寿基, 石毛和也
【申请人】雅玛山酱油株式会社