专利名称：一种合成利那洛肽的方法
技术领域：
本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成利那洛肽的方法。
背景技术：
利那洛肽(Linaclotide)是一种新型GC-C (肠上皮细胞尿苷酸环化酶C)受体激动剂，该化合物为14个氨基酸组成的多肽，通过固相合成技术得到。利那洛肽可激活肠上皮细胞顶端表面的GC-C受体，导致细胞内和细胞外环鸟苷酸增多。其净效应是氯和碳酸氢盐分泌进入肠腔增加，进而导致液体分泌增多以及大便通过加速，用于治疗成人慢传输型便秘和便秘型肠易激综合征(IBS-C)患者，结构序列为NH2-Cys-Cys-Glu-Tyr-Cys-Cys-Asn-Pro-Ala-Cys-Thr-Gly-Cys-Tyr-COOH (3 对 二硫键为 1-6、2-10、5-13)。关于利那洛肽的制备方法，国内外均没有专利报道，仅有Miriam等人发表一篇文献尝试了利那洛妝的合成(Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of theCysteine-Rich Pertide Linaclotide, Published online 4 August 2010 in WileyOnline Library)。文献中分别采用了三种方法进行合成(I)采用Trt为Cys保护基固相合成线性粗肽，然后在液相中室温一步氧化得到利那洛肽；(2)分别采用Trt，Acm为Cys保护基固相合成线性粗肽，然后采用半选择性策略完成二硫键的合成；(3)分别采用Mmt，Acm, Trt或Acm, Trt, pMeOBzlm为Cys保护基固相合成线性粗肽,然后采用完全选择性策略完成二硫键的合成。但是，方法2、3使用了多种侧链脱除和氧化试剂，每一个步骤必然带来杂质的增多，因此不利于得到高纯度，高收率的产物，也不利于工艺的放大。方法I虽然过程步骤简单，只使用了一种保护基保护半胱氨酸侧链巯基，但是半胱氨酸侧链保护基的选择是影响利那洛肽合成的关键因素之一，方法I选用的Trt保护基不利于利那洛肽线性粗肽纯度的提高，造成线性粗肽纯度较低，往往需要纯化才能进行利那洛肽3对二硫键的环化，不利于大规模生产。此外，方法I在最后一步的氧化形成利那洛肽粗品过程中，采用GSH (还原性谷胱甘肽)氧化体系进行3对二硫键的环化，但是该氧化体系不能准确定位3对二硫键的位置，极易造成大量杂质的产生，造成利那洛肽粗品纯度较低，不利于后续的纯化和总收率。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成利那洛肽的方法，使得本发明所述方法能够提高利那洛肽线性粗肽纯度以及利那洛肽粗品纯度和总收率。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案一种合成利那洛肽的方法，包括以下步骤步骤I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树脂，所述Cys侧链上偶联的保护基为Mmt保护基；
步骤2、利那洛肽树脂裂解脱除所有保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化体系对利那洛肽线性粗肽进行氧化反应，按照其N端到C端的氨基酸顺序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫键、第2位Cys和第10位Cys的二硫键以及第5位Cys和第13位Cys的二硫键得到利那洛肽粗品，纯化后即得利那洛肽。其中，所述树脂固相载体优选为王树脂，更优选为替代度为I. Ommol/g的王树脂。GSH/GSSH氧化体系所指为还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化性谷胱甘肽(GSSH)联合使用的氧化体系。本发明采用一步氧化方法制备利那洛肽，避免了不同氧化方法带来的杂质。同时，本发明采用Mmt作为Cys的侧链保护基团能够极大的提高线性粗肽的纯度，使线性粗肽不经过纯化直接应用于下一步的氧化过程中。而且，采用GSH/GSSH体系能够极大的降低线性粗肽中的杂质，有利于下一步纯化过程。在本发明所述方法中，以利那洛肽线性主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式 NH2-Cysl-Cys2-Glu3-Tyr4-Cys5-Cys6-Asn7-Pro8-Ala9-Cysi0-Thrll-Gly12-Cys13-Tyr14-C00HSEQ ID NO: I所示氨基酸序列即为上式中多肽序列，本发明在步骤I中固相合成的利那洛肽树脂是在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列基础上，在其N端、、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体。本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、羧基、巯基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基、巯基等在制备目标产物过程中发生反应，生成杂质。对于利那洛肽的合成，其Cys侧链保护基的选择关系着利那洛肽线性粗肽的纯度，保护基随意的选择有可能造成利那洛肽线性粗肽的纯度较低，如文献“Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide,Published online 4 August 2010 in Wiley Online Library” 中公开的第一种方法，按照其记载的方法，所得到的利那洛肽线性粗肽的纯度仅为40%左右，可见要提高利那洛肽线性粗肽纯度，需要在深入研究利那洛肽合成的基础上，付出创造性劳动，方可找到合适的Cys侧链保护基。