专利名称：：一种预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的寡聚核酸及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种抑制肿瘤起始和生长的微小RNA制剂及其应用。
背景技术：
：MicroRNAs(miRNAs)是一类分布广泛的非编码的小RNAs，通过与靶向序列的3'UTR(非翻译区)发生部分互补来调控基因表达。近年来，miRNA介导的转录后基因沉默与肿瘤形成的相关性已成为关注的热点。研究发现，肿瘤细胞与正常组织细胞间miRNA表达谱具有明显差异，且多数miRNA基因都位于肿瘤形成相关性脆弱基因位点，miRNA基因高频率地出现在这些和肿瘤密切相关的易变基因组环境中，提示miRNA在肿瘤的发生、发展和预后存在着密切的联系。事实上，有越来越多地miRNA作为原癌基因和肿瘤抑制基因被鉴定出来，运用miRNA抑癌基因的功能，可能会对肿瘤的基因治疗产生很大的影响，或可能模拟这一分子进行新药研发。肿瘤细胞在低氧环境，有某些miRNA表达出现差异。通过对鼻咽癌细胞芯片分析，鉴定了几条低氧调节下表达有明显变化的miRNA，其中mir-210是表达量变化最为明显的。
发明内容本发明的目的是提供一种预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的寡聚核酸。本发明所提供的预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的寡聚核酸，包括正义链和反义链，其特征在于所述正义链具有5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’序列，所述反义链具有5’-GACACGCACACUCGCCGACU-3’或5，-AGCCGCU⑶CACACGCACA⑶U-3，序列。所述寡聚核酸为化学合成，可以进行2'氟代(2'_F)、2'甲氧基(2'-OMe)、硫代(PS)和2'脱氧(2'-deoxy)化学修饰，修饰的寡聚核酸分子分别表示如下所述寡聚核酸-2'-F、所述寡聚核酸-PS、所述寡聚核酸-2'-OMe和所述寡聚核酸-2'-deoxy。所述寡聚核酸分子作用的靶序列具有序列表中SEQIDNo6和SEQIDNo7的核苷酸序列。用化学合成并修饰的上述寡聚核酸分子转染鼻咽癌细胞株(CNE)、宫颈癌细胞株Hela、肝癌细胞株H印G2、乳腺癌细胞株MCF7、肠癌细胞株HCT116等肿瘤细胞的实验结果表明所述寡聚核酸能有效抑制上述肿瘤细胞的增殖。生物效应半衰期的测试结果表明，与未修饰的寡聚核酸分子相比，化学修饰的寡聚核酸分子抑制E2F3表达的效应半衰期由未修饰前的2天延长到修饰后的5天。本发明的另一个目的是提供预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的药物组合物。该药物组合物包含上述寡聚核酸分子中的至少一种以及至少一种药学上可接受的载体。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明药物组合物中的双链RNA分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低药物组合物在抑制基因表达方面的效果。在一个优选实施例中，所述“药学上可接受的载体”是指体内转染试剂，如mPEG-PCL-PPEEA，脂质体，聚乙烯亚胺(PEI)等。可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的其他例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等，其中较佳的载体选自生理盐水、甘油和磷酸盐缓冲盐水。本发明的药物组合物可以制成各种医学上可接受的剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。本发明所述制剂是指口服液、注射齐U、舌下含服剂等多种液体剂型，或通过加以适当的赋形剂制备成片剂、胶囊剂等多种其他剂型。较佳的是，所述药物组合物的剂型选自注射剂、胶囊、舌下含服剂、口服液、气雾剂或贴剂。在本发明中还提供了一种制备上述药物组合物的方法，该方法包括将上述寡聚核酸分子中的至少一种与至少一种药学上可接受的载体相混合，从而获得所述药物组合物。寡聚核酸分子以及药学上可接受的载体之间的混合次序没有特别的限制。在一个优选实施例中，所述寡聚核酸与聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯(mPEG-PCL-PPEEA)的质量比为12030，该药物组合物中还可以包括葡萄糖、生理盐水或者缓冲液等。