重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法与流程

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法。

背景技术：

布鲁氏菌病(brucellosis，简称布病)由布鲁氏菌(brucella)引起，主要感染反刍动物和人类，也可感染鹿、犬类等，全球大部分地区均有布鲁氏菌病感染的报道。

动物患布病会引起怀孕动物流产，产奶量下降和不育等一系列问题，对经济影响非常大，特别是在发展中国家。绝大多数布鲁氏菌都可以感染人，并引起严重的疾病，不仅需要配合抗生素的治疗，而且治疗时间相对较长，遗留下来的后遗症通常相对严重。布病的传播使得畜牧业的发展和人类健康受到严重影响，全世界每年新发感染人数大约为50万人，在世界二百多个国家和地区中报告有人畜疫情的国家有170多个，因此，在布病流行的国家，消除布病一直是人们一直以来都想要实现的目标。致病机理(包括胞内寄生机理)以及免疫机理尚不十分清楚是布鲁氏菌病研究过程中的一个瓶颈，导致其防控存在一定的难度。

脂多糖(lipopolysaccharides，lps)广泛存在于革兰氏阴性细菌中，对于革兰氏阴性细菌外膜的结构和功能完整性至关重要，可以引起哺乳动物免疫反应。布鲁氏菌的lps是其主要的毒力因子。目前，布鲁氏菌lps合成的途径并不完全清晰，已经发现的与布鲁氏菌lps合成相关的主要基因编码产物有过骨胺合成酶(per)、磷酸甘露糖变位酶(pmm或mab)、甘露糖基转移酶2(wbka，wbda，badc)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)和转运载体(wzt和wzm)。其中wzt基因是布鲁氏菌lps合成中的关键基因，与wzm等基因共同组成布鲁氏菌abc转运系统。abc转运系统是细菌中由一系列同源基因编码的操纵子组成的细胞转运机器，所说的操纵子由atp结合蛋白、膜蛋白、亚基结合蛋白三部分构成。abc转运系统参与胞外多糖的合成，并且能够运输膜外生物大分子。此外，abc转运系统在细菌营养成分的运输、毒力分子的外排等过程中也起着至关重要的作用。然而abc转运系统对细菌毒力、免疫原性及蛋白质表达的影响尚不清楚。

genbank中记录的wzt基因的功能为水解atp释放出能量，同时将ops侧链转移到外膜上进而形成光滑型lps。研究发现，wzt基因的缺失会造成lps的合成受阻，但其性质及如何参与lps合成的机制尚未见报道。

技术实现要素：

为了填补应用重组wzt蛋白制备特异性多克隆抗体的空白，本发明提供一种重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体，它是利用重组wzt蛋白作为抗原，对雌性家兔进行四次免疫后再经纯化处理后获得的。

本发明还提供了上述重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、初次免疫

将500μg重组wzt蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点100μg重组wzt蛋白；

步骤二、二次免疫

在初次免疫的一周后进行二次免疫，将400μg重组wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组wzt蛋白；

步骤三、三次免疫

在二次免疫的一周后进行二次免疫，将400μg重组wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组wzt蛋白；

步骤四、四次免疫

在三次免疫的一周后进行二次免疫，将400μg重组wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组wzt蛋白；

步骤五、每次免疫后采集雌性家兔耳静脉血，以未进行免疫时的兔血清为对照、纯化后重组wzt蛋白为抗原，应用间接elisa法检测兔血清抗体效价，血清稀释倍数分别为100、200、400、1600、3200、6400；

步骤六、第四次免疫一周后，采集兔全血，将收集的兔全血在37℃静置2h，4℃静置过夜，次日4000rpm、离心10min收集上清，得到兔血清；

步骤七、纯化

(1)将上述所得兔血清与等体积的抗体结合缓冲液混合后过滤；

(2)用10倍柱体积的抗体结合缓冲液平衡proteina柱子，将上述过滤后的兔血清打入到柱子中；

(3)用抗体结合缓冲液清洗柱子，洗脱杂蛋白，直至流出的下液中不含有蛋白成分；

(4)用抗体洗脱液过柱，洗脱抗体，收集流出的下液，并用ph9.0的tris-hcl调节ph至中性，收集重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体。

