为辣根过氧化物羊抗兔酶标二抗(Solarb1db京博奥康生物技术有限公司)，加入辣根过氧化物酶标二抗的稀释梯度为1:3000，加入量为100 μ I/孔，37°C温箱孵育30min，PBST洗板5次，拍干。
[0019]本发明步骤(d)中底物显色为邻苯二胺底物体系，添加量为150 4 1/孔，37°0避光反应20 min。
[0020]本发明步骤(d)中所述终止的终止液为2mol/L的浓硫酸，添加量为50 μ I/孔，终止反应。
[0021]本发明步骤(d)中所述测定OD值在波长490nm条件下用酶标仪读取即可。
[0022]本发明提供的定量检测方法通过实验证明可以在食品安全检测中推广应用。
[0023]本发明首创公开了六次甲基四胺完全抗原的制备方法，并通过制备的完全抗原免疫动物得到的六次甲基四胺多克隆抗体，该制备方法简单、易操作，制备的完全抗原特异性强、灵敏度高，可用于六次甲基四胺残留的免疫检测，实现食品中六次甲基四胺的安全监控。同时，本发明利用制备的完全抗原及抗体首次公开一种新的检测六次甲基四胺的ELISA法，即采用间接竞争ELISA法精准地定量分析样品中含有的六次甲基四胺，通过实验证明，其最低检测限(L0D值)为0.33 ng/mlo本发明的检测方法检测时间短，无需大型仪器，对样品的前处理要求低，处理过程简单，能够同时快速检测大批样品，而且检测结果准确度高，应用性强，操作简单，可实现腐竹、粉丝、水产品中六次甲基四胺的快速、准确地检测，这对于维护广大消费者利益及保障政府部门的监管工作具有重大意义。
【附图说明】
[0024]图1为牛血清白蛋白的光谱扫描图谱。
[0025]图2为六次甲基四胺偶联牛血清白蛋白的光谱扫描图谱。
[0026]图3为六次甲基四胺竞争抑制标准曲线图。
【具体实施方式】
[0027]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
[0028]下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0029]实施例1六次甲基四胺完全抗原的制备
配制pH值为7.4、离子浓度为100 mmol、含有200 mg牛血清白蛋白(载体蛋白)的复合磷酸盐缓冲液5ml ;称取10mg六次甲基四胺溶于400 μ I甲醇中，溶解后将其滴入到配好的复合磷酸盐缓冲液中；再加入3ml体积比浓度为25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置I小时，4°C冰箱过夜，用磷酸盐缓冲液连续透析5天，每天换液I次，得六次甲基四胺完全抗原(完全抗原HMTA-BSA )。
[0030]实施例2六次甲基四胺完全抗原的鉴定
用去离子水精确配制六次甲基四胺和牛血清白蛋白(BSA)标准溶液。用去离子水配制偶联物HMTA-BSA标准溶液，利用凯氏定氣法测其蛋白质的浓度，并使偶联物溶液蛋白质的浓度和BSA蛋白浓度一致，在波长200nm?700nm的范围内分别对其进行光谱扫面，判断其是否偶联成功。其结果见图1和图2。
[0031]结果显示:六次甲基四胺抗原的最大吸收波长所对应的吸光值与六次甲基四胺和牛血清白蛋白的明显不同，由图1和图2对比可知，六次甲基四胺与载体蛋白发生偶联后，其偶联物紫外光谱扫描图谱与载体蛋白BSA的相比，光谱曲线发生了改变，最大吸收峰处的吸收波长由285nm移动至507nm，吸光值也有所增加，这说明载体蛋白分子上已经成功的连接上了一定数量的六次甲基四胺半抗原小分子，说明六次甲基四胺和牛血清白蛋白已经偶联成功。经过计算，六次甲基四胺和牛血清白蛋白结合的摩尔比为7:1。
[0032]实施例2六次甲基四胺包被抗原的制备
准确称取六次甲基四胺5mg溶于300 μ I甲醇当中，然后准确称取12mg卵清蛋白(OVA)溶于2.5ml浓度为0.lmol/L, pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中；将溶有六次甲基四胺的甲醇溶液缓慢滴加到卵清蛋白磷酸缓冲溶液中，之后，再加入1.5ml体积比浓度为25%戊二醛水溶液，混匀，室温静置I小时，4°C冰箱过夜；将其装入透析袋，4°C下在0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中连续透析5天，每天换液I次；得到的六次甲基四胺包被抗原(包被抗原HMTA-0VA)，将该抗原用磷酸缓冲液(浓度为0.lmol/L, pH值为7.4)以0.75mg/ml的浓度分装于1.5ml离心管中，于_80°C冷冻保存，备用。
