:每孔先加入50μ1的不同稀释浓度六次甲基四胺标准品(10000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml、l ng/ml、0.1 ng/ml、0.0Olng/ml )，再加入50 μ I 稀释比例为1:2000的所述抗血清，以不加入六次甲基四胺标准品的孔为阴性对照孔，同时以不加任何物品的孔为空白对照孔，37°C温箱孵育lh，PBST洗板4次，拍干；
(4)加辣根过氧化物酶标二抗:加入1:3000稀释的辣根过氧化物酶标二抗(Solarb1，北京博奥康生物技术有限公司)，100 μ I/孔，37°C温箱孵育30min，PBST洗板5次，拍干；
(5)底物显色:加入邻苯二胺底物体系(现配现用，1.84gNa2HP04.12H20+0.51g柠檬酸+40mg0PD +150 μ 1H202+100ml 去离子水)，150 μ I/ 孔，37°C避光反应 20 min ；
(6)终止:加入2mol/L的浓硫酸，50μ I/孔，终止反应；在波长490nm条件下用酶标仪读取添加不同浓度的六次甲基四胺标准品反应孔的OD49tl值(吸光值)；
(7)根据OD值计算抑制率，抑制率的计算公式为:抑制率=(阴性对照OD值-样品OD值)/ (阴性对照OD值-空白对照OD值)X 100%，以六次甲基四胺浓度为横坐标，所对应的抑制率为纵坐标，绘制标准曲线；其结果如图3所示，进一步对工作曲线进行方程拟合，得其线性拟合方程为 y=8.89711η (X)+24.852，R2=0.9882。
[0038]标准曲线的作用在于，在测定样品时可以根据标准曲线，相对应每一个样品中六次甲基四胺的含量可从标准曲线上读出，也可以根据线性拟合方程计算出样本中六次甲基四胺的含量。测得的吸光度与样品中六次甲基四胺的含量成反比，根据测得的吸光值计算抑制率，再由标准曲线或线性拟合方程计算样品中六次甲基四胺的含量。
[0039]实施例6六次甲基四胺的定量检测方法
样品前处理:选取3种待测样品腐竹、粉丝、水产品，分别放入研钵中研磨粉碎，过筛去除大的颗粒，分别称取15g样本置于蒸发皿中，加入1ml正己烷，摇匀后水浴蒸干，取出再加入1ml正己烧，摇勾继续蒸干；分别向其中加入1ml的甲醇，摇勾，凝缩定容至1ml，用PBS做1:10的稀释，制得3种待测样品溶液；
用移液器分别取待测样品溶液100 μ 1，采用间接竞争ELISA法做检测:
(1)包被:用浓度为6.0 μ g/ml包被抗原HMTA-OVA包被酶标板，100 μ I/孔，4°C包被过夜12h，PBST洗板3次，拍干；
(2)封闭:加入质量百分比浓度为5%的脱脂奶粉水溶液封闭，200μ I/孔，37°C温箱孵育封闭Ih，PBST洗板3次，拍干；
(3)加抗体和待测样品:每孔先加入50μ I的样本液，再加入50 μ I稀释比例为1:2000的所述抗血清，以不加入待测样本溶液的孔为对照孔，同时设置空白对照，37°C温箱孵育lh，PBST洗板4次，拍干；
(4)加辣根过氧化物酶标二抗:加入1:3000稀释的辣根过氧化物酶标二抗，100μ I/孔，37°C温箱孵育30min，PBST洗板5次，拍干。
[0040](5)底物显色:加入邻苯二胺底物体系(现配现用，配置方法同上)，150 μ I/孔，37°C避光反应20 min。
[0041](6)终止:加入2mol/L的浓硫酸，50 μ I/孔，终止反应，在波长490nm条件下用酶标仪读取OD值。
[0042](7)分析检测结果:测得的吸光度与样品中六次甲基四胺的含量成反比，按照上述抑制率的计算公式计算出所述OD值对应的抑制率，将所得的抑制率带入到实施例5得到的六次甲基四胺竞争抑制标准曲线中，读出其所对应的六次甲基四胺的含量值，也可以根据实施5得到的线性拟合方程计算出样本中六次甲基四胺的含量，即为待测样品中所含六次甲基四胺的含量。
[0043]根据六次甲基四胺竞争抑制标准曲线，由拟合方程可知本发明提供的ELISA检测方法的IC50为16.88 ng/ml，表明本发明制备的抗原及抗体具有较好的特异性，提供的检测方法灵敏度较高。