作为优选的实施例，所述重组wzt蛋白采用以下方法制备：

步骤一、构建重组克隆质粒pmd-19t-wzt

(1)对genbank中记录的wzt基因序列进行优化处理，将目的基因片段与克隆载体pmd-19t(simple)连接，构建重组克隆质粒pmd-19t-wzt；

(2)对重组克隆质粒pmd-19t-wzt进行转化处理；

(3)对转化后的重组克隆质粒pmd-19t-wzt进行提取；

(4)采用pcr、双酶切、测序对重组克隆质粒pmd-19t-wzt进行鉴定；

步骤二、构建重组表达载体pet-21b-wzt

(1)挑选测序结果正确的重组克隆质粒pmd-19t-wzt进行ndei和xhoi双酶切、凝胶回收后得到目的基因片段，目的基因片段与克隆载体pet-21b用t4dna连接酶进行连接，4℃过夜孵育，构建重组表达载体pet-21b-wzt；

(2)对重组表达载体pet-21b-wzt进行转化；

(3)对转化后的重组表达载体pet-21b-wzt进行提取；

(4)采用pcr、双酶切对重组表达载体pet-21b-wzt进行鉴定；

步骤三、重组wzt蛋白的诱导表达

在菌液od600＝1时，加入终浓度为lmm的iptg，33℃诱导14h后，获得含有重组wzt蛋白的菌液，wzt蛋白分子量为27kda；

步骤四、目的蛋白的纯化

收集诱导表达后的菌体，超声破碎后，在4℃、12000rpm离心45min，过滤上清，用histrapff亲和层析柱纯化目的蛋白，依次经洗脱、洗涤、平衡、上蛋白、洗脱杂蛋白、洗脱目的蛋白后得到纯化的重组wzt蛋白，纯化后重组wzt蛋白的纯度为93％，回收率为2％；对纯化的重组wzt蛋白进行sds-page和westernblot分析；

步骤五、纯化后重组wzt蛋白的n端测序鉴定

采用基于edman降解法的n端序列分析方法对纯化后重组wzt蛋白进行n端分析，测得纯化后重组wzt蛋白n端序列为：

nh2-met-ile-gln-pro-ser-ile-thr-leu-ser-asn，与目标蛋白n端序列一致。

本发明的有益效果是：

本发明对wzt基因的密码子进行了优化，将优化后的基因片段与克隆载体pmd-19t(simple)相连，经测序和酶切验证正确后，将双酶切后获得的目的基因片段与同样经双酶切的表达载体pet-21b相连构建重组表达质粒，转化至表达大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞中，表达重组wzt蛋白，其大小约为27kda；应用亲和层析的方法用镍柱对目的蛋白进行纯化，经测定，目的蛋白的纯度为93％，蛋白回收率为2％；对纯化的目的蛋白进行n端测序验证，结果与genbank中记录的wzt蛋白的氨基酸序列一致，说明所表达的是wzt蛋白。

通过试验证明重组wzt蛋白对小鼠淋巴细胞增殖百分数影响比cona高40％，可以刺激机体产生igg抗体，抗体效价在第四周达到最高，最高值为1:4200，但抗体从第五周开始消失较快。

利用重组wzt蛋白作为抗原制备的重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体特异性良好，可用于检测布鲁氏菌wzt蛋白。

附图说明

图1为重组克隆质粒pmd-19t-wzt的pcr扩增电泳结果。图1中，m：dl2000dna分子量标准；1：pmd-19t-wztpcr产物。

图2为重组克隆质粒pmd-19t-wzt的双酶切电泳结果。图2中，m：dl5000dna分子量标准；1：pmd-19t-wzt双酶切产物。

图3为重组表达载体pet-21b-wzt的pcr扩增电泳结果。图3中，m：dl2000dna分子量标准；1：pet-21b-wztpcr产物。

图4为重组表达载体pet-21b-wzt的双酶切电泳结果。图4中，m：dl10000dna分子量标准；1：pet-21b-wzt双酶切产物。

图5为重组质粒表达产物sds-page分析结果。图5中，m：预染蛋白分子量标准；1-8：iptg诱导pet-21b-wzt2h、4h、6h、8h、12h、14h、18h、24h后的菌液；9：未诱导菌液。

图6为重组质粒表达产物sds-page分析结果。图6中，m：预染蛋白分子量标准；1-6：iptg终浓度：0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、1.8mm、2.0mm；7：未诱导菌液。

图7为重组质粒表达产物sds-page分析结果。图7中，m：预染蛋白分子量标准；1-5：pet-21b-wzt诱导温度：26℃、28℃、30℃、33℃、37℃；6：未诱导菌液。

