一种合成替度鲁肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药合成领域，具体涉及一种合成替度鲁肽的方法。
【背景技术】
[0002] 短肠综合征（SBS)是指由于严重小肠疾病或外科手术切除大部分小肠导致机体 无法正常吸收营养而引发一系列综合征。SBS降低了患者摄取液体和营养物质的能力，导致 他们脱水和营养不良。而肠外营养支持治疗又将增加全身感染和其他长期并发症的风险， 迄今为止尚无药物可以治疗短肠综合征。
[0003] 替度鲁肽（teduglutide)是一种胰高血糖素样肽2 (GLP-2)类似物，一种天然生成 的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。临床试验表明，该 药能够降低短肠综合征患者对胃肠外营养的需求，其氨基酸肽序如下：
[0004] H-His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29 -Lys30-Ile31-Thr32-Asp33-〇H
[0005] 在替度鲁肽的氨基酸序列中N端存在特殊序列，如His在缩合过程中产生会产生 [D-His1]-替度鲁肽杂质，而Asp-Gly结构在缩合过程也会产生的杂质[Asu3]-替度鲁肽， 为此需要较为合适的合成策略来最大程度上的降低这些杂质的产生。
[0006] 在替度鲁肽现有合成方法中，专利CN104072603A公开了一种替度鲁肽的合成方 法，其先合成替度鲁肽2-33位氨基酸片段，而后采用特殊保护基保护的His偶联获得，在该 专利记载的数据中，其获得的替度鲁肽纯品中[D-His1]-替度鲁肽杂质含量在0.2%左右， 而对于[Asu3]-替度鲁肽杂质含量并未有针对性的进行控制以及检测；
[0007] 专利CN104418949A也公开了一种替度鲁肽的制备方法，其合成方式是先合成1-3 位和4-33位氨基酸片段，而后再偶联而成，在该专利记载的数据中，其合成的替度鲁肽粗 品纯度最高为63. 8%，最低为59. 78%，同时替度鲁肽纯品中[Asu3] -替度鲁肽杂质含量 < 0. 2%，但是对于[D-His1]-替度鲁肽杂质含量并未有针对性的进行控制以及检测，而且 其粗肽纯度也不够理想；
[0008] 专利CN104072605A公开了另一种替度鲁肽的制备方法，其同时包含了三种合成 方式，一是先合成1_9位、10-18位、19-33位氨基酸片段，而后偶联各片段获得；二是先合 成1 -4位、5_12位、13-20位、21-33位氨基酸片段，而后偶联各片段获得；二是先合成1_4 位、5-9位、10-18位、19-26位、27-33位氨基酸片段，而后偶联各片段获得。在该专利记载 的数据中，其获得替度鲁肽粗肽纯度最高为63. 4%，最低为60. 8 %，同时替度鲁肽纯品中 [Asu3]-替度鲁肽杂质含量为0. 15%，但是对于[D-His1]-替度鲁肽杂质含量同样未有针对 性的进行控制以及检测，而且其粗肽纯度也不够理想。
[0009] 无论上述三种现有技术的哪一种技术方案，其都没有同时控制替度鲁肽粗肽纯度 以及[D-His1]-替度鲁肽杂质含量和[Asu3]-替度鲁肽杂质含量，并达到较好地水平，同时 对于三者的替度鲁肽总收率也未记载，仅是在专利CN104072605A【背景技术】中公开了现有 替度鲁肽合成的收率为20%左右。在多肽药物合成领域，同时实现多个质量标准是研宄难 题，也是研宄人员不断追求的目标，这和合成方案中的各方面因素都存在很大关系，尤其是 合成策略。不同的合成策略对最终产品的纯度、杂质含量和收率有很大影响，如何在保证纯 度和收率的前提下，尽可能的降低合成工艺的复杂程度、杂质以及缩短合成周期，是当下技 术人员的研宄重点。
【发明内容】
[0010] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种合成替度鲁肽的方法，使得本发明所述方 法能够同时保证所获得的替度鲁肽粗肽纯度以及总收率具有较高水平，同时进一步降低替 度鲁肽合成中常见的[D-His1]-替度鲁肽杂质含量和[Asu3]-替度鲁肽杂质含量。
[0011] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0012] -种合成替度鲁肽的方法，包括以下步骤：
[0013] 步骤1、合成在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端、His侧链上偶联有保护基的多 肽片段1 ;
