磷酸盐缓冲液5ml中，记为B液；将3ml体积比为25%的戊二醛水溶液记为C液。载体蛋白采用牛血清白蛋白。将三种溶液充分混合，室温静置I小时，4°C冰箱过夜。用磷酸盐缓冲液连续透析5天，每天换液I次，得六次甲基四胺免疫抗原。
[0053]六次甲基四胺包被抗原的鉴定:取六次甲基四胺、牛血清白蛋白和六次甲基四胺抗原分别进行紫外(200nm-700nm)光谱扫描，比较三者的最大吸收波长和所对应的吸光值，鉴定六次甲基四胺是否与载体蛋白发生偶联，结果显示六次甲基四胺抗原的最大吸收波长所对应的吸光值与六次甲基四胺和牛血清白蛋白的无明显变化。经过计算，六次甲基四胺和牛血清白蛋白结合的摩尔比为2.91:1。
[0054]对比例4
六次甲基四胺完全抗原的制备:将六次甲基四胺5mg溶于300 μ I甲醇当中，记为A液；将12mg载体蛋白溶解于PH值为7.4、离子浓度为10mmol的磷酸盐缓冲液2.5ml中，记为B液；将1.5ml体积比为25%的戊二醛水溶液记为C液。载体蛋白采用卵清白蛋白。将三种溶液充分混合，室温静置I小时，4°C冰箱过夜。用磷酸盐缓冲液连续透析5天，每天换液I次，得六次甲基四胺包被抗原。
[0055]六次甲基四胺包被抗原的鉴定:取六次甲基四胺、卵清白蛋白和六次甲基四胺抗原分别进行紫外(200nm-700nm)光谱扫描，比较三者的最大吸收波长和所对应的吸光值，鉴定六次甲基四胺是否与载体蛋白发生偶联，结果显示六次甲基四胺抗原的最大吸收波长所对应的吸光值与六次甲基四胺和卵清白蛋白的无明显变化。经过计算，六次甲基四胺和卵清白蛋白结合的摩尔比为2.91:1。
[0056]上述描述仅作为本发明可实施的技术方案提出，不作为对其技术方案本身的单一限制条件。
【主权项】
1.一种六次甲基四胺完全抗原的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (A)配制浓度为200-300mg/ml的六次甲基四胺溶液； (B)配制pH值为7-10、离子浓度为10-1000mmol、含载体蛋白30-50 mg/ml的复合磷酸盐缓冲液；所述载体蛋白为牛血清白蛋白； (C)将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入体积比浓度为20-25%的戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4°C静置过夜；所述六次甲基四胺:复合磷酸盐缓冲液:戊二醛水溶液的添加比例为:80-120 mg: l-5ml: 2_3ml ； (D)将步骤(C)过夜后的混合液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3-5天，每天换液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原。
2.根据权利要求1所述的六次甲基四胺完全抗原的制备方法，其特征在于，所述六次甲基四胺溶液的溶剂为甲醇、乙醇或水中的一种。
3.—种权利要求1制备的六次甲基四胺完全抗原在六次甲基四胺检测中的应用。
4.一种六次甲基四胺的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤: Ca)按照权利要求1所述的方法合成六次甲基四胺完全抗原； (b)利用步骤(a)合成的六次甲基四胺完全抗原进行动物免疫，获得六次甲基四胺多克隆抗血清； (c)对步骤(a)合成的六次甲基四胺完全抗原进行包被，获得六次甲基四胺包被抗原； (d)用六次甲基四胺包被抗原包被酶标板，封闭，加入不同浓度的六次甲基四胺标准品，再加入六次甲基四胺多克隆抗血清的稀释液，设置以不加入六次甲基四胺标准品为阴性对照，设置空白对照，洗板，拍干，加入酶标二抗，洗板，拍干，加入底物显色液，终止反应，测定酶标板上标准品、阴性对照和空白对照的OD49tl值； (e)根据步骤(d)测得各孔的OD49tl值，按照公式抑制率=(阴性对照OD值-标准品OD值)/ (阴性对照OD值-空白对照OD值)X 100%，计算不同浓度六次甲基四胺标准品所对应的抑制率； Cf)以六次甲基四胺浓度为横坐标，以所述六次甲基四胺浓度所对应的抑制率为纵坐标，绘制六次甲基四胺竞争抑制标准曲线；对所述标准曲线进行拟合，得线性拟合方程； (g)测定样品时，先对待测样品进行前处理，按照所述步骤(d)的操作过程，将待测样品代替六次甲基四胺标准品进行加样检测，测定待测样品的OD49tl值，按照公式抑制率=(阴性对照OD值-待测样品OD值)/ (阴性对照OD值-空白对照OD值)X 100%，计算所述待测样品OD49tl值对应的抑制率，将所得的抑制率带入到所述标准曲线读出其所对应的六次甲基四胺的含量值或根据所述线性拟合方程计算出待测样品中六次甲基四胺的含量。