图8为重组菌株表达产物可溶性sds-page分析结果。图8中，m：非预染蛋白分子量标准；1：超声破碎沉淀；2：超声破碎上清。

图9为纯化后蛋白的sds-page分析结果。图9中，m:非预染蛋白分子量标准；1：wzt蛋白超声上清；2:杂蛋白洗脱；3-6：纯化后蛋白。

图10为表达产物的westernblot分析。图10中，m：预染蛋白分子量标准；1：pet-21b-wzt在大肠杆菌bl21(de3)中的表达产物。

图11为重组wzt蛋白n端测序结果(按测得氨基酸先后顺序排列)。

图12为重组wzt蛋白刺激小鼠淋巴细胞增殖结果。

图13为重组wzt蛋白免疫小鼠血清抗体igg效价结果。

图14为重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体特异性检测结果。m：预染蛋白分子量标准；1：牛布鲁氏菌s19菌株；2：wzt基因缺失s19菌株；3：wzm基因缺失s19菌株；4：绿脓杆菌；5：粪肠球菌；6：缓慢葡萄球菌；7：鹑鸡肠球菌；8；奇异变形菌；9：纯化后wzt蛋白。

具体实施方式

一、材料

1、菌株和质粒

wzt基因由上海生工有限公司合成。

pmd19t(simple)载体购自宝生物(大连)公司。

模板pet21b-wzt、原核表达载体pet-22b、dh5α克隆感受态细胞和bl21(de3)感受态细胞由吉林农业大学生命科学学院代谢工程与合成生物学实验室保存。

2、主要试剂

3、主要仪器

二、重组wzt蛋白的制备

1、重组克隆质粒pmd-19t-wzt的构建

(1)大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备

①从-80℃冰箱中取出e.colidh5α原始菌株，于lb固体平板上划线培养并挑取单个菌落，接种于5mllb液体培养基中，37℃、150rpm、振荡培养12h，将培养得到的菌液按照1:1000的体积比接种于100mllb液体培养基中，37℃、150rpm、振荡培养至od600为0.4～0.5。

②将培养得到的菌液收集至50ml离心管中，冰浴处理30min，4℃，6000rpm离心8min。

③弃去上清，用事先在冰浴中预冷的0.1mol/lcacl2溶液悬浮收集的菌体，4℃，6000rpm离心8min，该步骤重复一次。

④弃去上清，加入4ml预冷的cacl2溶液悬浮收集的菌体，混匀后每个离心管内加入1.6ml事先预冷的灭菌甘油，混匀，将其分装与1.5mlep管中，每管100μl，存放于-80℃冰箱中备用。

(2)目的基因片段与克隆载体pmd-19t(simple)连接

根据genbank中记录的wzt基因序列，应用大肠杆菌偏好的密码子对其进行优化，将优化序列送至上海生工生物公司进行合成。

将合成的目的基因片段与克隆载体pmd-19t(simple)连接，4℃恒温孵育过夜，构建重组克隆质粒pmd-19t-wzt，连接体系如下表所示。

(3)重组克隆质粒pmd-19t-wzt的转化

从-80℃冰箱中取出大肠杆菌dh5α感受态细胞，冰浴复苏后加入重组克隆质粒pmd-19t-wzt，将10μl连接产物用移液器加入50μl大肠杆菌dh5α感受态细胞中，冰浴30min，42℃水浴热击45s，之后立即冰浴5min(该过程中不要剧烈摇动ep管)。将200μl无抗性lb液体培养基加入其中，振荡培养1h，条件为37℃，200rpm条件下摇床振荡培养。将培养好的菌液取出100μl均匀涂布于含有amp抗性的lb固体培养基中，在37℃培养箱中恒温培养10～12h，直至得到大小相对均一、边缘较光滑的白色菌落。

(4)重组克隆质粒pmd-19t-wzt的提取

用镊子夹取无菌小枪头挑取平板上的单菌落置于5ml含有amp抗性的lb液体培养基中，于摇床中37℃，200rpm振荡培养过夜。重组克隆质粒pmd-19t-wzt提取步骤如下：