[0044]根据六次甲基四胺竞争抑制曲线，本发明将抑制率为15%时的标准物六次甲基四胺浓度定为最低检测限。由拟合方程可知ELISA检测方法的IC15为0.33ng/ml，所以，本法的最低检测限为0.33 ng/mlo
[0045]实施例7本发明提供的检测方法在食品中六次甲基四胺残留检测中的应用
对腐竹样品进行前处理，处理过程同实施例6，向无六次甲基四胺的腐竹样品中添加15ng/ml的六次甲基四胺作为实际待检样品，用间接竞争ELISA法进行检测。
[0046]样品如处理:用PBS对样品做1:10稀释，制备样品洛液；
间接竞争ELISA法检测:
(1)包被:用浓度为6.0 μ g/ml包被抗原HMTA-OVA包被酶标板，100 μ I/孔，4°C包被过夜12h，PBST洗板3次，拍干；
(2)封闭:加入质量百分比浓度为5%的脱脂奶粉水溶液封闭，200μ I/孔，37°C温箱孵育封闭Ih，PBST洗板3次，拍干；
(3)加抗体和待测样品:每孔先加入50μ I的样本液，再加入50 μ I稀释比例为1:2000的所述抗血清，以不加入待测样本溶液的孔为对照孔，同时设置空白对照，37°C温箱孵育lh，PBST洗板4次，拍干；
(4)加辣根过氧化物酶标二抗:加入1:3000稀释的酶标二抗，10ul/孔，100μ I/孔，37°C温箱孵育30min，PBST洗板5次，拍干；
(5)底物显色:加入邻苯二胺底物体系(现配现用，配置方法同上)，150μ I/孔，37°C避光反应20 min ；
(6)终止:加入2mol/L的浓硫酸，50μ I/孔，终止反应，在波长490nm条件下用酶标仪读取OD值。
[0047]结果分析:
根据测得的OD值，通过抑制率计算公式，计算其抑制率为27.78%，将抑制率带入到线性拟合方程，求得样品溶液中六次甲基四胺的含量为1.39ng/ml，由于样品溶液经前处理已经稀释了 10倍，所以测定样品腐竹中六次甲基四胺的含量为13.9ng/ml，回收率92.5%。
[0048]对比例I
六次甲基四胺完全抗原的制备:将六次甲基四胺10mg溶于400 μ I甲醇当中，溶解后将其滴入PH值为7.4、离子浓度为10mmol、含有200mg载体蛋白的磷酸盐缓冲液5ml中，室温避光搅拌30min，将PH值为7.4、离子浓度为lOOmmol、含有10mg碳二亚胺的磷酸盐缓冲液3ml逐滴加入上述混合液中，23°C恒温避光缓慢搅拌过夜。载体蛋白采用牛血清白蛋白，用磷酸盐缓冲液在4°C下连续透析5天，每天换液I次，得六次甲基四胺免疫抗原。
[0049]六次甲基四胺包被抗原的鉴定:取六次甲基四胺、牛血清白蛋白和六次甲基四胺抗原分别进行紫外(200nm-700nm)光谱扫描，比较三者的最大吸收波长和所对应的吸光值，鉴定六次甲基四胺是否与载体蛋白发生偶联，结果显示六次甲基四胺抗原的最大吸收波长所对应的吸光值与六次甲基四胺和牛血清白蛋白的无明显变化。经过计算，六次甲基四胺和牛血清白蛋白结合的摩尔比仅为2:1。
[0050]对比例2
六次甲基四胺完全抗原的制备:将六次甲基四胺5mg溶于300 μ I甲醇当中，溶解后将其滴入PH值为7.4、离子浓度为10mmol、含有12mg载体蛋白的磷酸盐缓冲液2.5ml中，室温避光搅拌30min，将PH值为7.4、离子浓度为lOOmmol、含有1mg碳二亚胺的磷酸盐缓冲液1.5ml逐滴加入上述混合液中，23°C恒温避光缓慢搅拌过夜。载体蛋白采用卵清白蛋白，用磷酸盐缓冲液在4°C下连续透析5天，每天换液I次，得六次甲基四胺包被抗原。
[0051]六次甲基四胺包被抗原的鉴定:取六次甲基四胺、卵清白蛋白和六次甲基四胺抗原分别进行紫外(200nm-700nm)光谱扫描，比较三者的最大吸收波长和所对应的吸光值，鉴定六次甲基四胺是否与载体蛋白发生偶联，结果显示六次甲基四胺抗原的最大吸收波长所对应的吸光值与六次甲基四胺和卵清白蛋白的无明显变化。经过计算，六次甲基四胺和卵清白蛋白结合的摩尔比为2:1。
[0052]对比例3
六次甲基四胺完全抗原的制备:将六次甲基四胺10mg溶于400 μ I甲醇当中，记为A液；将200mg载体蛋白溶解于PH值为7.4、离子浓度为10mmol的