抗epor融合蛋白抗体的制备方法和用图
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，尤其涉及抗EPOR融合蛋白抗体的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)是一种糖蛋白激素，属于细胞因子超家族 成员们作为一种造血生长因子，他与促红细胞生成素受体（erythropoiet inreceptor， EP0R)结合，在红细胞的生产中发挥重要的作用。
[0003] 促红细胞生成素（erythropoietin，ΕΡ0)的生物学效应是通过其特殊的细胞表面 受体-促红细胞生成素受体(6巧1：111'〇?〇丨61^11代〇6?1：〇1^?010来调节的。促红细胞生成素受 体(erythropoietinreceptor，EP0R)是一种含有508个氨基酸残疾的额狂魔蛋白，分子量为 66kDa，由胞外配体结合域、跨膜域及胞内域三个部分组成，近年研究表明EPO及其受体同样 存在于许多非红系的肿瘤细胞系中，EPO及EPOR的表达在多种人类肿瘤中被发现，包括乳腺 癌、肾细胞癌、前列腺癌、结肠癌、头颈部鳞状上皮细胞癌等等。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种促红细胞生成素 受体抗体，可以抑制促红细胞生成素-促红细胞生成素受体通路活性的影响，从而阻断促红 细胞生成素-促红细胞生成素受体表达的肿瘤。
[0005] 为实现本发明的目的，本发明第一方面提供一种抗EPOR融合蛋白的抗体，其可抑 制或阻断EP0-EP0R通路，是由具有如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的融合蛋白免疫动物 获得。
[0006] 其中，所述融合蛋白是由组氨酸信号肽及位于人体EPOR蛋白的第25位到254位氨 基酸残基组成。
[0007] 特别是，所述EPOR融合蛋白通过真核表达获得。
[0008]尤其是，所述EPOR融合蛋白是通过转染到人体肾上皮细胞表达得到。
[0009 ]优选地，所述人体肾上皮细胞为HEK-293细胞。
[0010]为实现本发明的目的，本发明第二方面提供一种抗EPOR融合蛋白的基因，其编码 第一方面所述的融合蛋白，包括如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0011]为实现本发明的目的，本发明第三方面提供一种重组载体，在其进行有效连接过 程中，具有第二方面所述的基因。
[0012] 其中，所述重组载体是利用真核表达载体pcDNA3 · I ( + )-myc-His_C mammalian expression vector得到。
[0013] 为实现本发明的目的，本发明第四方面提供一种宿主细胞，其含有第三方面所述 的重组载体。
[0014] 为实现本发明的目的，本发明第五方面提供一种化合物，包括第一方面所述的抗 EPOR融合蛋白的抗体，应用于抑制或阻断EP0-EP0R通路药物的制备。
[0015]为实现本发明的目的，本发明第六方面提供一种将第一方面所述的抗EPOR的抗体 作为制备治疗肿瘤药物的应用。
[0016] 为实现本发明的目的，本发明第七方面提供一种制备抗EPOR融合蛋白的抗体，由 以下步骤制备获得：
[0017] 将信号肽及EPOR外段肽通过PCR的方法依次连接到真核表达载体中并转染至宿主 细胞进行表达，获得EPOR融合蛋白；
[0018] 纯化所述EPOR融合蛋白，并进行质谱鉴定；
[0019]将鉴定正确的EPOR融合蛋白免疫动物，获得具有抗EPOR融合蛋白的抗血清；
[0020]纯化所述抗血清，得到抗EPOR融合蛋白的抗体。
[0021] 其中，所述真核表达载体为pcDNA3 · I ( + )-myc-His_C mammalian expression vector。
[0022] 其中，所述宿主细胞为人体肾上皮细胞HEK 293细胞。
[0023] 本发明的有益效果体现在：
[0024] 1、本发明提供的抗EPOR融合蛋白的抗体可以有效抑制EPO-EPOR通路，从而阻断 EPO-EPOR通路活性引起的肿瘤表达，在依赖EPO生长的UT-7细胞及经典的肾肿瘤细胞系中 可以明显看出本申请提供的多克隆抗体不同程度的抑制的细胞的发生，因此本申请提供的 多克隆抗体及具有表达所述多克隆抗体的基因可以用于制备治疗肿瘤药物的应用。
[0025] 2、本发明利用人体肾上皮细胞作为宿主细胞，制备得到的抗EPOR融合蛋白的多克 隆抗体纯度高，与抗原的结合能力强，效价高，稀释倍数达到256000时，依然可以检测得到 有效抗体。
【附图说明】
[0026]当结合附图考虑时，通过参照下面的详细描述，能够更完整、更好地理解本发明以 及容易得知其中许多伴随的优点。此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构 成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明 的不当限定，如图，其中：
[0027]图1是实施例3所述的纯化后的重组EPOR融合蛋白的质谱测序鉴定结果图，图中表 示蛋白大小为35-36kDa;
[0028]图2是实施例4中所述的血清效价检测结果的显色图，图A表示三免后抗血清效价 检测显色图；图B表示四免后抗血清效价检测显色图；图C表示终放血后抗血清效价检测显 色图；图D是终放后抗血清纯化抗体效价检测显色图，图中I、Π 表示两次重复；
[0029]图3是实施例5所述的抗EPOR融合蛋白抗体的鉴定结果图；
[0030]图4是实施例6所述的抗EPOR融合蛋白抗体抑制EPO-EPOR通路活性的结果图；其中 图E是抗EPOR融合蛋白抗体对不同细胞系的通路活性抑制效果图、图F是不同作用时间下通 路活性抑制效果图、图G是不同抗体浓度下通路活性抑制效果图；
[0031 ]图5是实施例7所述的抗EPOR抗体对肿瘤细胞生长的影响的结果图；其中，图H是抗 EPOR抗体对UT-7细胞增殖的影响结果图、图I是抗EPOR抗体对caki-Ι肾癌细胞增长的影响 结果图。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033] 实施例1:重组EPOR表达质粒的构建
[0034] 1、表达信号肽Osteonectin及组氨酸6-His标签准备
[0035]采用正常人基因组DNA为模板，通过常规PCR扩增表达信号肽Osteonectin序列，其 中，所用上游引物带有HindIII酶切位点，碱基序列为agct Aagctt gcctgccgcctgcctgcct， 如SEQ ID NO. 4所示，下游引物带有BamiH酶切位点及6个His (组氨酸）序列，碱基序列为 agct ggatcc gtgatggtgatggtgatgca gctgaggggctgccaagg，如SEQ ID ΝΟ.50Τ7]ν〇 [0036]其中，所述表达信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0037]根据HUMAN EPOR的氨基酸序列扩增EPOR基因片段，并经过1%浓度的琼脂糖凝胶 电泳后回收，得到扩增后的EPOR基因片段。将EPOR基因片段和真核表达载体pcDNA3.1( + )_ myc-His-C mammalian expression vector米用HindIII与BamHI内切酶酶切后连接，得到 重组质粒pcDNA3 · I( + )-myc-His_C mammalian expression vector-〇steonectin_6His，并 将重组质粒转化大肠杆菌DH5a，获得重组菌DH5a/〇steonectin-6His。经PCR筛选阳性克隆 并进行DNA测序，验证后，得到构建正确的重组质粒DH5a/〇steonectin_6His 〇 [0038] 2、表达人EPOR外段肽重组质粒制备
[0039]采用正常人基因组DNA为模板，通过常规PCR扩增人EPOR外段肽序列，所用上游引 物带有BamHI酶切位点，序列