一种能特异结合前列腺特异性膜抗原胞外区的单域重链抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及单域重链抗体技术(又称纳米抗体技术），以及基因工程抗体技术，特 别是针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体或多肽。 技术背景
[0002] 单域抗体是指由普通抗体可变区（VH或VL)组成的基因工程抗体。单域重链抗体 (又称为纳米抗体，VHH 抗体，variable domain of heavy chain of heavy-chain anti body)是指仅由重链抗体(heavy-chain antibody)可变区（Variable region)组成的 基因工程抗体，其中，重链抗体(heavy-chain antibody)是一种存在于胳盤、藍鱼等动物体 内天然缺失轻链的抗体。单域重链抗体是目前已知的最小的完整抗原结合片段，具有分子 量小、渗透性好等特点，目前已广泛用于基础研究、医学诊断和检测、抗体药物开发等领域。
[0003] 前列腺癌是一种严重威胁老年男性健康的恶性肿瘤，其早期诊断和治疗对于其预 后具有重要的意义。前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA) 是一种位于前列腺细胞膜上的II型跨膜糖蛋白，由750个氨基酸组成，分为胞内区（氨基酸 序列为1-18)、跨膜区（19-43)和胞外区（44-750)，相对于传统用于临床检测的前列腺特异 抗原(prostate specific antigen，PSA)，是一种更加敏感和特异的前列腺癌肿瘤标记物， 尤其是在激素难治性前列腺癌及前列腺癌转移灶中均为高表达，在区分前列腺癌和其他类 型恶性肿瘤的敏感度和特异性分别为65.9%和94.5%。另外，在多种非前列腺来源的实体 瘤，如肺癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和结直肠癌等，PSMA也高度特异地表达于肿瘤血管 内皮细胞上。而且本身具有神经羧基肽酶和叶酸水解酶的活性，加之707个氨基酸组成的胞 外区能够提供多个抗原表位等特点，使其成为了肿瘤免疫靶向治疗和分子影像学中重要的 研究靶点。
[0004] 目前，人们发现了多种针对PSMA亦制备了多种能与其发生特异性结合的物质，包 括单克隆抗体7E11、J591，适体A9和AlO，重组技术得到的ScFv抗体D7、Fab抗体及人源化抗 体的报道特别是已经通过美国FDA批准用于前列腺癌的诊断和晚期核素治疗的IllIn-喷地 肽，就是基于针对PSMA的单克隆抗体与放射性核素相连而成。但与单域重链抗体相比，这些 配体存在生产成本相对较高，制备过程复杂等缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，可以被用于制备 检测前列腺特异性膜抗原的试剂和工具。
[0006] 本发明提供一个针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体（即本发明一种能特异 结合前列腺特异性膜抗原胞外区的单域重链抗体），具有SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列， 其氨基酸序列可通过标准化的抗体氨基酸序列编号方法(ImMunoGeneTics，IMGT)进行编号 和结构域的划分。
[0007] 本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含框架区中的一个或者两个以上的氨 基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有90 %同源性。
[0008] 本发明提供一种蛋白质或多肽，其特征是包含互补决定区中的一个或者两个以上 的氨基酸序列，且至少与一个氨基酸序列具有80 %同源性。
[0009] 本发明提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.: 1，通过遗传密码子可以随 时获得该核酸分子的具体序列。该核酸分子的序列如SEQ ID NO. :2。
[0010]本发明还提供一个核酸分子，其特征是编码SEQ ID NO.: 1部分结构域，通过遗传 密码子可以随时获得该核酸分子的具体序列。
[0011] 本发明所提供的核苷酸序列或者至少部分序列可以通过合适的表达系统进行表 达以得到相应的蛋白质或多肽。这些表达系统包括细菌，酵母菌，丝状真菌，动物细胞，昆虫 细胞，植物细胞，或无细胞表达系统。
[0012] 本发明还提供一种载体，包含所述核酸序列。由于遗传密码子具有简并性，该核酸 序列可以根据不同的应用目的而不同。
[0013] 本发明还提供一种宿主细胞，包括所述蛋白质或表达载体。
[0014] 本发明还提供一种检测细胞上前列腺特异性膜抗原的方法，其特征是含有上述蛋 白质或多肽。基于本发明提供的蛋白质或多肽与前列腺特异性膜抗原特异性结合的能力， 建立前列腺特异性膜抗原的检测方法。其中，优选的方法包括酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)，焚光免疫法（Fluoroimmunoassay，FIA)，免疫芯片 法，亲和层析法和免疫层析法。
[0015] 本发明针对前列腺特异性膜抗原单域重链抗体在非疾病诊断治疗目的免疫检测、 以及菌体或抗原富集纯化中的应用。
[0016] 本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造， 能够获得性质(水溶性、稳定性、亲和力以及特异性等)更好的突变体，用来发展进一步用于 医药、工业、农业的蛋白质或多肽。
[0017] 本发明还涉及一种针对前列腺特异性膜抗原的免疫亲和吸附材料，包括载体，搭 载在载体上的配基，该材料以针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体作为配基，所述针 对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体具有SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。所述载体为 磁珠、琼脂糖凝胶微球、硅胶微球或多孔材料。
[0018] 本发明所叙述的一些术语具有如下含义：
[0019] 同源性:描述两个或更多氨基酸序列的相似程度，第一个氨基酸序列和第二个氨 基酸序列之间同源性的百分比可以通过【第一个氨基酸序列中与第二个氨基酸序列中相应 位置处的氨基酸序列相同的氨基酸残基的数量】除以【第一个氨基酸序列中氨基酸总数】在 乘以【100%】来计算，其中第二个氨基酸序列中的某个氨基酸的缺失、插入、替换或添加(与 第一个氨基酸相比）被认为是有差别。备选地，同源性百分比也可以利用已知的用于序列匹 配的计算机运算程序如NCBI Blast获得。
[0020] 结构域:蛋白质三级结构的基本结构单位，通常具有一定的功能。
[0021 ] IMGT编号：IMGT数据库（The International ImMunoGeneTics Datbase)中的一种 已经标准化的抗体氨基酸序列编号方法。具体编号方法可以参考文献（E h r e n m a η，F ·， Q.Kaas,et al . ( 2010 ) .，! IMGT/3D structure-DB and IMGT/DomainGapAl ign ： a databaseand a tool for immunoglobulins or antibodies ?T cell receptors，MHC， IgSF and MhcSF/'Nucleic Acids Res 38(Database issue)：D301-307.Lefranc,M.P., C.Pommie，et al · (2003) ·''IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-Iike domains"Dev comp Tmmunol 27(1) :55_77.http://www. imgt.org/)中的描述。
[0022] 密码子(codon):又称为三连体密码子(triplet code)，指对应于某种氨基酸的核 苷酸三联体。在转译过程中决定该种氨基酸插入生长中多肽链的位置。
[0023] 本发明的有益效果:本发明针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体或多肽具有 与前列腺特异性膜抗原特异性结合、可以通过生物学方法大规模生产、成本低、高效、分子 量小、渗透性好等性质，显示出良好的应用前景。
【附图说明】
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