[0014] 合成在SEQIDNO: 2所示氨基酸序列N端、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段 2 ；
[0015] 合成在SEQIDNO: 3所示氨基酸序列C端偶联有树脂载体、在Ser侧链上、Asp侧 链上、Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Gin侧链上、Lys侧链 上偶联有保护基的多肽片段3;
[0016] 步骤2、将多肽片段3的N端和多肽片段2的C端偶联，偶联后脱除多肽片段2的 N端保护基，得到多肽树脂I;
[0017] 步骤3、将多肽片段1的C端和多肽树脂I的N端偶联，偶联后脱除多肽片段1的 N端保护基，得到替度鲁肽树脂；
[0018] 步骤4、替度鲁肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到替度鲁肽粗品，粗品纯 化转醋酸盐，获得替度鲁肽成品。
[0019] 替度鲁肽主链氨基酸有33个，采用片段方法进行合成存在很多种形式，但只有合 适的片段方法才能保证较高的替度鲁肽的总收率以及纯度，同时又能降低杂质的产生。为 此，申请人根据长期的试验研宄以及氨基酸消旋情况，提出了本发明所述方法来制备替度 鲁肽，在保证其总收率和纯度的前提下，进一步降低合成方法的杂质的产生。
[0020] 在本发明所述方法中，首先按照替度鲁肽主链肽序分成3个部分，即分成3个片段 的合成，以替度鲁肽主链N端到C端的氨基酸顺序编号，如下式：
[0021] H-His1-Gly2-Asp3-Gly4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-Glu9-Met10-Asn11-Thr12-Ile13-Leu14-Asp15-Asn16-Leu17-Ala18-Ala19-Arg20-Asp21-Phe22-Ile23-Asn24-Trp25-Leu26-Ile27-Gln28-Thr29 -Lys30-Ile31-Thr32-Asp33-〇H
[0022] SEQIDNO: 1所示氨基酸序列即为上式中编号1-2的多肽序列，SEQIDNO: 2所示 氨基酸序列即为上式中编号3-4的多肽序列，SEQIDN0:3所示氨基酸序列即为上式中编 号5-33的多肽序列。
[0023] 本发明在步骤1中合成的多肽片段1是在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列基础上，在 其N端、His侧链上分别偶联有保护基；合成的多肽片段2是在SEQIDNO: 2所示氨基酸序 列基础上，在其N端、Asp侧链上分别偶联保护基；合成的多肽片段3是在SEQIDN0:3所示 氨基酸序列基础上，在其C端偶联有树脂载体、在Ser侧链上、Asp侧链上、Glu侧链上、Asn 侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Gin侧链上、Lys侧链上偶联有保护基。三个 片段分别合成后再逐一偶联起来获得替度鲁肽。
[0024] 本发明所述保护基是在氨基酸合成领域常用的保护氨基酸主链以及侧链上氨基、 羧基等干扰合成的基团的保护基团，防止氨基、羧基等在制备目标产物过程中发生反应，生 成杂质，对于本发明中需要保护侧链的氨基酸来说，本领域技术人员公知其侧链结构以及 知晓采用常用保护基来保护氨基酸侧链上的氨基、羧基等基团，作为优选，本发明按照表1 中的保护基保护对应氨基酸的侧链
[0025] 表 1
【主权项】
1. 一种合成替度鲁肽的方法，其特征在于，包括以下步骤： 步骤1、合成在SEQIDNO: 1所示氨基酸序列N端、His侧链上偶联有保护基的多肽片 段1 ; 合成在SEQIDNO: 2所示氨基酸序列N端、Asp侧链上偶联有保护基的多肽片段2; 合成在SEQIDNO: 3所示氨基酸序列C端偶联有树脂载体、在Ser侧链上、Asp侧链上、 Glu侧链上、Asn侧链上、Thr侧链上、Arg侧链上、Trp侧链上、Gln侧链上、Lys侧链上偶联 有保护基的多肽片段3; 步骤2、将多肽片段3的N端和多肽片段2的C端偶联，偶联后脱除多肽片段2的N端 保护基，得到多肽树脂I; 步骤3、将多肽片段1的C端和多肽树脂I的N端偶联，偶联后脱除多肽片段1的N端 保护基，得到替度鲁肽树脂； 步骤4、替度鲁肽树脂酸解脱除C端树脂和所有保护基得到替度鲁肽粗品，粗品纯化转 醋酸盐，获得替度鲁肽成品。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述合成多肽片段1具体为： Fmoc-His(Trt)-OH或Boc-His(Trt)-OH与Gly-OBzl.HCl和三乙胺，在HOSu和DIC的作 用下缩合形成Fmoc-His(Trt)-Gly.OBzL或Boc-His(Trt)-Gly.OBzL，然后钮碳催化氢解， 得到Fmoc-His(Trt)-Gly或Boc-His(Trt) -Gly。
3. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤1所述合成多肽片段2具体为： Fmoc-Asp(OtBu)-OH与Gly-OBzl.HCl和三乙胺，在HOSu和DIC的作用下缩合形成 Fmoc-Asp(OtBu) -Gly.OBzL，然后钮碳催化氢解，得到Fmoc-Asp(OtBu) -Gly。
4. 根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述HOSu、DIC、保护氨基酸、三乙胺和 Gly-OBzl.HCl的摩尔比为 1 :1 :1 :1 :1。
5. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤1所述合成多肽片段3具体为： 在偶联试剂存在下，将Fmoc-Asp(OtBu)-OA与树脂载体偶联后脱Fmoc保护基得到 H-Asp(OtBu)-树脂载体，然后采用活化试剂和缩合试剂，按照SEQIDNO: 3所示氨基酸序 列C端到N端的顺序，依次逐个将剩余氨基酸或保护氨基酸进行延伸偶联，脱除N段带有的 Fmoc保护基得到多肽片段 3,即Ser(tBu) -Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu) -Met-Asn( Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-I Ie-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu )_树脂载体。
6. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述偶联试剂为N，N-二异丙基乙胺、 N，N-二异丙基碳二亚胺/1-羟基苯并三唑/4-N，N-二甲基吡啶两种之一。
7. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述树脂载体为Trityl-Cl类树脂或羟基类 树脂。
8. 根据权利要求2-4任意一项所述方法，其特征在于，步骤4所述酸解所述酸解采用由 体积百分比为80-95%的TFA、体积百分比为1-10%的E：DT、余量为水组成的混合酸解液酸 解。
9. 根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述缩合试剂N，N-二异丙基碳二亚 胺、N，N-二环己基碳二亚胺，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷/有机碱、 2-(7-氮杂-IH-苯并三氮唑-1-基）-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯/有机碱、苯并三氮 唑-N，N，N'，N' -四甲基脲六氟磷酸盐/有机碱、O-苯并三氮唑-N，N，N'，N' -四甲基脲四氟 硼酸酯/有机碱中的一种。
10.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述活化试剂为1-羟基苯并三唑或N-羟 基-7-氮杂苯并三氮唑。
【专利摘要】本发明涉及医药合成领域，公开了一种合成替度鲁肽的方法。本发明所述方法按照替度鲁肽主链N端至C端的氨基酸顺序，先合成第1至第2氨基酸、第3至第4氨基酸以及第5至第33氨基酸的3个多肽片段，然后按C端至N端顺序偶联3个多肽片段合成替度鲁肽。本发明所述方法调整替度鲁肽的合成工艺，以较简便的工艺步骤实现了同时在粗肽纯度、控制杂质含量和总收率方面具有较高水平，相比现有技术更加具有实用价值和应用前景。
【IPC分类】C07K1-04, C07K1-06, C07K14-605
【公开号】CN104817638
【申请号】CN201510274924
【发明人】文永均, 郭德文, 曾德志, 童光彬
【申请人】成都圣诺生物科技股份有限公司
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月26日