本发明涉及一种灵芝培养基及其制作方法，特别是一种灵芝组织分裂用培养基及其制作方法。
背景技术：
：灵芝为多孔菌科真菌赤芝或紫芝的干燥子实体。灵芝是一种珍贵的药用真菌，属于担子菌纲多孔菌科灵芝属，在我国有两千多年的药用史。灵芝首载于《神农本草经》，历代医家都认为灵芝能治疗多种疾病，是滋补强壮扶正固本的珍贵药物。灵芝多糖是灵芝中最有效的成分之一，存在于灵芝的子实体、孢子粉和菌丝体中，具有抑制肿瘤、增强机体对自由基清除的能力，故能减少自由基对机体的损伤、有延缓衰老之功效，还可以提高免疫力、抗炎症、降血脂、降血糖等作用。随着灵芝的保健功效被人们广泛的认识和接受，野生灵芝已远远不能满足人们的需求。培养基是灵芝赖以生存的条件，不同的培养原料和配方可对灵芝的菌丝生长、产量和活性成分等产生重要的影响。其中，灵芝组织分裂用培养基对后期的成品灵芝的质量影响很大。现有技术中灵芝组织分裂时用的培养基中棉籽壳、木屑等原料时，这些原料常占总量的50%-80%，是主要原料，麸皮等原料所占比例较少，通常在10%-20%，但是这些原料本身营养成分少，不利于产出灵芝的品质保证。特别是不能保证灵芝中多糖的含量，使得最终得到的灵芝中多糖含量低。技术实现要素：本发明的目的，是提供一种灵芝组织分裂用培养基及其制作方法。所述培养基培养出来的灵芝品质好，灵芝中的有效成分多糖含量高。本发明是这样实现的。一种灵芝组织分裂用培养基,所述培养基按重量份计算，主要由葡萄糖10-30份、酵母膏1-5份、土豆150-250份、蛋白胨1-5份、琼脂15-35份、山楂25-35份、麦芽1-10份、枸杞5-15份、土茯苓20-30份、豆粕45-55份、蛇倒退20-40份、玉米芯20-40份、酒糟10-20份、石膏10-30份、茶渣25-45份、连翘35-45份、食盐5-15份和水900-1100份制成。前述的灵芝组织分裂用培养基，所述培养基按重量份计算，主要由葡萄糖15-25份、酵母膏1.5-2.5份、土豆180-220份、蛋白胨1.5-2.5份、琼脂20-24份、山楂28-32份、麦芽2-8份、枸杞8-12份、土茯苓22-28份、豆粕48-52份、蛇倒退25-35份、玉米芯25-35份、酒糟12-18份、石膏15-25份、茶渣30-40份、连翘38-42份、食盐8-12份和水950-1050份制成。前述的灵芝组织分裂用培养基，所述培养基按重量份计算，主要由葡萄糖20份、酵母膏2份、土豆200份、蛋白胨1-2份、琼脂22份、山楂30份、麦芽5份、枸杞10份、土茯苓25份、豆粕50份、蛇倒退30份、玉米芯30份、酒糟15份、石膏20份、茶渣35份、连翘40份、食盐10份和水1000份制成。一种前述的灵芝组织分裂用培养基的制作方法，土豆、山楂、枸杞、土茯苓、蛇倒退、连翘、茶渣和玉米芯，切碎，加配方量40-60%的水煮沸20-30分钟，滤渣弃去，滤液加入剩余量水,继续加热至50-60度后，加入剩余的原料，边加边搅拌，全部原料加完后，继续加热30-50min，分装，硅胶塞密封，包好，120-122度下灭菌20-30分钟后，冷却至50-60度，倾斜5-15度放置，30-35℃下烘干24-48h后，取出，保存，即得。前述的灵芝组织分裂用培养基的制作方法，土豆、山楂、枸杞、土茯苓、蛇倒退、连翘、茶渣和玉米芯，切碎，加配方量50%的水煮沸25分钟，滤渣弃去，滤液加入剩余量水,继续加热至50-60度后，加入剩余的原料，边加边搅拌，全部原料加完后，继续加热40min，分装，硅胶塞密封，用报纸包好，120-122度下灭菌25分钟后，冷却至50-60度，倾斜10度放置，30-35℃下烘干35h后，取出，保存，即得。申请人灵芝组织分裂用培养基进行了大量的研究，部分实验如下：实验例.多糖含量测定1测定项目：1.1灵芝1：选择优质野生灵芝用本发明培养基进行组织分离、然后经提纯、质配、复壮（转接）、扩繁、驯化、栽培等后采收的灵芝。1.2灵芝2：选择优质野生灵芝用培养基进行组织分离、然后经提纯、质配、复壮（转接）、扩繁、驯化、栽培等后采收的灵芝；所述培养基购于苏州市经纬农产品有限公司。2方法2.1苯酚溶液的配制精确称量分析纯苯酚晶体5g于250ml，加入蒸馏水60ml，放入50℃水浴中使其溶解，再于100ml容量瓶中定容，即得5%苯酚溶液。苯酚可以被空气氧化，所以苯酚溶液现配现用。2.2样品多糖提取方法2.2.1灵芝1样品溶液：取5g赤灵芝1样品，粉碎过80目筛。取所得灵芝粉末0.5g于500ml烧杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒温水浴槽中加热30分钟，过滤。