专利名称：用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法
技术领域：
本发明涉及用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法，属于医学检验仪器和环境监测仪器领域。
背景技术：
现有的针对抗原的医学检测手段仪器昂贵，过程复杂，耗时，不易于携带，单次检测费用较高。提供一种价格低廉，方便快捷的高灵敏抗原免疫传感检测手段成为必然。生物传感器是一种将生物敏感元件与物理元件相结合而制成的分析检测器件，其基本原理是将生物敏感元件发生的特异性反应及信号经由物理元件(换能器)转变为光、电、声等易检测信号，从而获知待测物的有关信号。免疫传感器利用抗原抗体之间高度的特异性结合能力，在传感器换能器敏感膜上固定抗体，可以高效实时的检测抗原。近年的研究中免疫生物传感器更是由于其价格低廉，反应阈值低，响应速度快，高选择性，在医疗检验，环境监测等多个领域都有很多研发应用的必要。敏感膜制备方法有化学性修饰敏感膜制备方法，比如非共价静电吸附，共价结合，双功能化学物质介导；以及生物性修饰敏感膜制备方法，比如蛋白质介导。所制备敏感膜的稳定性和生物活性对于传感器检测的线性范围，检测限，使用寿命，灵敏度起着关键作用。但是现在传感器仍然存在固定不牢，反应活性差等尚未克服的缺陷。比如化学性修饰敏感膜制备方法，会破坏抗体活性，降低检测灵敏度的缺陷；而生物性修饰敏感膜制备方法，抗体固定不牢固，成膜不稳定。
发明内容
本发明目的在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种成本低、不需要高精尖昂贵配套检测仪器、制备简单、活性高、稳定性好的用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是该用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法包括如下步骤
(1)将基底依次在乙醇溶液、去离子水中进行超声处理，直至基底表面洁净，再用氮气吹干备用；
(2)将干燥的基底浸入食人鱼洗液中进行氧化直至在所述基底的表面均勻分布有羟基，接着将基底取出并用去离子水冲洗，后再用氮气吹干备用；
(3)将3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙酸混合进行水解反应，后再加入步骤(2)所得到的基底静置，以使该基底表面上的羟基与水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷进行反应直至基底表面均勻生长有3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒，接着对生长有3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒的基底进行固化处理；
(4)在步骤(3)得到的基底表面上滴加蛋白A溶液或蛋白G溶液，并静置直至该基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒与所述蛋白A或蛋白G相结合，后冲洗去除未结合的蛋白A或蛋白G ；(5)在步骤(4)得到的基底表面上滴加与待检测的抗原对应的抗体，并静置直至所述蛋白A或蛋白G与所述抗体相结合，后冲洗去除未结合的抗体。与现有技术相比，本发明方法的有益效果是由于本发明利用了一种化学双功能高聚物(APTES)纳米颗粒基团跟生物大分子(蛋白A或蛋白G)共同介导的复合膜技术，具体地说是利用化学双功能基团两端相异的官能团分别能与基底和生物分子之间产生强大的化学结合力，从而克服了抗体分子连接不牢的缺点；再通过生物大分子蛋白A或蛋白G的介导，以及APTES高聚物纳米颗粒对基底表面粗糙度及性能表现的提高，有效保持了抗体反应分子的活性；并且利用蛋白A跟蛋白G的特异性定向作用，通过有效控制抗体取向一致性提高了抗体抗原结合的有效性，从而提高了传感器的敏感性。本发明在传感换能器表层合成由含有化学双功能基团的分子高聚物纳米颗粒和生物大分子共同介导的复合纳米敏感膜，检测阈值低、灵敏度高、稳定性好、制备简单、不需要高精尖昂贵的配套检测仪器，在医学检测、环境监控等相关领域有广泛应用。
图1是测抗原的高灵敏免疫传感器敏感膜制备过程示意图。
具体实施例方式如图1所示，本发明用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法具体包括如下步骤
1.基底的清洁
本发明所用基底通常为无机材料(如硅片、石英、玻璃纤维、硅酸盐、金属及其氧化物等)，以下以单晶硅片为例进行说明。将单晶硅片先用乙醇棉花反复擦拭干净，后在乙醇溶液(分析纯)中超声10分钟， 换液，再超声10分钟；接着在去离子水中超声10分钟，换水，再超声10分钟，反复进行多次，直至硅片表面洁净，用氮气吹干备用。2.硅片的亲水化处理
将干燥的硅片基底浸入食人鱼(piranha)洗液中进行氧化30分钟，使基底的表面均勻分布有羟基，接着将硅片基底取出并用去离子水冲洗30秒，后再用氮气吹干备用。其中食人鱼(piranha)洗液配制方法如下敞口烧杯至于水槽中以便散热，在烧杯中倒入一体积的30%H202，然后缓慢加入三倍体积于H2A的浓&S04，边加入边搅拌，现用现配。食人鱼起到两个作用第一，食人鱼洗液强氧化性对硅片表面进行进一步清洁去除有机污染，第二，食人鱼强氧化性使硅片表面发生氧化作用，表面氢键氧化生成羟基。形成羟基后的亲水性表层，更利于蛋白生物活性的保持，但是却变得更难结合蛋白质，减少了非特异性结合。3.双功能高聚物(APTES)纳米颗粒的侨联
