一种抑制牛MEN1基因表达的siRNAs序列及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物遗传学和动物分子细胞生物学，提供了一种抑制牛MENl基因表 达的siRNAs序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 牛MENl基因与人或小鼠的MENl高度同源，其编码蛋白menin与人或小鼠的同源 性分别高达98. 69%和96. 73%。人或小鼠的研究成果暗示牛的MENl/menin在调节牛（奶 牛）机体正常代谢中的重要调节作用，推测其异常表达与牛的代谢紊乱疾病（酮病、酸中 毒、脂肪肝等）的发作有密切关系。近年来的研究表明，menin通过参与基因组蛋白表观遗 传学修饰进而影响下游基因的转录、还可与基因组蛋白质互作调苄基因组的稳定性、参与 调节细胞周期的调控因子而调控细胞的分裂增殖，其表达异常与白血病、糖尿病、（非酒精 性）脂肪肝等疾病密切相关。同时，MENl引发的癌变器官通常是激素分泌的重要器官，如 胰岛0细胞分泌胰岛素、垂体前叶分泌催乳素等，因而更突显menin在调控机体正常发育、 平衡稳态的机体代谢过程中的重要功能。目前，MENl/menin的许多研究者已经开始展望将 menin/MENl用于一些疾病的治疗。抑制细胞中MENl/menin的表达可以为研究者体外探索 揭示menin可调控的具体生物学活性和功能提供有效手段和工具，也为将来用于疾病的基 因治疗提供必要的研究基础。
[0003]RNA干涉（RNAinterference)技术是近几年发展起来的一种抑制基因表达的最 有力的工具之一。此技术采用19-23个碱基或发夹状不同长度的双链RNA引起序列同源 的mRNA降解，可使不同类型细胞的靶向基因表达明显降低，这个现象在进化过程中保守而 且广泛。这种新兴的生物技术用于抑制某些过度表达基因的表达，而不影响正常基因的表 达，在哺乳动物细胞中建立RNA干涉技术，可以用于研究某些特定基因的功能，从而可以解 决某些疾病的发病机制，而且为疾病分子水平的治疗提供了新的技术和方法，有一定的应 用价值。因此如何利用该技术实现抑制细胞中MENl/menin的表达成为研究的重点之一。
【发明内容】
[0004] 本发明的发明人在上述技术背景下，提供了提供了抑制牛MENl基因表达的 siRNAs，所述的siRNAs为小双链RNA，包括三个siRNAs，其正义链核苷酸序列为SEQNO. 4、 SEQNO. 5、SEQNO. 6所示；其反义链核苷酸序列为SEQNO. 7、SEQNO. 8和SEQNO. 9所示； 本发明提供了含上述正反义链的抑制牛MENl基因的siRNAs可以有效抑制牛MENl基因表 达，可为牛MENl基因功能的研究提供有效技术工具，并可用于牛代谢疾病的相关研究。
[0005] 本发明所提供的抑制牛MENl基因表达的siRNAs，所述的siRNAs为小双链RNA，包 括三个siRNAs，其正义链核苷酸序列为SEQNO. 4、SEQNO. 5、SEQNO. 6所示；其反义链核苷 酸序列为SEQNO. 7、SEQNO. 8 和SEQNO. 9 所示。
[0006] 上述序列是由如下过程获得的：
[0007]根据Genebank中牛MENl(BostaurusmultipleendocrineneoplasiaI)基因 完整mRNA序列（accessionNO. :NM_001076161)，选择三个靶序列，进而设计特异的可抑制 牛MENl基因表达的siRNAs。
[0008] 所选择的靶序列分别为：
[0009]核苷酸序列如 SEQNO. 1 :5' CCGITGACCTGTCTCTCTA3' 所示；
[0010]核苷酸序列如 SEQNO. 2 :5' CCACTGTCGTAACCGCAAT3' 所示；
[0011]核苷酸序列如 SEQNO. 3 :5' CCGAGTGACTACACGCTIT3' 所示；
[0012] 之后利用RNAoligo的TT末端法设计与合成上述三个靶序列对应的正义链和反 义链，其中正义链核苷酸序列依次为SEQNO. 4 :5'CCGUUGACCU⑶⑶⑶CUAdTdT3'所示；SEQ NO. 5 :5'CCACUGUCGUAACCGCAAUdTdT3' 所示；SEQNO. 6 :5'CCGAGUGACUACACGCUUUdTdT3' 所 示；