重复以上操作两次，以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间，过滤后取滤液加蒸馏水定容至500ml。2.2.1灵芝2样品溶液：取5g赤灵芝2样品，粉碎过80目筛。取所得灵芝粉末0.5g于500ml烧杯中，加入15ml95％乙醇，于60℃恒温水浴槽中加热30分钟，过滤。重复以上操作两次，以除去单糖、双糖以及低聚糖等干扰性成分。经过滤后的样品于100℃沸水中提取一段时间，过滤后取滤液加蒸馏水定容至500ml。2.3分光光度法测定多糖含量2.3.1标准曲线的绘制。精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。取50ml洗净的容量瓶6只。分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml，加入蒸馏水定容，即得到浓度分别为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、0.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖标准溶液。测定时取1ml各浓度葡萄糖标准溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速入5％苯酚溶液以及98％浓硫酸适量，摇匀后放置于室温下显色20min。另取lml蒸馏水，同上加入苯酚溶液和浓硫酸，做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数r。2.3.2灵芝1多糖含量测定：取lml灵芝1样品多糖提取液加入到20ml具塞比色管中，采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸，于特定波长处测定吸光度，将吸光度带入标准曲线方程，计算得出样品液浓度c。按下式计算出所取多糖含量，多糖含量(%)=cv/m，c为样品液浓度，v为样品液体积，m为取样的质量。2.3.3灵芝2多糖含量测定：取lml灵芝2样品多糖提取液加入到20ml具塞比色管中，采用与标准液显色相同方法依次加入苯酚溶液和浓硫酸，于特定波长处测定吸光度，将吸光度带入标准曲线方程，计算得出样品液浓度c。按下式计算出所取多糖含量，多糖含量(%)=cv/m，c为样品液浓度，v为样品液体积，m为取样的质量。3结果3.1最大吸收波长的确定取lml0.05mg/ml葡萄糖标准溶液，加入苯酚溶液和浓硫酸后反应一段时间后。在450-520nm波长区间进行光谱扫描，确定其最大吸收波长，发现在488nm波长处，所得吸光度值最大，无其他杂峰，则最佳测定波长选用488nm。3.2苯酚溶液用量的确定取相同浓度的葡萄糖标准液1ml于6支20ml具塞比色管中，分别加入0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml的5％苯酚溶液，再依次加入5ml98％浓硫酸，混合摇匀。放置于20℃温度下显色30分钟，在488nm波长处测定吸光度值。当加入苯酚溶液1.0ml时，吸光度值最大，加入苯酚溶液过多反而会引起吸光度降低，所以实验中5%苯酚溶液的最佳加入量应当为1ml。3.3浓硫酸用量的确定取相同浓度的葡萄糖标准溶液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各加入5％苯酚溶液lml，依次滴加浓硫酸4.0ml、4.5ml、5.0ml、5.5m、6.0ml。于488nm波长处测定其吸光度，发现硫酸加入量为5ml时所测得的吸光度值达到最大，加入硫酸过少则反应不够完全。加入硫酸过多可能导致其他副反应，导致测定结果降低，所以最佳硫酸加入量为5ml。3.4显色温度的确定分别取一定浓度葡萄糖标准液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％浓硫酸5ml，分别放于20℃、30℃、40℃、50℃、60℃温度下显色30min，在489nm波长处测定其吸光度。在各温度下，测得的吸光度基本不变，所以温度对反应吸光度基本无影响，在室温下就能够完全反应。3.5显色时间的确定分别取一定浓度葡萄糖标准液lml加入到五支编号的具塞比色管中，各向其中加入5％苯酚溶液lml，迅速滴加98％浓硫酸5ml，分别于室温下显色10min、20min、30min、40min、50min，在488nm波长处测定其吸光度。发现，反应10分钟吸光度值较小，显色时间从20到50分钟，样品溶液的吸光度基本不变，所以反应时间控制在20分钟以上就基本能够反应完全。所以反应时间控制在20分钟以上就能达到最佳效果。