将3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)和乙酸混合进行水解反应约3-5分钟，3-氨丙基三乙氧基硅烷与乙酸溶液的体积比为1:99，其中乙酸溶液的pH为3-4 ；后再加入步骤2所得到的基底静置10分钟，以使该基底表面上的羟基与水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷进行反应直至基底表面均勻生长有3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒，接着将生长有3-氨丙基
4三乙氧基硅烷纳米颗粒的基底放入干燥箱100摄氏度固化2小时，以实现APTES分子的固化和硅烷化。这样，两端带有不同化学官能团的双功能硅烷化试剂APTES—端的三个乙氧基水解后有一个与硅片基底上羟基通过缩水反应实现牢固的硅烷化连接，另外两个则与其他 APTES分子发生缩合反应形成高聚物纳米颗粒，起到提高基底表面粗糙度及性能表现的作用；另一端的NH4基团则实现与蛋白A及蛋白G的化学交联作用。除了化学交联作用以外， APTES高聚物纳米颗粒增加了硅片表面的粗糙度，也会促进蛋白A及蛋白G的吸附。4.生物大分子(蛋白A)的固定化
在步骤3得到的基底表面上滴加125 μ g/ml的蛋白A溶液(溶剂为PBS缓冲液)15 μ 1， 并静置30分钟以使该基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒与所述蛋白A相结合，后用PBS缓冲液冲洗去除未结合的蛋白Α。本发明中，蛋白A溶液可用蛋白G溶液替代。5.抗体的固定
在步骤4得到的基底表面上滴加将100 μ g/ml的Hbs抗体10 μ 1，并静置30分钟，以使蛋白A或蛋白G与Hbs抗体相结合，后用PBS缓冲液冲洗冲洗去除未结合的抗体。这样就实现了抗体的定向固定，制备得到可用于检测抗原的免疫传感器敏感膜。以上使用Hbs抗体可使制备得到的敏感膜用于检测Hbs抗原。本发明方法除了可使用以上Hbs抗体外，根据待检测的抗原的不同，还可使用其他对应的抗体。使用本发明方法制备得到的免疫传感器敏感膜时，可将商用检测相应抗原的酶联免疫吸附剂测定试剂盒，并将酶联免疫吸附剂测定试剂盒的酶标试剂加在敏感膜上，然后洗去；接着，依次加酶联免疫吸附剂测定试剂盒中的显色剂A和B，并用吸头吸一部分显色液到酶联免疫吸附剂测定试剂盒酶标板的孔里，加终止液终止反应，测定吸光度值，经过体积校正后与标准曲线对比，从而确定所检测的抗原的量。
权利要求
1. 一种用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法，其特征是包括如下步骤(1)将基底依次在乙醇溶液、去离子水中进行超声处理，直至基底表面洁净，再用氮气吹干备用；(2)将干燥的基底浸入食人鱼洗液中进行氧化直至在所述基底的表面均勻分布有羟基，接着将基底取出并用去离子水冲洗，后再用氮气吹干备用；(3)将3-氨丙基三乙氧基硅烷和乙酸混合进行水解反应，后再加入步骤(2)所得到的基底静置，以使该基底表面上的羟基与水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷进行反应直至基底表面均勻生长有3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒，接着对生长有3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒的基底进行固化处理；(4)在步骤(3)得到的基底表面上滴加蛋白A溶液或蛋白G溶液，并静置直至该基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒与所述蛋白A或蛋白G相结合，后冲洗去除未结合的蛋白A或蛋白G ；(5)在步骤(4)得到的基底表面上滴加与待检测的抗原对应的抗体，并静置直至所述蛋白A或蛋白G与所述抗体相结合，后冲洗去除未结合的抗体。
全文摘要
本发明公开一种用于检测抗原的免疫传感器敏感膜的制备方法。它是将干燥的基底浸入食人鱼洗液中进行氧化直至在所述基底的表面均匀分布有羟基，后使基底表面上的羟基与水解后的3-氨丙基三乙氧基硅烷进行反应直至基底表面均匀分布有3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒，接着使基底表面上的3-氨丙基三乙氧基硅烷纳米颗粒与蛋白A或蛋白G相结合，后通过在上述基底表面上滴加与待检测的抗原对应的抗体，使蛋白A或蛋白G与抗体相结合。本发明方法克服了抗体分子连接不牢的缺点，有效保持抗体反应分子的活性，并利用蛋白A跟蛋白G的特异性定向作用，通过有效控制抗体取向一致性提高了抗体抗原结合的有效性，从而提高传感器的敏感性。
文档编号G01N33/68GK102262160SQ20111010236
公开日2011年11月30日 申请日期2011年4月24日 优先权日2011年4月24日
发明者叶学松, 徐小媛, 胡一川 申请人:浙江大学