①收集过夜培养的菌液，13000rpm离心1min，弃去上清。

②每管加入250μl的solutioni，吹打混匀菌体。

③每管加入250μl的solutionii，盖上ep管，轻轻翻转数次，直至管内液体变得相对澄清，此步骤不宜超过5min。

④每管加入350μl的solutioniii，盖上ep管，轻轻翻转7～8次，13000rpm离心10min。

⑤收集离心后得到的上清，吸取上清至柱子中，12000rpm离心1min，弃去下液。

⑥向制备管中加入500μl的bufferw1，12000rpm离心1min，弃去下液。

⑦向制备管中加入700μl的bufferw2，12000rpm离心1min，弃去下液。

⑧重复步骤⑦一次。

⑨将制备管以12000rpm空离1min，弃去下液。

⑩向制备管中加入40μl的eluent溶液，常温静置1min，12000rpm离心1min，将提取的重组克隆质粒pmd-19t-wzt置于-20℃冰箱保存备用。

(5)重组克隆质粒pmd-19t-wzt的鉴定

①pcr鉴定

根据优化后序列，应用primerpremier5.0软件设计引物，由上海生工有限公司合成，引物序列如下：

上游引物-p1：5'-catatgatccagccatccattaccct-3'(下划线部分为ndei酶切位点)；

下游引物-p2：5'-ctcgagcgcaatcgcgcccat-3'(下划线部分为xhoi酶切位点)。

以提取的不同重组克隆质粒为模板进行pcr鉴定，pcr反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸40s，72℃终延伸10min，pcr反应体系如下表所示，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

pcr鉴定结果：以提取的不同重组克隆质粒为模板，p1、p2为引物pcr扩增得到约750bp大小的条带，结果见图1，结果符合预期。

②双酶切鉴定

用限制性内切酶ndei和xhoi对提取的重组克隆质粒pmd-19t-wzt进行酶切鉴定，双酶切反应体系如下表所示，37℃金属浴2h，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

双酶切鉴定结果：用ndei、xhoi双酶切重组克隆质粒pmd-19t-wzt，得到一条约2500bp和一条约750bp大小的条带，如图2所示，结果符合预期。pcr鉴定和双酶切鉴定结果都与预期结果一致，成功构建了重组克隆质粒pmd-19t-wzt。

③测序鉴定

将经过pcr鉴定和双酶切鉴定结果均正确的重组克隆质粒pmd-19t-wzt送至上海生工有限公司进行测序，将测序结果与优化后序列进行比对，结果完全一致。

2、重组表达载体pet-21b-wzt的构建

(1)大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞的制备

从-80℃冰箱中取出bl21(de3)菌株，划线培养并挑取单菌落，制备方法按照上述第二部分第1步中的“(1)大肠杆菌dh5α感受态细胞的制备”方法进行。

(2)目的基因片段与克隆载体pet-21b的连接

挑选测序结果正确的重组克隆质粒pmd-19t-wzt进行ndei和xhoi双酶切，双酶切体系如下表所示，1％琼脂糖凝胶电泳检测。

在切胶仪下切取含有目的基因片段的琼脂糖凝胶置于离心管中，使用dna凝胶回收试剂盒进行回收，操作步骤如下：

①计算凝胶重量，将这一重量作为一个凝胶的体积(例：100mg＝100μl)。

②向其中加入三倍凝胶体积的bufferde-a，将离心管置于75℃水浴中加热溶胶，该过程中每2～3min颠倒一次离心管，随时观察溶胶情况直至胶完全溶化。

③向离心管中加入0.5个bufferde-a体积的bufferde-b，用移液器吹打混匀。

④将步骤③离心管中的液体转移至制备管中，12000rpm离心1min，弃去下液。

⑤向制备管中加入500μl的bufferw1，12000rpm离心30s，弃去下液。

⑥向制备管中加入700μl的bufferw2，12000rpm离心1min，弃去下液。

⑦重复步骤⑥一次。

⑧将制备管12000rpm空离1min，弃去下液。

⑨向制备管中加入30μl的eluent溶液，常温静置1min，12000rpm离心1min，将回收的片段置于-20℃冰箱保存备用。

⑩将凝胶回收得到的目的基因片段与克隆载体pet-21b用t4dna连接酶进行连接，4℃过夜孵育，构建重组表达载体pet-21b-wzt，连接反应体系如下表所示。

(3)重组表达载体pet-21b-wzt的转化

将连接产物转化至e.colibl21(de3)感受态细胞中，涂布于含有amp抗性的固体lb培养基中，转化方法按照上述的第二部分第1步中的“(3)重组克隆质粒pmd-19t-wzt的转化”方法进行。

(4)重组表达载体pet-21b-wzt的提取

挑取培养的单个菌落接种于5ml的lb液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜后提取重组表达载体pet-21b-wzt，提取方法按照上述的第二部分第1步中的“(4)重组克隆质粒pmd-19t-wzt的提取”方法进行。

(5)重组表达载体pet-21b-wzt的鉴定

①pcr鉴定

以提取的不同重组表达载体为模板进行pcr鉴定，pcr鉴定方法按照上述的第二部分第1步中的“(5)重组克隆质粒pmd-19t-wzt的鉴定”方法进行。

pcr鉴定结果：以重组表达载体pet-21b-wzt为模板，p1、p2为引物pcr扩增得到约750bp大小的条带，结果如图3所示，结果符合预期。

②双酶切鉴定

将pcr鉴定结果正确的重组表达载体pet-21b-wzt用限制性内切酶ndei和xhoi进行双酶切鉴定，双酶切鉴定方法与“重组克隆质粒pmd-19t-wzt”的双酶切鉴定方法相同。

