专利名称：：使用含有植物源性组分的培养基和挠性密闭容器来制备肉毒梭菌毒素的方法
技术领域：
：本申请案主张2008年5月19日向韩国知识产权局提出申请的韩国专利申请案第10-2008-0046152号的权益，此专利申请案的公开内容以全文引用的方式并入本文中。本发明涉及一种使用含有植物源性组分的培养基和挠性密闭容器来制备肉毒梭菌毒素的方法。
背景技术：
：从1890年起直到目前为止，已发现能产生具有神经毒性的毒素的梭菌属(Clostridium)菌株，并且对由梭菌属菌株产生的毒素性质的研究已有70年(斯旦兹(Schant,E.J.)等人，微生物学(Microbiol.Rev.)，第56卷；80；1992)。梭菌属具有超过127个的种类，并且根据其形态和功能而加以分组。厌氧的革兰氏阳性细菌肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)在人类和动物体内产生多肽神经毒素，引起神经麻痹，这被称为肉毒中毒(botulism)。肉毒梭菌孢子可存在于土壤中，并且大量的这些孢子甚至可在未被充分加工的食物中萌发和加以培养。这些可为肉毒中毒的原因。肉毒毒素(Botulinumtoxin)根据其血清学特征可分为7种类型A至G。每种毒素均具有约150kDa的毒素蛋白，并自然地包含与所结合的多种无毒蛋白质形成的复合物。中型复合物(300kDa)包含毒素蛋白和无毒的非血球凝集素蛋白，而大型复合物(500kDa)和巨型复合物(900kDa)各具有中间复合物结合于血球凝集素的结构(杉山(Sugiyama，H.)，微生物学(Microbiol.Rev.)第44卷，419；1980)。已知此种无毒的非血球凝集素蛋白可保护毒素免受肠部低PH值环境和各种蛋白水解酶的影响(杉山(Sugiyama，H.)，微生物学(Microbiol.Rev.)第44卷，419；1980)。肉毒毒素以分子量约为150kDa的单链多肽的形式在细胞中合成，并接着通过在细胞中使用蛋白酶或通过使用人工酶处理(如胰蛋白酶)在离N末端三分之一距离的位置处裂解为两个亚单位分子量为50kDa的轻链和分子量为IOOkDa的重链。这种已裂解为两个亚单位的毒素相较于单链多肽，毒性有极大增加。这两个亚单位通过二硫键结合于彼此，且各亚单位以不同方式起作用。更确切地说，重链与靶细胞的受体结合(欧洲微生物学会联合会微生物学快报(FEMSMicrobiol.Lett.)，72，243；1990)，并与生物膜在低pH值(pH4.0)下反应而形成通道(蒙特库科(Mantecucco,C.)等人，生化科学的发展(TIBS)，18，324;19如)。另一方面，轻链具有药理学活性，且因而当利用电穿孔或由表面活性剂引起的渗透性增强来将轻链引入细胞中时，轻链干扰神经递质的分泌(布朗(Poulain，B.)等人，美国国家科学协会公报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，85，4090；1988)。A型肉毒毒素为人类所知的最致命的天然生物制剂。以摩尔计，A型肉毒毒素致死率为白喉毒素(diphtheriatoxin)的18亿倍、氰化钠的6亿倍、眼镜蛇毒素(cobratoxin)的0.3亿倍和霍乱毒素(choleratoxin)的0.12亿倍(辛格(Singh)，细菌蛋白毒素的重要方面(CriticalAspectsofBacterialproteinToxins)，第63-84页，天然毒素II(naturaltoxinsII)，由萨恩(B.R.Sigh)等人编辑，普莱南出版公司(PlenumPress),纽约(1976))。肉毒毒素抑制细胞在神经肌肉接头的胆碱能突触前处胞吐乙酰胆碱，从而引起衰弱(asthenia)。考虑到纵使只处理极少量的肉毒毒素也会展现毒性，可认为肉毒毒素会具有酶活性(辛普森(Simpson,L.L.)等人，药理学与毒理学年评(Ann.Rev.Pharmaeo1.Toxicol.),26,427；1986)。根据最近的报道，肉毒毒素具有金属肽酶活性，并且其底物为胞吐机制复合物的单位蛋白质，诸如小突触囊泡蛋白(synaptobrevin)、突触融合蛋白(syntaxin)禾口25kDa的突角虫相关蛋白(synaptosomalassociatedprotein,SNAP25)。各类肉毒毒素使用这三种蛋白质之一作为底物，且已知B型、D型、F型及G型肉毒毒素在特异性位点裂解小突触囊泡蛋白，A型及E型肉毒毒素在特异性位点裂解SNAP25，并且C型肉毒毒素在特异性位点裂解突触融合蛋白(宾兹(Binz，T.)等人，生物化学期刊(J.Biol.Chem.)，265，9153；1994)。W006/096163公开了在氮气下进行种子培养和主要培养，并将pH值从5调节到5.5，以便表达肉毒毒素蛋白。另外，进行多步色谱分离，并必须使用可重复使用设备和消耗品进行洗涤和灭菌。这种系统需要大量劳动力和高投资成本，并且在此系统中为了满足现行良好制造规范(cGMP，currentgoodmanufacturingpractice)要求而存在高危因素。