[0013] 其反义链序列为与相应正义链序列反向互补的序列，其链核苷酸序列依次为SEQ NO. 7 :3'dTdTGGCAACUGGACAGAGAGAU5 '所示；SEQNO. 8 :3'dTdTGGUGACAGCAUUGGCGUUA 5 '所示；SEQN0.9 :3'dTdTGGCUCACUGAUGUGCGAAA5 '所示。
[0014] 发明人在获得上述的正义链和反义链之后，利用其获得了本发明的主要目的基因 抑制牛MENl基因表达的siRNAs，具体方法如下：
[0015] 所述的正、反义链的序列经RNAoligo合成后，用DEPC水分别溶解为200yM的浓 度，通过退火形成双链RNA;之后等量的正、反义链RNAoligo与退火缓冲液（10X缓冲液： IOOmMTrisbase，lMNaCl，10mMEDTA)混合，在孵育热块上90°C2min后，关闭电源，自然冷 却退火至室温（约25°C);再次开启电源在90°C赋育2min后，自然冷却至室温，可直接用 于转染或放置于4°C暂时保存即可。
[0016] 经过上述退火后，即可获得三个siRNAs双链，其中：
[0017] (I)sibMEN-1:由正义链核苷酸序列SEQNO. 4和反义链核苷酸序列SEQNO. 7退火 形成；
[0018] (2)sibMEN-2:由正义链核苷酸序列SEQNO. 5和反义链核苷酸序列SEQNO. 8退火 形成；
[0019] (3)sibMEN-3:由正义链核苷酸序列SEQNO. 6和反义链核苷酸序列SEQNO. 9退火 形成。
[0020] 发明人进一步将上述获得的三个SiRNAs双链进行细胞转染，转然后利用实时荧 光定量RT-PCR检测牛MENlmRNA表达情况，结果发现三个siRNAs都可以有效抑制牛MENl 基因的转录，并且发现将三个siRNAs混合形成一个siRNAspool，即sibMEN-1/2/3转染细 胞后24h的干扰效率最高最佳。
[0021] 综上所述，本发明所提供的含上述正反义链的抑制牛MENl基因的siRNAs可以有 效抑制牛MENl基因表达，可为牛MENl基因功能的研究提供有效技术工具，并可用于牛代谢 疾病的相关研究。
【附图说明】
[0022] 图1为转染siRNAs后MENlmRNA表达情况柱状图，
[0023] 图2为针对sibMEN-1和sibMEN-1/2/3后MENlmRNA表达情况分析柱状图；
[0024]图3为转染sibMEN-1和sibMEN-1/2/3后menin蛋白的表达结果示意图；
[0025] 图4为转染sibMEN-1和sibMEN-1/2/3后menin蛋白的表达情况分析柱状图。
【具体实施方式】
[0026] 实施例I.siRNAs对应的RNA序列的合成
[0027] 根据序列表SEQNO. 4~9中提供的序列合成单链的RNAoligo,等比例两两搭配 (SEQNo. 4 和SEQNO. 7 ;SEQNo. 5 和SEQNO. 8 ;SEQNo. 6 和SEQNO. 9)分别与退火缓冲液 (10X缓冲液：100mMTrisbase，lMNaCl，10mMEDTA;pH7.4)混合，进而退火形成双链：在 孵育热块上90°C2min后，关闭电源，自然冷却退火至室温（约25°C);再次开启电源在90°C 赋育2min后，自然冷却至室温，可直接用于转染或放置于4°C暂时保存即可。
[0028]将序列SEQNo. 4 和SEQNO. 7 退火形成的siRNA记作sibMEN-1;SEQNo. 5 和 SEQNO. 8退火形成的siRNA记作sibMEN-2;SEQNo. 6和SEQNO. 9退火形成的siRNA记作 sibMEN-3。
[0029] 实施例2.牛乳腺上皮细胞转染
[0030] 细胞培养
[0031] 牛乳腺上皮细胞MAC-T用含有在10%FBS(GibiC〇,US.)、加有青链霉素双抗 (1% )和DMEM(GibicoTM，US.)培养基中，37°C，5%CO2的条件下培养两周后即处于对数生 长期的细胞进行转染，于转染前24h用不含双抗的培养基将细胞涂布于6-孔板中。
[0032] 细胞转染
[0033] 取生长状态良好、处于对数生长期的奶牛乳腺上皮细胞，用胰酶消化收集细胞，离 心后用完全培养基重悬，细胞计数后，以8.OXIO5个细胞/孔均匀接种于6孔板中，留待细 胞转染。细胞转染共分5组：①Control转染组；