双酶切鉴定结果：用ndei、xhoi双酶切重组表达质粒pet-21b-wzt，得到一条约2500bp和一条约750bp大小的条带，如图4所示，结果符合预期。pcr鉴定和双酶切鉴定结果都与预期结果一致，成功构建了重组原核表达载体pet-21b-wzt。

3、重组wzt蛋白的诱导表达

(1)最佳诱导时间的确定

将活化鉴定正确的菌种置于液体lb(amp+)培养基中，于37℃摇床过夜培养，转速为200rpm，再按1:50的体积比接种于5ml含有amp抗性的lb液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养，随时检测菌液od600值，待od600值约为0.8～1.0时，加入iptg至终浓度为1mm，37℃、200rpm振荡培养，进行诱导表达，分别收集诱导后2h、4h、6h、8h、14h、16h、24h菌液，用同样的方法诱导空载体14h作对照。

在iptg终浓度lmm、温度37℃条件下，分别收集未诱导、诱导后2h、4h、6h、8h、14h、16h、24h菌液，经12％sds-page电泳分析。结果表明：在菌液od600＝1时，加入iptg终浓度为lmm，37℃诱导14h时，目的蛋白表达量较高，如图5所示，蛋白分子量约27kda。

(2)最佳诱导浓度的确定

在菌液待od600值为0.8～1.0时，加入终浓度分别为0.5mm、1mm、1.2mm、1.5mm、1.8mm、2.0mm的iptg，37℃、200rpm振荡培养，进行诱导表达，同时将未诱导菌液作为对照。

在温度37℃、诱导时间14h条件下，当od600＝1时，分别加入不同终浓度的iptg(0.5mm、0.8mm、1.0mm、1.5mm、1.8mm、2.0mm)，经12％sds-page电泳分析。结果表明：当菌液od600＝1时，在温度37℃、诱导时间14h的条件下，当iptg终浓度为1.0mm时，目的蛋白表达量最高，如图6所示。

(3)最佳诱导温度的确定

当od600值为0.8～1时，加入终浓度1mm的iptg，分别放入26℃、28℃、30℃、33℃、37℃摇床振荡培养14h进行诱导表达，同时将未诱导菌液作为对照。

在iptg终浓度lmm、诱导时间14h的条件下，当od600＝1时加入终浓度1mm的iptg，分别放入26℃、28℃、30℃、33℃、37℃摇床诱导14h，经12％sds-page电泳分析。结果表明：当诱导温度为33℃时，目的蛋白表达量最高，如图7所示。

按照上述确定的最佳诱导时间、最佳诱导浓度、最佳诱导温度对重组原核表达载体pet-21b-wzt进行诱导表达，在菌液od600＝1时，加入终浓度为lmm的iptg，33℃诱导14h后，获得含有重组wzt蛋白的菌液。

(4)目的蛋白sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)鉴定

①配制sds-page凝胶，配制方法如下表所示。

②将收集得到的菌液od600统一调整至0.7，取500μl菌液于4℃，12000rpm离心5min，弃上清，用高温灭菌的pbs吹打清洗菌体，然后4℃、12000rpm离心5min，弃上清，收集菌体。

③向菌体中各加入100μl1×sds-pageloadingbuffer，混匀，在沸水中煮10min，用于sds-page电泳。

④取出10μl上样，非预染蛋白质marker点样5μl，浓缩胶采用80v恒定电压，分离胶采用120v恒定电压，直至电泳完毕。电泳完毕取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色，微波加热30s，振荡30min，然后用脱色液脱色1h，期间更换两到三次脱色液，条带清晰后凝胶成像观察结果。

⑤sds-page鉴定结果：在大肠杆菌bl21(de3)中成功表达了大小约为27kda的目的蛋白。

(5)目的蛋白westernblot鉴定

①电转移：sds-page结束后，按照凝胶相同大小剪裁硝酸纤维素膜(pvdf膜)及滤纸10片，将pvdf膜在甲醇中浸泡10s，将处理好的pvdf膜、滤纸放在转膜缓冲液中浸泡30min。按如下的顺序安装：负极-滤纸(5片)-凝胶-pvdf膜-滤纸(5片)-正极，同时保证滤纸、pvdf膜、凝胶对齐，用玻璃棒轻轻地赶走气泡。接通电源，以恒压100v，电流不高于250ma的条件转印50min。