所述寡聚核酸通过抑制鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌、肠癌等肿瘤细胞的E2F3的表达，实现抑制肿瘤起始和生长的作用。将肿瘤细胞接种裸鼠，随后用所述寡聚核酸治疗的实验证明所述寡聚核酸能在体内有效抑制肿瘤的起始和生长。本发明还提供了所述寡聚核酸作用的靶序列，所述靶序列包含5，-GACACGCAAATCTGTTAAACAAA-3，或5，-GTCACGTAAAGGTCATCCGTGA-3，所示的序列。作为一种新型小核酸类的抗肿瘤药物，化学合成并修饰的所述寡聚核酸不易被降解，有较长的半衰期，能用于体外实验，更能用于体内治疗。由于化学合成并修饰的所述寡聚核酸能有效抑制肿瘤细胞E2F3的表达而阻止肿瘤起始和生长，所以该小核酸制剂既能用于预防肿瘤摘除术或放化疗后残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发，又能抑制成体肿瘤的生长。图1为MTT方法检测2'-F寡聚核酸抑制肿瘤细胞增殖的柱形图。图1中，空白对照、2'-F寡聚核酸、2'-F寡聚核酸阴性对照分别表示未转染任何寡聚核酸、转染2'-F寡聚核酸及转染的细胞2'-F寡聚核酸阴性对照的细胞增殖情况。图2为RT-PCR检测化学修饰对寡聚核酸效应半衰期的影响。图2中1、2、3、4、5、6分别表示转染所述2'-F寡聚核酸(正义链为SEQIDNol，反义链为SEQIDNo2)、2'-F寡聚核酸-Star(正义链为SEQIDNol，反义链为SEQIDNo3)、2'-F寡聚核酸阴性对照、未修饰寡聚核酸阴性对照、未修饰的寡聚核酸和未经处理的空白对照。图3为2'-F寡聚核酸治疗鼻咽癌的瘤体积折线图。图4为2'-F寡聚核酸-治疗鼻咽癌的动物实验结果。A为所述2'-F寡聚核酸治疗鼻咽癌的裸鼠效果图，B:为所述2'-F寡聚核酸治疗鼻咽癌的肿瘤效果图，图中所示分别为2'-F寡聚核酸阴性对照治疗和2'-F寡聚核酸治疗的裸鼠及取自裸鼠的肿瘤。具体实施例方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、寡聚核酸的制备本发明中所述寡聚核酸序列正义链为5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’(SEQIDNo.1)；反义链为5，-GACACGCACACUCGCCGACU-3，(SEQIDNo.2)或5，-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’(SEQIDNo.3)。选用一条随机序列作为阴性对照(NC)，NC的正义链序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(SEQIDNo.4)，反义链序列为5，-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3，(SEQIDNo.5)。所述寡聚核酸和阴性对照序列中的A、G、C、U表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核苷酸。所述寡聚核酸和阴性对照委托上海吉玛(GenePharma)制药技术有限公司合成并进行2'氟代(2'-F)、2'甲氧基(2'-OMe)、硫代(PS)和2'脱氧(2'-deoxy)化学修饰。实施例2、2'-F-寡聚核酸对肿瘤细胞增殖的影响具体步骤为将实施例1得到的2'-F寡聚核酸(正义链为SEQIDNol，反义链为SEQIDNo2)和2'-F寡聚核酸阴性对照粉末分别溶解于无RNA酶的无菌水中，配成终浓度为20ymol/L的溶液。收集对数期肿瘤细胞细胞，调整细胞悬液浓度，分种于96孔板，每孔150μ1共5000个细胞；置于37°C，含5%CO2的孵箱中使细胞贴壁，培养6_24小时。转染时，分别将0.25μ1寡聚核酸溶液(上述2'-F寡聚核酸或2'-F寡聚核酸阴性对照)和0.25μ1的Iipofectamine2000(Invitrogen)分别稀释于25μ1无血清培养培养液(Opti-MEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述寡聚核酸溶液与lipofectamine2000溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，把50μ1的寡聚核酸-脂质体复合物加到细胞培养板中(细胞生长融合率为50-70%)，为使细胞同步，在转染的同时将细胞血清饥饿12小时，之后分三组分别培养24，48和72小时；小心吸去上清120ul，使孔中生育培养液为80μ1，再加入20μlMTT(5mg/ml)，即0.5%的MTT继续培养4小时；吸去上清加入100μ1的二甲基亚砜DMS0，在酶联免疫检测仪492nm处测量各孔的吸光值；同时设置调0孔(培养基，MTT，二甲基亚砜)，每组设置3个复孔；结果如图1所示，图1表明转染NC-2'-F的细胞增殖抑制，在转染后48小时和72小时，2'-F寡聚核酸转染处理的细胞OD值明显降低，说明所述寡聚核酸-2'-F能明显抑制肿瘤细胞的增殖。