专利名称：一种靶向抑制POLD1基因表达的siRNA序列的制作方法
—种靶向抑制P0LD1基因表达的siRNA序列
技术领域：
本发明涉及分子生物学与生物医药领域，尤其涉及一种靶向抑制POLDl基因表达的siRNA序列。
背景技术：
DNA复制是细胞正常分裂、增殖的关键一步。DNA聚合酶δ (ρο δ )是真核生物DNA复制的最主要复制酶，在哺乳动物细胞中，ρο δ由4个亚基组成，分别是ρ125、ρ50、ρ68、ρ12。ρ125亚基是它的催化亚基，具有5' -3'聚合酶活性和3' -5'核酸外切酶活性，这使该酶在DNA复制、修复、维持基因组稳定性、重组及细胞周期调控中都起到重要作用。癌的恶性增殖需要DNA的大量复制满足其持续的细胞分裂活动。近年来，ρο δ与细胞癌变之间的关系逐渐被研究者重视。国内外实验研究发现，Ρ125的表达与肝肿瘤的恶性程度、肿瘤细胞分化程度、静脉侵袭和肝内转移密切相关。Ρ125高表达的肝癌细胞系Ifep3B和H印G2 的侵袭能力明显强于P125低表达的Huh7细胞系。pl25的表达与POLDlmRNA(P0LDI是编码DNA聚合酶δ催化亚基ρ125的基因)表达呈正相关，在转录水平上沉默POLDl基因表达，能明显降低肝癌细胞的侵袭能力。POLDl基因是多种增殖性调控基因最终产生效应的基因，也可能自身的变化就是细胞癌变的重要原因。在肝癌细胞H印G2中，POLDl基因的第472密码子由酪氨酸突变为组氨酸；乳腺癌易感基因BRCA1/2的热点突变区就潜伏在POLDl基因上；P0LD1基因的突变使乳腺癌的发生率增加了 2倍。在小鼠体内将POLDl基因一个等位基因的ExoII功能区D400位点突变后，能够诱发小鼠淋巴癌及上皮癌。此外，在结肠癌、宫颈癌中也发现了 POLDl基因的高表达。因此，通过进一步研究阐明POLDl基因表达或pl25功能活性被抑制后直接阻断癌细胞增殖的机理，分离鉴定阻断癌细胞异常增殖的有效作用靶点，为新药开发提供最确切的理论依据。小RNA干扰(small interference RNA, RNAi)技术是近几年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法。RNAi作用的高度特异性，有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常等位基因功能，所以RNAi在基因治疗上有广阔的应用前景。RNAi作用机制是双链RNA(dsRNA)导入细胞后，在Dicer酶的作用下，降解为21_23bp，3’端带有2个突出碱基的siRNA,并与细胞内核酸内外切酶、解链酶、Argonaute蛋白等结合,形成具有多个亚单元的核糖核苷酸蛋白复合物-RISC(RNA-inducing silencing complex),高效递进式介导细胞内源性的同源mRNA的降解。哺乳动物细胞内，导入长双链RNA可导致基因表达广泛抑制，直接应用短双链的siRNA同样高效介导RNAi，并避免非特异性基因抑制效应。且短双链siRNA通过化学方法易合成，操作简便、转染效率高，对细胞的或者组织的毒副作用小，可大规模制备，临床应用方便，在药物开发方面具有不可替代的优势。但是，由于siRNA的碱基分布，两端自由能大小及靶mRNA的二级结构等因素的影响，靶向同一基因mRNA不同靶点的siRNA，封闭基因表达的效果明显不同。在siRNA沉默特定基因的实验中，为保证siRNA能高效降解靶mRNA，一般需要针对靶基因设计合成多条不同序列的siRNA，从中筛选出有效序列。有效siRNA序列的设计筛选是siRNA介导RNAi实验的关键点之一。
发明内容本发明要解决的技术问题在于提供一种靶向抑制人POLDl基因表达的siRNA序列，能闻效抑制POLDl基因的表达，从而抑制肿瘤的生长、增殖和运动转移，促进肿瘤细胞死亡。本发明是这样实现的一种靶向抑制人POLDl基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八条序列中的至少一条POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2 序列，其正义链为 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正义链为 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反义链为5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正义链为 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正义链为 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反义链为5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正义链为 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反义链为5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正义链为 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反义链为5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正义链为 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反义链为5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。进一步地，所述siRNA序列包括以下三条序列POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正义链为 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正义链为 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。进一步地，所述siRNA序列包括以下两条序列POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正义链为 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。本发明具有如下优点首先，POLDl基因是肿瘤基因治疗的良好靶点，应用siRNA介导的RNAi技术可以比以往的任何手段更高效、特异、方便的抑制靶基因的表达。本发明提供能高效抑制POLDl基因表达的siRNA序列，并作用于肿瘤细胞，检测POLDl siRNA抑制POLDl基因表达后，肿瘤细胞在增殖、运动转移、细胞周期等方面的变化，为POLDl siRNA应用于恶性肿瘤的临床
治疗奠定重要基础。其次，本发明提供能高效抑制POLDl基因表达的siRNA序列，为POLDl基因功能的进一步研究奠定重要基础，从而抑制肿瘤的生长、增殖和运动转移，促进肿瘤细胞死亡。通过研究癌细胞中对POLDl基因癌性表达和pl25功能活性癌性表现的抑制，寻找癌细胞增殖阻断的靶点，为发展最有效的新的抗癌或抗细胞增殖性疾病药物提供理论基础。
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。图I为MTT法检测POLDlsiRNA抑制癌细胞增殖结果图； 图2为荧光实时定量PCR检测POLDlsiRNA对POLDlmRNA表达的抑制作用结果图；图3A为蛋白质电泳图；图3B为P125蛋白质的相对表达量图。图4为显微镜观察细胞形态变化结果图；图5为HE染色观察细胞核形态变化结果图；图6为克隆形成实验结果图；图7为Transwell检测细胞运动转移能力结果图；图8为AnnexinV-PI双染流式细胞术检测凋亡结果图；图9为PI单染，流式细胞术分析细胞周期结果图。
