一种六次甲基四胺完全抗原的制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品安全检测领域，具体地说是一种六次甲基四胺完全抗原的制备方法及其该完全抗原在六次甲基四胺检测中的应用。
【背景技术】
[0002]六次甲基四胺(俗名乌洛托品)，分子式C6H12N4，属化工原料，被卫生部列入第五批《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂名单》中，六次甲基四胺被禁止添加到食品当中或在加工食品过程中使用。部分违法者将其掺入腐竹、粉丝、水产品等食品中，会起到增白、保鲜、增加口感、防腐的效果。六次甲基四胺本身属低毒类，可作为药物服用。但其在酸性条件下，能分解出甲醛，甲醛易与体内多种化学结构的受体发生反应，如与氨基化合物可以发生缩合，与巯基化合物加成，使蛋白质变性。甲醛在体内还可还原为醇，故可表现出甲醇的毒理作用，对人体的肾、肝、中枢神经、免疫功能、消化系统等均有损害。
[0003]目前，国家标准中还没有关于六次甲基四胺的指定检测方法，一般行业内对其进行检测，主要采用仪器法，比如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-串联质谱法(LC-MSMS)等。这些方法虽然可以精确地进行定量检测分析，但是存在检测仪器昂贵、成本高、需要专门的技术人员来检测、检测时间长、方法操作复杂等缺陷。因此，行业内非常迫切开发一种简单、快速、高效检测六次甲基四胺的方法。
[0004]免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。它可以克服仪器检测法的上述缺陷，能够以其简单、快速、灵敏度高、特异性强、结果直观、无需仪器等高效地应用于食品安全检测领域。目前，免疫学检测方法中应用较广泛的是酶联免疫吸附测定法，简称ELISA法；其基本原理是通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来，形成酶标记物；或通过免疫学的方法将酶与酶抗体结合起来，形成免疫复合物，然后通过显色来检测。由此可见，为适应于食品安全检测高效、快速特性的迫切需求，行业内开发一种六次甲基四胺的免疫检测方法是一个非常不错的选择。但是，建立该方法首先需要制备出待测物的高特异性和高敏感性的完全抗原和抗体，而一般针对特定的半抗原需选择合适的人工抗原合成方法，才能获得高效价的抗体和理想的检测效果。到目前为止，国内外尚无合成六次甲基四胺完全抗原方法的报道，而采用目前现有技术中常规合成人工抗原的方法，如重氮化法、碳二亚胺法、活泼酯法、混合酸酐法等，根本无法合成理想的六次甲基四胺完全抗原。与此同时，目前国内外也没有关于采用酶联免疫法检测六次甲基四胺的相关报道。
【发明内容】
[0005]本发明的目的之一是提供一种六次甲基四胺完全抗原的制备方法，以提供一种高特异性的完全抗原，为其能够投入到六次甲基四胺酶联免疫简单、快速、有效的检测应用中。
[0006]本发明的目的之二是利用制备的六次甲基四胺完全抗原及抗体建立一种六次甲基四胺的定量检测方法。
[0007]本发明是通过以下技术方案实现的:一种六次甲基四胺完全抗原的制备方法，包括以下步骤:
(A)配制浓度为200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液；
(B)配制pH值为7-10、离子浓度为10-1000mmol、含载体蛋白30-50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液；所述载体蛋白为牛血清白蛋白；
(C)将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为20-25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4°C静置过夜；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液的添加比例为:80-120 mg: l-5ml: 2_3ml ；
(D)将步骤(C)过夜后的混合液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3-5天，每天换液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原。
[0008]所述六次甲基四胺溶液的溶剂为甲醇、乙醇或水中的一种；优选甲醇。
[0009]通过实验证明，采用上述方法制备的六次甲基四胺完全抗原可成功制备高特异性和灵敏性的六次甲基四胺多克隆抗体，完全能够应用于检测待测物中的六次甲基四胺的含量。