图1中，空白对照、2'-F寡聚核酸、2'-F寡聚核酸阴性对照分别表示未转染任何寡聚核酸、转染2'-F寡聚核酸及转染的细胞2'-F寡聚核酸阴性对照的细胞增殖情况。实施例3、2‘-F-寡聚核酸抑制肿瘤细胞表达E2F3的半衰期测试检测使用Invitrogen的lipofeCtamineTM2000脂质体进行转染，所有操作均按Invitrogen提供的操作规程。将肿瘤细胞接种到6孔板中(300，000个细胞/孔)，用含10%胎牛血清的RPMI1640或DMEM培养液培养16-24小时后，将细胞培养液换成含无抗生素的RPMI1640培养液。转染时，分别将5μ1寡聚核酸溶液和5μ1的lipofectamine2000分别稀释于250μ1无血清培养培养液(Opti-MEM)中，并在室温下孵育5分钟，然后将上述寡聚核酸溶液与lipofectamine2000溶液混合，复合物于室温静置20分钟后，把500μ1的寡聚核酸-脂质体复合物加到细胞培养板中(细胞生长融合率为50-70%)，然后30、54、78和102h收集细胞进行RT-PCR检测。RT-PCR检测的步骤为用ImlTRIzol(invitrogen)裂解转染所述2'-F寡聚核酸或2'-F寡聚核酸阴性对照的CNE细胞，并按TRIzoI产品说明的操作规程提取总RNA。由于RNA干扰的效果可能被潜在的少量的基因组DNA影响，实验采用DNaseI(RNase-free)(TaKaRa)来进一步消化降解总RNA中残留的DNA。在用DNaseI37°C消化30分钟后，按照DNaseI产品说明重新提纯总RNA并对RNA进行定量和质量鉴定。逆转录反应是使用TaKaRa公司的M-MLV逆转录酶体系，将Iug的总RNA与0.5ug的OligodT混合，加热5分钟，迅速冷却至0°C。按产品说明加入缓冲液，42°C孵育1小时。逆转录反应后的cDNA，作为PCR反应的模板检测靶基因E2F3的表达，上游引物为5’-GGACTAGTTTCCTACCTTCTTCCTCCAA-3，，下游引物为5，-GCTCTAGATCTACAGCCCATCCGTCA-3，。PCR反应体系为，94度5分钟，94度1分钟，55度30秒，72度20秒，共28个循环。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，并利用软件对其浓度进行计算。结果如图2所示，图2表明转染2'-F寡聚核酸阴性对照的细胞的PCR产物比未转染寡聚核酸的空白对照组没有明显降低，而转染所述2'-F寡聚核酸和2'-F寡聚核酸-Star转染处理的细胞PCR产物明显降低，并且在102h，转染2'-F寡聚核酸比未经过氟代修饰的所述寡聚核酸对E2F3的抑制仍然明显。说明化学修饰使所述2'-F寡聚核酸对E2F3的效应半衰期从54h延长到102h。图2中1、2、3、4、5、6分别表示转染所述2'-F寡聚核酸(正义链为SEQIDNol，反义链为SEQIDNo2)、2'-F寡聚核酸-Star(正义链为SEQIDNol，反义链为SEQIDNo3)、2'-F寡聚核酸阴性对照、未修饰寡聚核酸阴性对照、未修饰的寡聚核酸和未经处理的空白对照。实施例4、2'-F寡聚核酸对肿瘤生长的抑制作用用含10%胎牛血清的RPM1640培养液培养鼻咽癌CNE细胞，取对数生长期的细胞，制成单细胞悬液，调节细胞浓度7XIO7个细胞/ml。在5周龄的雄性裸鼠的背侧翼部皮下注射0.1ml细胞悬液。在注射肿瘤细胞的第二天，开始用所述2'-F寡聚核酸(正义链为SEQIDNol，反义链为SEQIDNo2)处理。将裸鼠分为两组，一组为2‘-F寡聚核酸处理组，一组为2'-F寡聚核酸阴性对照组。具体方法为用不含RNA酶的无菌水分别溶解2'-F寡聚核酸、2'-F寡聚核酸阴性对照和一种体内转染剂聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯(mPEG-PCL-PPEEA)，所述2'-F寡聚核酸和2'-F寡聚核酸阴性对照的浓度均为0.8μg/μ1，而转染试剂的浓度为3.8μg/μ1，室温孵育15分钟后，将20ug//25ul2'-F寡聚核酸或2'-F寡聚核酸阴性对照，589ug/155ul转染试剂和20ul，10X葡萄糖溶液混合起来，总体积200ul，再室温孵育15分钟进行尾静脉注射，每隔一天注射一次，共治疗5次。2'-F寡聚核酸阴性对照组接种肿瘤细胞3天后的出瘤率为90%，5天为100%。