②封闭：1g脱脂奶粉溶于20mlpbst中制成封闭液，将转印好的pvdf膜置于封闭液中，室温在摇床上轻轻摇动1h对其进行封闭，期间用pbst洗涤3次，每次2～3min，封闭完成后弃去封闭液。

③与一抗结合：加入抗组氨酸标签的鼠单克隆抗体，抗体用封闭液稀释，工作浓度为1:500，4℃孵育过夜，一抗孵育完毕后，用pbst将膜清洗3次，每次约5min。

④与二抗结合：加入辣根过氧化酶标记的山羊抗鼠igg，抗体用封闭液稀释，工作浓度为1:5000，室温孵育2h，二抗孵育完毕后，用pbst将膜清洗3次，每次约5min。

⑤显色：向膜上加入底物邻苯二胺(dab)反应液，避光轻轻摇动几分钟，随时观察目的条带显现情况，待目的条带出现后，立即加入去离子水终止反应并扫描保存。

(6)目的蛋白的可溶性分析

收集诱导的菌液100ml，在4℃、12000rpm离心10min，弃去上清，用高温灭菌的pbs(ph7.5)吹打洗涤菌体4℃，12000rpm离心10min，弃去上清，重复洗涤一次，洗涤完成后加入超声裂解缓冲液10ml吹打混匀菌体，超声破碎菌体，超声条件为4℃，工作2s，间歇3s，持续15min功率保持在220w左右。取1ml超声破碎菌体溶液离心，取上清加入适量5×sds-pageloadingbuffer，沸水煮10min，sds-page检测目的蛋白的可溶性。诱导表达的重组菌液经超声破碎和离心后，取沉淀和上清进行sds-page分析，结果显示目的蛋白即重组wzt蛋白具有一定的可溶性，如图8所示。

(7)目的蛋白的纯化

收集菌体，超声破碎后4℃，12000rpm离心45min，上清用0.22μm滤膜过滤，然后用histrapff亲和层析柱纯化目的蛋白，按照洗脱、洗涤、平衡、上蛋白、洗脱杂蛋白、洗脱目的蛋白的步骤进行操作。对洗脱出的目的蛋白进行sds-page和westernblot分析，检查纯化效果并鉴定其是否可能是重组wzt蛋白。

诱导表达的重组菌液经超声破碎后取上清过镍柱纯化，纯化后分别取超声破碎上清、杂蛋白洗脱下液、纯化后蛋白进行sds-page分析，结果如图9所示，在27.0kda左右蛋白纯化有清晰条带，纯度较高。

sds-page后，将凝胶上的蛋白转移至pvdf膜上，以抗his标签的鼠单克隆抗体为一抗、hrp标记的山羊抗鼠igg为二抗，进行westernblot分析，如图10所示，在约27kda处有一条明显的蛋白印记，初步确定其可能为目的蛋白即重组wzt蛋白。

(8)纯化后重组wzt蛋白的n端测序鉴定

采用基于edman降解法的n端序列分析方法对纯化产物进行n端分析，按照第二部分第3步中的“(5)目的蛋白westernblot鉴定”的操作步骤，将纯化产物转移至pvdf膜上，取600μl、0.1％tfa溶液加入含pvdf膜的管中，放入恒温混匀器中600rpm振荡1min，去除上清，重复该步骤三次后将pvdf膜取出，待其自然晾干后剪切成0.5cm²大小后上样；将剪切好的pvdf膜放置到岛津全自动蛋白质多肽测序仪(ppsq-33a)反应器中进行测试，采用19种同样状态的氨基酸混合的标准品进行校准。

测序鉴定结果如图11所示，测得纯化后重组wzt蛋白n端序列为：

nh2-met-ile-gln-pro-ser-ile-thr-leu-ser-asn，与目标蛋白n端序列完全一致，说明表达和纯化得到的蛋白为目的蛋白即重组wzt蛋白。

应用bandscan进行灰度分析确定目的蛋白的纯度为93％，同时根据：回收率＝(蛋白浓度×蛋白溶液体积×纯度)/湿菌总重量×100％，计算得到蛋白的回收率为2％。

在不改变目的蛋白氨基酸及其排列顺序的前提下，应用大肠杆菌偏好的密码子对wzt基因进行优化，使得目的蛋白的表达量得到了明显的提高，与未优化的wzt基因的表达量相比提高了近两倍。优化蛋白诱导表达的时间、诱导剂浓度和温度，使目的蛋白在实验所设条件下能够最大程度的可溶性表达，为蛋白的纯化提供了先行条件。蛋白纯化过程中优化洗脱液中咪唑的浓度和结合液的使用量以及纯化体系，可以更好地去除杂蛋白，提高目的蛋白纯化效率。表达的蛋白经wsesternblot和n端测序进一步确定表达的蛋白为目的蛋白，为后续蛋白功能的探索奠定了基础。