[0010]一种六次甲基四胺的定量检测方法，包括以下步骤:
(b)利用步骤(a)合成的六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗血清；
(c)对步骤(a)合成的六次甲基四胺完全抗原进行包被，获得六次甲基四胺包被抗原；
(d)用六次甲基四胺包被抗原包被酶标板，封闭，加入不同浓度的六次甲基四胺标准品，再加入六次甲基四胺多克隆抗血清的稀释液，设置以不加入六次甲基四胺为阴性对照，设置空白对照，洗板，拍干，加入酶标二抗，洗板，拍干，加入底物显色液，终止反应，测定酶标板上标准品、阴性对照和空白对照的OD49tl值；
(e)根据步骤(d)测得各孔的OD49tl值，按照公式抑制率=(阴性对照OD值-样品OD值)/ (阴性对照OD值-空白对照OD值)X100%，计算不同浓度六次甲基四胺标准品所对应的抑制率；
Cf)以六次甲基四胺浓度为横坐标，以所述六次甲基四胺浓度所对应的抑制率为纵坐标，绘制六次甲基四胺竞争抑制标准曲线；对所述标准曲线进行拟合，得线性拟合方程；
(g)测定样品时，先对待测样品进行前处理，按照所述步骤(d)的操作过程，将待测样品代替六次甲基四胺标准品进行加样检测，测定待测样品的OD49tl值，按照所述抑制率的计算公式计算所述OD值对应的抑制率，将所得的抑制率带入到所述标准曲线读出其所对应的六次甲基四胺的含量值或根据所述线性拟合方程计算出待测样品中六次甲基四胺的含量。
[0011]本发明步骤(b)所述六次甲基四胺多克隆抗血清制备的工艺方法为:步骤(b)所述六次甲基四胺多克隆抗血清制备的工艺为:采用初次免疫制剂对两只雄性大耳白家兔进行初次免疫，之后用加强免疫制剂分别于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加强免疫I次，采用背部皮下脊柱两侧多点进行免疫，于最后一次免疫完第10天，从兔子的耳缘静脉取血，将血清收集于离心管中，室温静置30-35min，待血浆凝聚后，4°C静置过夜，将血清以3000 r/mim离心15-20 min，得到的上清液为六次甲基四胺多克隆抗血清。
[0012]所述初次免疫制剂的制备工艺为将所述六次甲基四胺完全抗原按体积比为1:4溶于磷酸盐缓冲液中，得抗原磷酸缓冲液，在抗原磷酸缓冲液中加入与其等体积的弗氏完全佐剂，乳化即得；所述加强免疫制剂的制备工艺为将所述六次甲基四胺完全抗原按体积比为1:9溶于磷酸盐缓冲液中，得加强抗原磷酸缓冲液，在加强抗原磷酸缓冲液中加入与其等体积的弗氏不完全佐剂，乳化即得；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.0l mol/L，pH值为7.4。
[0013]本发明步骤(C)所述六次甲基四胺包被抗原的制备工艺为:步骤(C)所述六次甲基四胺包被抗原的制备工艺为:配制浓度为15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液；配置浓度为0.lmol/L、pH值为7.4、含有卵清蛋白4.5-5.0mg/ml的磷酸盐缓冲液；将六次甲基四胺溶液缓慢滴加到含卵清蛋白磷酸缓冲溶液中，之后，再加入体积比浓度为20-25%戊二醛水溶液，混匀，室温静置I小时，4°C静置过夜，装入透析袋，4°C下在0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中连续透析5天，每天换液I次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺:含卵清蛋白的磷酸缓冲溶液:戊二醛水溶液的添加比例为5-6 mg: 2-5ml: 1-2ml ο
[0014]本发明步骤(d)中所述包被酶标板的包被工艺为:包被酶标板的六次甲基四胺包被抗原的浓度为5.8-6.2 μ g/ml，优选6 μ g/ml，包被量为95-105 μ I/孔，优选100 μ I/孔，4°C包被过夜12h，PBST洗板3次，拍干即可。
[0015]本发明步骤(d)中所述封闭的工艺为:用质量百分比浓度为5%的脱脂奶粉水溶液封闭，其添加量为200 μ I/孔，37°C温箱孵育封闭lh，PBST洗板3次，拍干即可。
[0016]本发明步骤(d)中所述加入不同浓度的六次甲基四胺标准品是指每孔先加入50 μ 1、浓度分别为 10000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml、l ng/ml、0.1 ng/ml、0.0Olng/ml 的六次甲基四胺甲醇溶液。
[0017]本发明步骤(d)中所述加入六次甲基四胺多克隆抗血清的稀释液的稀释比例为1:2000，其添加量为50 μ I/孔，37°C温箱孵育lh, PBST洗板4次，拍干。
[0018]本发明步骤(d)中所述酶标二抗