而2'-F寡聚核酸处理组3天后的出瘤率为仅为45%，5天为85%(表1)。接种后3天每隔一天用游标卡尺测量肿瘤最长径(L)和横径(S)，计算肿瘤的近似体积。计算公式为V(mm3)=0.5XLXS2。给药5次后结束实验，处死裸鼠，取出肿瘤称重。图3所示为治疗组和对照组的肿瘤体积对照的折线图，从开始进行第一次治疗后，肿瘤体积明显比对照组小，对照组肿瘤体积呈明显上升趋势。图4所示，表明在鼻咽癌移植肿瘤裸鼠模型上，2'-F寡聚核酸治疗的裸鼠肿瘤明显比阴性对照处理组小，说明所述2'-F寡聚核酸能明显抑制肿瘤的生长。图3中为肿瘤体积的折线图；图4A:为所述2'-F寡聚核酸治疗鼻咽癌的裸鼠效果图，B:为所述2'-F寡聚核酸治疗鼻咽癌的肿瘤效果图，图中所示分别为2'-F寡聚核酸阴性对照治疗和2'-F寡聚核酸治疗的裸鼠及取自裸鼠的肿瘤。表12'-F寡聚核酸抑制肿瘤起始生长肿瘤肿瘤接种数(个)第3天肿瘤出现数第5天肿瘤出现数<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求一种预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的寡聚核酸，为双链结构，包括正义链和反义链，其特征在于所述正义链具有5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’序列，所述反义链具有5’-GACACGCACACUCGCCGACU-3’或5’-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’序列。2.根据权利要求1所述的寡聚核酸，其特征在于所述核酸经过如下修饰中的至少一种(1)对所述寡聚核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；(2)对所述寡聚核酸的核苷酸序列中的核糖的2’-0H的修饰；(3)对所述寡聚核酸的核苷酸序列中的碱基的修饰。3.根据权利要求2所述的寡聚核酸，其特征在于所述寡聚核酸的核苷酸序列中的核糖的2’-0H经过甲氧基取代、氟取代或者脱氧修饰。4.根据权利要求2所述的寡聚核酸，其特征在于所述寡聚核酸的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键中的氧被硫取代。5.包含权利要求1所述寡聚核酸的核酸构建体。6.一种预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的药物组合物，包含权利要求1-5任一项所述的寡聚核酸及药学上可接受的载体。7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体选自聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯或其它体内转染试剂。8.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于所述寡聚核酸与聚乙二醇单甲醚-聚己内酯-聚磷酸酯的质量比为12030。9.根据权利要求1-5任一项所述的寡聚核酸在制备用于预防肿瘤摘除术或放化疗后残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发及成体肿瘤生长的药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，所述肿瘤为鼻咽癌、宫颈癌、肝癌、乳腺癌或肠癌。11.权利要求1所述寡聚核酸作用的靶序列，选自包含5，-GACACGCAAATCTGTTAAACAAA-3，或5，-GTCACGTAAAGGTCATCCGTGA-3，的序列。全文摘要本发明提供了一种预防肿瘤复发和抑制肿瘤生长的寡聚核酸及其应用。所述寡聚核酸为双链结构，包括正义链和反义链，所述正义链具有5’-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGA-3’序列，所述反义链具有5’-GACACGCACACUCGCCGACU-3’或5’-AGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3’序列，上述序列可以经过化学修饰。本发明还提供了包含上述序列的药物组合物以及上述序列在制备用于预防肿瘤摘除术或放化疗后残余肿瘤细胞导致的肿瘤复发及成体肿瘤生长的药物中的应用。文档编号A61K48/00GK101831427SQ20101013785公开日2010年9月15日申请日期2010年4月1日优先权日2010年4月1日发明者何杰,张佩琢,张佳荣,张雅鸥,李建娜,王均,胡祥,谢伟东申请人:清华大学深圳研究生院;深圳市北科生物科技有限公司;上海吉玛制药技术有限公司