[0033]实施例3六次甲基四胺多克隆抗体的制备实验动物免疫:准确量取0.1ml完全抗原HMTA-BSA，溶于0.4ml浓度为0.0l mol/L,pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中，将得到的溶液与0.5ml的弗氏完全佐剂充分乳化后进行初次免疫，加强免疫用0.1ml完全抗原HMTA-BSA溶于0.9ml浓度为0.01 mol/L,pH值为7.4的PBS中，与Iml的弗氏不完全佐剂充分乳化后进行免疫，免疫两只雄性大耳白家兔，采用背部皮下脊柱两侧多点(6?9点)注射，分别于初次免疫后2周、4周、8周、12周共加强免疫四次，于第五次免疫完后第10天，由兔子的耳缘静脉取血，将血清收集于10毫升的离心管中，室温静置30min，待血楽凝聚后，4°C冰箱过夜，将血清以3000r/mim离心15min，得到的上清液为六次甲基四胺多克隆抗血清(抗血清)，将抗血清分装，于_80°C冷冻保存。
[0034]实施例4六次甲基四胺多克隆抗血清效价的测定
Cl)包被酶标板:用0.05 mol/L, pH值为9.6的碳酸盐包被缓冲液(1.6gNa2C03+2.9gNaHC03+1000 ml去离子水)将浓度为0.75mg/ml的包被抗原HMTA-OVA溶液稀释至10 μ g/ml，包被于96孔酶标板100 μ I/孔，4°C冰箱过夜12h，PBST (PBS+Tween-20)洗板3次，300 μ I/孔，每次3min，将板拍干；
(2)封闭:用质量百分比浓度为5%的脱脂奶粉水溶液封闭酶标板，200μ I/孔，37°C温箱孵育Ih，PBST洗板3次，拍干；
(3)加样:第一行为PBS空白对照，以下7行分别为梯度稀释的含六次甲基四胺多克隆抗血清(1:500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000)，100 μ I/ 孔，做三次平行实验，37°C温箱孵育Ih，PBST洗板4次，拍干；
(4)加辣根过氧化物酶标二抗:将辣根过氧化物羊抗兔酶标二抗(Solarb1，北京博奥康生物技术有限公司)用PBS做1:3000稀释，100 μ I/孔，37°C温箱孵育30min，PBST洗板5次，拍干；
(5)底物显色:加入邻苯二胺底物体系(现配现用，1.84gNa2HP04*12H20+0.51g柠檬酸+40mg0PD +150 μ 1H202+100ml 去离子水)，150 μ I/ 孔，37°C避光反应 20min ；
(6)终止:加入2mol/L的浓硫酸，50μ I/孔，终止反应；
(7)测定每个反应孔的OD值:5min内酶标仪测定，于490nm处选择OD值为1.0左右的血清稀释倍数，即为抗血清的效价。用此方法测得的抗血清效价能够满足应用所需的抗体效价要求。
[0035]根据测定结果，采用常用的封闭时间、反应温度和时间，通过方阵法确定包被原浓度和抗体的最佳稀释比例，选择吸光值在1.0左右的抗原抗体结合浓度为最佳工作浓度，经测定其工作浓度为:包被抗原HMTA-OVA的浓度为5.8-6.2 μ g/ml，其最优工作浓度为:包被抗原HMTA-OVA的浓度为6.0 μ g/ml，抗体稀释度为1:2000。
[0036]根据上述所确定的抗原和抗体的最佳结合浓度进行实验，辣根过氧化物酶标二抗按照1:1500,1:3000、1:6000、1:12000梯度稀释。通过反应测得的OD值最接近1.0作为评价标准，此时为酶标二抗最佳工作浓度。经测得，辣根过氧化物酶标二抗的最佳稀释度为1:3000ο
[0037]实施例5六次甲基四胺竞争抑制标准曲线的建立
(1)包被:用浓度为6.0 μ g/ml包被抗原HMTA-OVA包被酶标板，100 μ I/孔，4°C包被过夜12h，PBST洗板3次，拍干；
(2)封闭:加入质量百分比浓度为5%的脱脂奶粉水溶液封闭，200μ I/孔，37°C温箱孵育封闭Ih，PBST洗板3次，拍干；
(3)加抗体和标准样品