而对于其余需要保护侧链的氨基酸，本发明优选通过Trt保护基保护Asn的侧链；通过OtBu保护基保护Glu的侧链；通过tBu保护基保护Tyr、Thr的侧链。作为优选方案，步骤I具体为在活化体系存在下，将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu)-0H)与树脂固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Tyr (tBu)-树脂固相载体，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Thr (Fmoc-Thr (tBu)-0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶联有 Fmoc 保护基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶联有Fmoc保护基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)进行延伸偶联，偶联完后脱除Fmoc保护基，得到利那洛肽树脂(H-Cys(Mmt)-Cys (Mmt)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Cys (Mmt)-Cys (Mmt)-Asn (Trt)-Pro-Ala-Cys(Mmt) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Mmt) -Tyr (tBu)-树脂固相载体)。在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，所述延伸偶联是指在第一个氨基酸与固相载体偶联后，剩余氨基酸按照各自序列的顺序逐个和前一个偶联的氨基酸发生缩合反应(主链氨基和羧基的缩合反应)进行偶联。在延伸偶联中，由于每个氨基酸N端都有保护基，因此需要先脱除N端保护基再偶联，这对本领域技术人员来说是公知常识，本发明优选用DBLK脱除N端保护基。在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，进一步优选，所述H-Tyr (tBu)-树脂固相载体替代度为O. 4-0. 62mmol/g,最优选为O. 5mmol/g。 在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，进一步优选，所述活化体系为HOBt/DMAP/DIP⑶I三体系活化体系或HOBt/DIP⑶I双体系活化体系。对于这些多体系的活化体系，其各组分的配比在本领域中是一定的且是公知的，如HOBt/DMAP/DIPCDI三体系活化体系，HOBt:DMAP:DIPCDI 的摩尔比为 12:1:12 ;H0Bt/DIPCDI 双体系活化体系，HOBt:DIPCDI 的摩尔比为1:1。在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，进一步优选，所述活化体系采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种溶解，更优选为，采用体积比DMF = DCM为I: I的混合溶剂溶解。在上述固相合成利那洛肽树脂的优选方案中，进一步优选，所述树脂固相载体为王树脂，更优选为替代度为I. Ommol/g的王树脂。作为优选，步骤2所述GSH/GSSH氧化体系中GSH和GSSH的摩尔比为5:1-15:1，更优选为10:1，步骤2所述氧化反应的pH值为7. 8-8. O,更优选为7. 9，步骤2所述氧化反应的温度为0-30°C，更优选为5°C。作为优选，步骤2所述裂解采用由体积百分比为90-95%的TFA、2_4%的TIS和余量水组成的裂解液裂解，更优选为采用由体积百分比为94%的TFA、3%的TIS和3%的水组成的裂解液裂解。作为优选，所述裂解液和利那洛肽树脂的体积质量比为IOml :lg。本发明所述纯化可以采用本技术领域常规纯化方法，如HPLC纯化方法。由本发明所述方法合成的利那洛肽线性粗肽经HPLC检测，纯度介于75-80%，利那洛肽粗品纯度为35-60%，总收率为11_27%，而在相同环境下利用文献“OptimizedFmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Pertide Linaclotide, Publishedonline 4 August 2010 in Wiley Online Library”中公开的第一种方法合成，其合成的利那洛肽线性粗肽经HPLC检测，纯度为40%左右，利那洛肽粗品纯度为20%左右，总收率不到10%,明显不如本发明所述方法。由以上技术方案可知，本发明所述方法采用Mmt保护基保护半胱氨酸侧链，采用逐一偶联方式合成利那洛肽线性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化体系氧化得到利那洛肽。本发明所述方法与现有方法相比，提高了线性粗肽纯度，可不经纯化即可进行氧化，且所获得利那洛肽粗品纯度和收率也显著提高。
具体实施例方式本发明公开了一种合成利那洛肽的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的的化合物和制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本发明具体实施方式
中，所有偶联由保护基的氨基酸均可通过市售获得，本发明中的保护氨基酸购自于吉尔生化有限公司，所用王树脂购自于天津南开和成有限公司，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表I。表I英文缩写释义
权利要求