5.根据权利要求4所述的六次甲基四胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(b)所述六次甲基四胺多克隆抗血清制备的工艺为:采用初次免疫制剂对两只雄性大耳白家兔进行初次免疫，之后用加强免疫制剂分别于初次免疫后的第2周、4周、8周、12周各加强免疫I次，采用背部皮下脊柱两侧多点进行免疫，于最后一次免疫完第10天，从兔子的耳缘静脉取血，将血清收集于离心管中，室温静置30-35min，待血浆凝聚后，4°C静置过夜，将血清以3000 r/mim离心15-20 min，得到的上清液为六次甲基四胺多克隆抗血清。
6.根据权利要求5所述的六次甲基四胺的定量检测方法，其特征在于，所述初次免疫制剂的制备工艺为将所述六次甲基四胺完全抗原按体积比为1:4溶于磷酸盐缓冲液中，得抗原磷酸缓冲液，在抗原磷酸缓冲液中加入与其等体积的弗氏完全佐剂，乳化即得；所述加强免疫制剂的制备工艺为将所述六次甲基四胺完全抗原按体积比为1:9溶于磷酸盐缓冲液中，得加强抗原磷酸缓冲液，在加强抗原磷酸缓冲液中加入与其等体积的弗氏不完全佐剂，乳化即得；所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.0l mol/L，pH值为7.4。
7.根据权利要求4所述的六次甲基四胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(c)所述六次甲基四胺包被抗原的制备工艺为:配制浓度为15-25mg/ml的六次甲基四胺溶液；配置浓度为0.lmol/L、pH值为7.4、含有卵清蛋白4.5-5.0mg/ml的磷酸盐缓冲液；将六次甲基四胺溶液缓慢滴加到含卵清蛋白磷酸缓冲溶液中，之后，再加入体积比浓度为20-25%戊二醛水溶液，混匀，室温静置I小时，4°C静置过夜，装入透析袋，4°C下在0.01mol/L、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液中连续透析5天，每天换液I次，得到的六次甲基四胺包被抗原；所述六次甲基四胺:含卵清蛋白的磷酸缓冲溶液:戊二醛水溶液的添加比例为5-6 mg: 2-5ml:1-2 ml ο
8.根据权利要求4所述的六次甲基四胺的定量检测方法，其特征在于，步骤(d)所述包被酶标板的六次甲基四胺包被抗原的浓度为5.8-6.2 μ g/ml，包被量为95-105 μ I/孔；所述不同浓度六次甲基四胺标准品是指将六次甲基四胺溶于甲醇中配制成浓度分别为10000 ng/ml、100 ng/ml、10 ng/ml、l ng/ml、0.1 ng/ml、0.0Olng/ml 系列样品，其添加量为50 μ I/孔；所述六次甲基四胺多克隆抗血清的稀释液的稀释比例为1:2000，其添加量为50 μ I/孔；所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标二抗，所述辣根过氧化物酶标二抗的稀释比例为1:3000，加入量为100 μ I/孔。
9.根据权利要求4、5、6、7或8所述的六次甲基四胺的定量检测方法，其特征在于，步骤Cf)所述的线性拟合方程为y=8.89711η(x)+24.852，所述x为六次甲基四胺的浓度，所述y为抑制率。
10.一种权利要求4所述的六次甲基四胺定量检测方法在食品安全检测中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种六次甲基四胺完全抗原的制备方法，包括：A、配制0.16-0.3mg/ml的六次甲基四胺溶液；B、配制含牛血清白蛋白的复合磷酸盐缓冲液；C、将所述六次甲基四胺溶液滴加到所述复合磷酸盐缓冲液中，再加入戊二醛水溶液，混匀，室温静置1-2小时，4℃静置过夜；D、将步骤C过夜后的混合液装入透析袋中，用磷酸盐缓冲液透析3-5天，每天换液1-2次，得六次甲基四胺完全抗原。同时，本发明还用该抗原及其制备的抗体建立了六次甲基四胺的定量检测方法。本发明提供的抗原及抗体特异性和灵敏性强，其检测方法的检出限低、精准度高、步骤简单、易于操作控制，可广泛应用于食品安全检验领域中六次甲基四胺的检测。
【IPC分类】G01N33-543, C07K1-107, G01N33-531, C07K14-765
【公开号】CN104817639
【申请号】CN201510231471
【发明人】王庭欣, 贡东军, 信海红, 周丽岩, 孟墨, 冯智敏, 吕宝新
【申请人】河北大学
【公开日】2015年8月5日
【申请日】2015年5月8日