三、重组wzt蛋白免疫原性试验

作为布鲁氏菌lps合成过程中的关键蛋白，wzt蛋白免疫原性的高低可以对研究布鲁氏菌lps合成通路起到一定的作用和启发。某一蛋白免疫机体后，测定其刺激机体产生的中和性抗体的水平可作为评价该蛋白免疫原性的依据。因此，本发明使用小鼠作为试验的动物模型，以免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖指数作为评判wzt蛋白免疫原性的标准。

1、抗原制备

利用上述制备的布鲁氏菌的重组wzt蛋白作为抗原蛋白，将纯化得到的重组wzt蛋白与等体积的弗氏完全和不完全佐剂混合进行乳化。

2、免疫方法

选取5周龄的雌性balb/c小鼠(体重18～20g)；将5周龄balb/c小鼠分为重组wzt蛋白免疫组和pbs组，每组7只；一只鼠一次免疫30μg重组wzt蛋白，共免疫3次，免疫间隔时间为两周。

3、小鼠脾淋巴细胞的制备

(1)将免疫后的小鼠处死，在75％的酒精中浸泡15min。

(2)向培养皿中加入5ml小鼠脾淋巴细胞分离液，将脾脏置于200目的尼龙筛网上并覆盖于培养皿上，小心研磨脾脏。

(3)取脾细胞悬液转移至15ml离心管中，rpmi-1640培养基，1000rpm离心10min。

(4)吸取800μl上清，转移至新的一个15ml离心管中，加入10ml培养基，800rpm离心5min，弃上清。

(5)加入5ml红细胞裂解液摇晃混匀，静置5min。然后800rpm离心5min，弃上清。

(6)加入10ml培养基吹打，在离心一次弃上清，计数后分装存放于-80℃冰箱中备用。

4、小鼠脾淋巴细胞转移实验(mtt法)

测取od值，计算免疫后小鼠脾淋巴细胞增殖率。计算公式如下：

淋巴细胞增值率＝(od-od1640)/(odpbs-od1640)

od为测取的od值，od1640为rpmi-1640培养基od值，odpbs为pbs的od值。

重组wzt蛋白刺激小鼠脾淋巴细胞增殖实验结果如图12所示，重组wzt蛋白浓度为5μg/ml，重组wzt蛋白对小鼠脾淋巴细胞增殖百分数影响比cona高40％。

5、利用间接elisa方法检测小鼠血清抗体效价

将6周龄balb/c小鼠分为重组wzt蛋白免疫组和pbs组，每组7只；间隔两周免疫一次，免疫剂量为30μg重组wzt蛋白，免疫3次；从免疫第2周开始进行断尾取血，并置于37℃培养箱中放置2.5h，吸出血清保存备用。

以纯化好的重组wzt蛋白作为抗原包被板子，包被条件为：100μl包被液、抗原终浓度5μg/ml、4℃过夜孵育；使用pbst洗涤多次，拍干后将血清按1:1000的体积比稀释后加入到包被好的板子中，每孔加入100μl，37℃孵育1h，免疫pbs的小鼠血清作为阴性对照，设立空白对照，做3个重复实验，pbst洗涤后每孔加入100μl经1:3000的体积比稀释后的二抗，37℃孵育0.5h，pbst清洗3次后，每孔加入100μlopd底物，室温下避光反应10min，反应结束后每孔加入50μl终止液终止反应，静置3min；在490nm波长处测定每孔od值，计算小鼠血清抗体的效价。

重组wzt蛋白免疫小鼠后用间接elisa方法检测小鼠血清抗体变化情况，小鼠血清抗体效价消长曲线如图13所示，重组wzt蛋白免疫小鼠后产生了抗体，抗体效价在第四周达到最高，最高值为1:4200，但抗体从第五周开始消失较快。

本发明检测免疫后小鼠血清抗体的效价，观察小鼠血清抗体igg效价的消长规律，以及wzt蛋白能够刺激机体产生的最高抗体效价值，最终得到在免疫了重组wzt蛋白后小鼠特异性体液免疫水平。

四、重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体的制备

1、选取健康雌性家兔进行免疫，初次免疫：将500μg重组wzt蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，在家兔背部进行皮下多点注射，每点100μg重组wzt蛋白。