1.一种合成利那洛肽的方法，其特征在于，包括以下步骤 步骤I、固相合成在SEQ ID NO: I所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树月旨，所述Cys侧链上偶联的保护基为Mmt保护基； 步骤2、利那洛肽树脂裂解脱除所有保护基和树脂固相载体得到利那洛肽线性粗肽，然后采用GSH/GSSH氧化体系对利那洛肽线性粗肽进行氧化反应，按照其N端到C端的氨基酸顺序，形成第I位Cys和第6位Cys的二硫键、第2位Cys和第10位Cys的二硫键以及第5位Cys和第13位Cys的二硫键得到利那洛肽粗品，纯化后即得利那洛肽。
2.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤I具体为 在活化体系存在下，将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Tyr(Fmoc-Tyr (tBu) -0H)与树脂固相载体偶联后脱Fmoc保护基得到H-Tyr (tBu)-树脂固相载体，然后按照SEQ ID NO: I所示氨基酸序列C端到N端的顺序，依次逐个将N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基的Gly (Fmoc-Gly-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Thr (Fmoc-Thr (tBu) -0H), N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的 Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -OH)> N 端偶联有 Fmoc 保护基的 Ala (Fmoc-Ala-OH)、N 端偶联有Fmoc保护基的Pro (Fmoc-Pro-OH)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Trt保护基的Asn (Fmoc-Asn (Trt)-0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys (Fmoc-Cys (Mmt) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有tBu保护基的Tyr (Fmoc-Tyr (tBu) -0H)、N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有OtBu保护基的Glu(Fmoc-Glu (OtBu) -0H)、两个N端偶联有Fmoc保护基以及侧链偶联有Mmt保护基的Cys(Fmoc-Cys (Mmt)_0H)进行延伸偶联，偶联完后脱除Fmoc保护基，得到利那洛肽树脂(H-Cys(Mmt)-Cys (Mmt)-Glu (OtBu)-Tyr (tBu)-Cys (Mmt)-Cys (Mmt)-Asn (Trt)-Pro-Ala-Cys(Mmt) -Thr (tBu) -Gly-Cys (Mmt) -Tyr (tBu)-树脂固相载体)。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述H-Tyr(tBu)-树脂固相载体替代度为O.4-0. 62mmol/g0
4.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述活化体系为HOBt/DMAP/DIPCDI三体系活化体系或HOBt/DIP⑶I双体系活化体系。
5.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述活化体系采用DMF、DCM、NMP和DMSO中任意一种或两种溶解。
6.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述树脂固相载体为王树脂。
7.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2所述GSH/GSSH氧化体系中GSH和GSSH的摩尔比为5:1-15:1。
8.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2所述氧化反应的pH值为7.8-8. O。
9.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2所述氧化反应的温度为0-30°C。
10.根据权利要求I所述方法，其特征在于，步骤2所述裂解采用由体积百分比为90-95%的TFA、2-4%的TIS和余量水组成的裂解液裂解。
全文摘要
本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成利那洛肽的方法。本发明所述方法固相合成在SEQ ID NO:1所示氨基酸序列N端、Thr侧链上、Cys侧链上、Asn侧链上、Tyr侧链上、Glu侧链上偶联有保护基以及在C端偶联有树脂固相载体的利那洛肽树脂，裂解脱除保护基和树脂固相载体后用GSH/GSSH氧化体系进行氧化反应，得到利那洛肽粗品，纯化后即得利那洛肽。本发明所述方法采用Mmt保护基保护半胱氨酸侧链，用逐一偶联方式合成利那洛肽线性粗肽，最后采用GSH/GSSH氧化体系氧化得到利那洛肽，与现有方法相比，提高了线性粗肽纯度，可不经纯化即可进行下步氧化步骤，且所获得利那洛肽粗品纯度和收率也显著提高。
文档编号C07K1/04GK102875655SQ20121037524
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者宓鹏程, 潘俊锋, 马亚平, 袁建成 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司