具体实施方式本发明涉及一种靶向抑制人POLDl基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列包括下述八条序列中的至少一条POLDI s iRNAI 序列，其正义链为 5 ’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3 ’，其反义链 5 ’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正义链为 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA3 序列，其正义链为 5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反义链为5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正义链为 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，；P0LDlsiRNA5 序列，其正义链为 5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反义链为5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，；P0LDlsiRNA6 序列，其正义链为 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反义链为5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，；P0LDlsiRNA7 序列，其正义链为 5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反义链为5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，；P0LDlsiRNA8 序列，其正义链为 5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反义链为5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。较优的，所述siRNA序列包括以下三条序列POLDlsiRN Al 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA2 序列，其正义链为 5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正义链为 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。较优的，所述siRNA序列包括以下两条序列POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，；P0LDlsiRNA4 序列，其正义链为 5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。所述siRNA序列中的各正义链和反义链的3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰。本发明siRNA序列的获得方式如下根据生物信息学方法在genebank获取人POLDlmRNA序列(LOCUS NM_002691. 2)，采用RNA structure分析软件对POLDlmRNA序列的二级结构进行预测，总结以往提出的siRNA设计原则，综合分析其GC含量、两端自由能大小、mRNA作用位点的二级结构、siRNA对碱基偏爱性的要求等，设计siRNA系列。根据该软件对设计出的siRNA系列的评价，进一步采用NCBI GenBank(美国国立医学图书馆和美国国立卫生研究院编写)提供的BLAST软件，对选择的靶序列进行同源分析，排除siRNA非特异性地抑制其他基因片段的可能，初步筛选出8条siRNA序列，并委托上海吉玛制药技术有限公司代为合成上述8条siRNA序列。所述8条siRNA序列的碱基序列、作用位点、GC含量以及评估等级如表I所示。表I
权利要求
1.一种靶向抑制人POLDl基因表达的SiRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括下述八条序列中的至少一条 POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2序列，其正义链为5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，； P0LDlsiRNA3序列，其正义链为5’ CCACCUUCAUCCGUAUCAU3’，其反义链为5， AUGAUACGGAUGAAG⑶GG3，； P0LDlsiRNA4序列，其正义链为5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，； P0LDlsiRNA5序列，其正义链为5’ CAGACCCUCAAGGUACAAA3’，其反义链为5，UU腳ACCUUGAGG⑶CUG3，； P0LDlsiRNA6 序列，其正义链为 5’ GCCUGACUGAGGAUCAGUUCA3’，其反义链为5， UGAACUGAUCCUCA⑶CAGGC3，； P0LDlsiRNA7序列，其正义链为5’ GGUGGAGUCUAAGUACACA3’，其反义链为5， UGUGUACUUAGACUCCACC3，； P0LDlsiRNA8序列，其正义链为5’ GGACCAGGGAGAAUUAAUA3’，其反义链为5， UAUUAAUUCUCCCUGGUCC3，。
2.根据权利要求I所述的一种靶向抑制人POLDl基因表达的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括以下三条序列 POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA2序列，其正义链为5’ GUUGGAGAUUGACCAUUAU3’，其反义链为5， AUAAUG⑶CAAUCUCCAAC3，； P0LDlsiRNA4序列，其正义链为5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。
3.根据权利要求2所述的一种靶向抑制人POLDl基因表达的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列包括以下两条序列 POLDlsiRNAl 序列，其正义链为 5’ CCCACCAUCAGCCAUAGAU3’，其反义链 5’ 为AUCUAUGGCUGAUG⑶GGG3，； P0LDlsiRNA4序列，其正义链为5’ CCGGUUACAACAUCCAGAA3’，其反义链为5，UUCUGGA腳腳AACCGG3，。
4.根据权利要求I或2或3所述的一种靶向抑制人POLDl基因表达的siRNA序列，其特征在于所述siRNA序列中的各正义链和反义链的3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰。
全文摘要
本发明提供一种靶向抑制人POLD1基因表达的siRNA序列，所述siRNA序列的正义链和反义链的3’端均以UU或dTdT为悬垂修饰，将本发明作用于肿瘤细胞，检测POLD1基因被POLD1siRNA抑制后，肿瘤细胞在增殖、运动转移及细胞周期方面的变化，经实时荧光定量PCR及蛋白质免疫印迹方法检测，发现POLD1siRNA1、POLD1siRNA4可显著下调POLD1 mRNA及蛋白水平的表达，并在人小细胞肺癌NCI-H446细胞上验证了设计合成的POLD1 siRNA对肿瘤细胞增殖、运动转移等生物学特性的影响，为POLD1 siRNA临床应用于肿瘤的治疗奠定基础。
文档编号A61K48/00GK102911938SQ20121027650
公开日2013年2月6日 申请日期2012年8月3日 优先权日2012年8月3日
发明者许瑞安, 张均平 申请人:华侨大学