综合以上测定结果，得出苯酚硫酸法最佳测定条件参数：1m样品液，5％苯酚溶液加入量为1ml，98％浓硫,酸加入量为5ml，显色温度室温即可，显色时间为20分钟以上，最大吸收波长为488nm。3.6标准曲线的绘制精确称量充分干燥过的分析纯葡萄糖50mg，加水定容至500ml容量瓶中，得到0.1mg/ml葡萄糖标准溶液。取50ml洗净的容量瓶6只，分别用移液管准确加入葡萄糖标准溶液5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml。加入蒸馏水定容，即得到浓度分别为0.01mg/ml、0.02mg/ml、0.03mg/ml、00.04mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml的葡萄糖标准溶液。测定时取1ml各浓度葡萄糖标准溶液加入到20ml具塞比色管中，迅速加入5％苯酚溶液以及98％浓硫酸适量，摇匀后放置于室温下显色20min。另取lml蒸馏水，同上加入苯酚溶液和浓硫酸，做空白参比溶液。在指定波长处测定吸光度值，绘制标准曲线，计算标准曲线方程和相关系数r。准确称量葡萄糖0．0520g。标准曲线方程为y=9.0803x-0.0385，相关系数r值为0.9984，线性较好，线性范围10.5-63.0ug/ml。3.7重复性试验采用苯酚硫酸法平行取样品溶液测定5次，得到数据如表1.表1重复性实验结果序号12345rsd/%吸光度a0.2410.2480.2450.2460.2421.18rsd=1.18％，说明精密度较高，能满足定量分析的要求，平均吸光度值为0.244。3.8加标回收率分别准确移取灵芝1样品溶液和灵芝2样品溶液0.5ml于20ml具塞比色管中，分别准确移取0.005mg/ml、0.010mg/ml、0.015mg/ml的标准溶液，0.5ml加入样液中，测定多糖含量计算平均回收率。平均回收率为97.64%，rsd为1.2%。回收率高，说明此法结果准确率高。4含量测定结果分别取灵芝1和灵芝2，平行分成6份，制成灵芝1样品溶液和灵芝2样品溶液，按上述方法进行测定，记录数据，结果取平均值。得到结果见表2.表2灵芝多糖含量测定结果由表可知，本发明培养基进行组织分离后，最终采收的灵芝中多糖的含量较高。灵芝品质好。与现有技术相比，本发明所述培养基培养出来的灵芝品质好，灵芝中的有效成分多糖含量高。具体实施方式实施例1。原料：葡萄糖20kg、酵母膏2kg、土豆200kg、蛋白胨1-2kg、琼脂22kg、山楂30kg、麦芽5kg、枸杞10kg、土茯苓25kg、豆粕50kg、蛇倒退30kg、玉米芯30kg、酒糟15kg、石膏20kg、茶渣35kg、连翘40kg、食盐10kg和水1000kg。制作方法：土豆、山楂、枸杞、土茯苓、蛇倒退、连翘、茶渣和玉米芯，切碎，加配方量50%的水煮沸25分钟，滤渣弃去，滤液加入剩余量水,继续加热至50-60度后，加入剩余的原料，边加边搅拌，全部原料加完后，继续加热40min，分装，硅胶塞密封，用报纸包好，120-122度下灭菌25分钟后，冷却至50-60度，倾斜10度放置，30-35℃下烘干35h后，取出，保存，即得。实施例2.原料：葡萄糖30kg、酵母膏5kg、土豆250kg、蛋白胨5kg、琼脂35kg、山楂35kg、麦芽10kg、枸杞15kg、土茯苓30kg、豆粕55kg、蛇倒退40kg、玉米芯40kg、酒糟20kg、石膏30kg、茶渣45kg、连翘45kg、食盐15kg和水1100kg。4.制作方法：土豆、山楂、枸杞、土茯苓、蛇倒退、连翘、茶渣和玉米芯，切碎，加配方量60%的水煮沸30分钟，滤渣弃去，滤液加入剩余量水,继续加热至50-60度后，加入剩余的原料，边加边搅拌，全部原料加完后，继续加热30-50min，分装，硅胶塞密封，包好，120-122度下灭菌30分钟后，冷却至50-60度，倾斜15度放置，30-35℃下烘干48h后，取出，保存，即得。实施例3.原料：葡萄糖10kg、酵母膏1kg、土豆150kg、蛋白胨1kg、琼脂15kg、山楂25kg、麦芽1kg、枸杞5kg、土茯苓20kg、豆粕45kg、蛇倒退20kg、玉米芯20kg、酒糟10kg、石膏10kg、茶渣25kg、连翘35kg、食盐5kg和水900kg。制作方法：土豆、山楂、枸杞、土茯苓、蛇倒退、连翘、茶渣和玉米芯，切碎，加配方量60%的水煮沸30分钟，滤渣弃去，滤液加入剩余量水,继续加热至50-60度后，加入剩余的原料，边加边搅拌，全部原料加完后，继续加热30-50min，分装，硅胶塞密封，包好，120-122度下灭菌30分钟后，冷却至50-60度，倾斜15度放置，30-35℃下烘干48h后，取出，保存，即得。当前第1页12