2、二次免疫：一周后，将400μg重组wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组wzt蛋白。

3、之后每间隔一周进行三次和四次免疫，免疫方法与二次免疫方法相同。

4、每次免疫后采取家兔耳静脉血，以未进行免疫时的兔血清为对照，纯化后重组wzt蛋白为抗原，应用间接elisa法检测兔血清抗体效价，血清稀释倍数分别为100、200、400、1600、3200、6400。

5、第四次免疫一周后，用心脏取血法采集兔全血，将收集的兔全血在37℃静置2h，4℃静置过夜，次日4000rpm，离心10min，收集上清，得到兔血清。

6、纯化

(1)将兔血清与等体积的抗体结合缓冲液混合后，用0.22μm滤膜过滤。

(2)用10倍柱体积的抗体结合缓冲液平衡proteina柱子，将准备好的兔血清样品用注射器缓慢打入到柱子中。

(3)用抗体结合缓冲液清洗柱子，洗脱杂蛋白，直至流出的下液中不含有蛋白成分。

(4)用抗体洗脱液过柱，洗脱抗体，收集流出的下液，并快速用ph9.0的tris-hcl调节ph至中性，收集重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体。

(5)测定收集的重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体蛋白含量，进行适当浓缩，清洗柱子。

7、重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体特异性检测

将纯化得到的重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体作为一抗，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg作为二抗，应用westernblot方法检测牛布鲁氏菌s19菌株、wzt基因缺失s19菌株、wzm基因缺失s19菌株、绿脓杆菌、粪肠球菌、缓慢葡萄球菌、鹑鸡肠球菌、奇异变形菌和纯化后wzt蛋白。具体检测过程如下：

(1)电转移：按照凝胶相同大小剪裁硝酸纤维素膜(pvdf膜)及滤纸10片，将pvdf膜在甲醇中浸泡10s，将处理好的pvdf膜、滤纸放在转膜缓冲液中浸泡30min。按如下的顺序安装：负极-滤纸(5片)-凝胶-pvdf膜-滤纸(5片)-正极，同时保证滤纸、pvdf膜、凝胶对齐，用玻璃棒轻轻地赶走气泡。接通电源，以恒压100v，电流不高于250ma的条件转印50min。

(2)封闭：1g脱脂奶粉溶于20mlpbst中制成封闭液，将转印好的pvdf膜置于封闭液中，室温在摇床上轻轻摇动1h对其进行封闭，期间用pbst洗涤3次，每次2～3min，封闭完成后弃去封闭液。

(3)与一抗结合：加入抗组氨酸标签的重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体，抗体用封闭液稀释，工作浓度为1:500，4℃孵育过夜，一抗孵育完毕后，用pbst将膜清洗3次，每次约5min。

(4)与二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔igg，抗体用封闭液稀释，工作浓度为1:5000，室温孵育2h，二抗孵育完毕后，用pbst将膜清洗3次，每次约5min。

(5)显色：向膜上加入底物邻苯二胺(dab)反应液，避光轻轻摇动几分钟，随时观察目的条带显现情况，待目的条带出现后，立即加入去离子水终止反应并扫描保存。

检测结果如图14所示，结果显示重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体在相应位置处能够检测到牛布鲁氏菌s19菌株和wzm基因缺失s19菌株中的特异性条带，而在wzt基因缺失s19菌株泳道上并未发现相应的特异性条带，与绿脓杆菌、粪肠球菌、缓慢葡萄球菌、鹑鸡肠球菌和奇异变形菌在相应位置处未发生特异性反应，说明该抗体特异性良好，并且能够用于检测wzt蛋白。

利用proteina柱子纯化得到的重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体中包含的不仅仅有重组wzt蛋白相应的抗体，还包含兔血清中的全部igg，因此在westernblot试验中容易造成非特异结合和背景颜色较深等情况，因此采用重组wzt蛋白与柱子填料结合，用于纯化兔血清中的特异性重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体，进而提高抗体特异性。纯化后得到的特异性重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体可用于检测基因敲除菌株，也可以作为研究应用中的工具，检测人为和天然的wzt基因缺失的菌株，并为后续试验提供依据。

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步的详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和发明构思，做出相应改变和替代，而且得到与本发明具有相同氨基酸序列的多克隆抗体，其性能也必然相同，都应当视为本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>吉林农业大学

<120>重组wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法

<160>2

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工

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上游引物-p1：5'-catatgatccagccatccattaccct-3'（下划线部分为ndei酶切位点）。

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<211>21

<212>dna

<213>人工

<400>2

下游引物-p2：5'-ctcgagcgcaatcgcgcccat-3'（下划线部分为xhoi酶切位点）