发明内容技术问题因此，本申请案的发明者发现，大量肉毒梭菌毒素可通过使用植物源性组分的组合物而表达于细胞外部，并且肉毒梭菌毒素可有效地通过使用一次性生物反应器，经由使用严格厌氧菌肉毒梭菌菌株的发酵来产生。另外，本申请案的发明者发现，肉毒梭菌毒素可容易地且极其简单地从已移除细胞的培养物中纯化出来。从而，构成本发明。本发明提供一种使用含有植物源性组分的培养基来制备肉毒梭菌毒素的方法。本发明也提供一种使用挠性密闭容器来制备肉毒梭菌毒素的方法。技术解决方案本发明提供一种制备肉毒梭菌毒素的方法，所述方法包括(a)在含有植物源性组分的培养基中培养肉毒梭菌，以于细胞外部表达肉毒梭菌毒素；以及(b)从所获得的培养物移除所述细胞而获得包括表达于所述细胞外部的肉毒梭菌毒素的部分并从所述部分中分离出所述肉毒梭菌毒素。在本发明方法中，在含有植物源性组分的培养基中培养肉毒梭菌，以于细胞外部表达肉毒梭菌毒素(操作(a))。在本操作中，使用含有植物源性组分的培养基进行培养，从而于细胞外部表达毒素，此不同于现有技术。本文所用的措辞‘于细胞外部表达肉毒梭菌毒素’表示在细胞内产生毒素之后，细胞不仅自发地将毒素输送到细胞外部，而且内部表达有毒素的细胞也会裂解，由此毒素暴露于培养物溶液中，而非在培养物的细胞中。含有植物源性组分的培养基可包含植物蛋白胨(phytoneρ印tone)，并且优选包含植物蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖。另外，含有植物源性组分的培养基可进一步包含至少一种选自由植物胰胨(vegetabletryptone)、大豆胨(soytone)以及硫代乙醇酸钠(sodiumthioglycolate)组成的群组的组分。在一个实施例中，含有植物源性组分的培养基可为选自由以下组成的群组中的一个包含葡萄糖、酵母提取物和植物蛋白胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和大豆胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、大豆胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基；以及包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基。在另一个实施例中，以培养基总重量计，葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨在上述各培养基中的量可分别为0.2重量％到2重量％、0.5重量％到3重量％、0.05重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、以及0.5重量％到2重量％。在另一个实施例中，含有植物源性组分的培养基可为选自由以下组成的群组中的一个包含葡萄糖、酵母提取物和植物蛋白胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和大豆胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、大豆胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基；以及包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基。就此来讲，以培养基总重量计，葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨在上述各培养基中的量分别为0.2重量％到2重量％、0.5重量％到3重量％、0.05重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、以及0.5重量％到2重量％，并且培养基的其余部分可包含水。肉毒梭菌毒素可为选自由以下组成的群组中的一个肉毒毒素A、肉毒毒素B、肉毒毒素C、肉毒毒素D、肉毒毒素E、肉毒毒素F和肉毒毒素G，并优选为肉毒毒素A。在操作(a)中，可通过以下步骤来进行培养将培养基引入包括入口和出口并由挠性材料构成的密闭容器中，给所述培养基接种肉毒梭菌，并培养细胞。所述密闭容器在动物细胞培养领域内为人熟知，并且可于市面上购得(例如Cultibag，由波浪生物技术公司(WaveBiotech)制造)。举例来讲，密闭容器可为W000/66706中所公开的密闭容器，但本发明不限于此。密闭容器被预先灭菌，并且可呈袋形式，例如呈塑料袋形式。当密闭容器是空的时候，容器呈由两层紧密对齐的挠性材料制成的薄片形式，从而不具有实质上的内部空间体积。当通过入口引入诸如培养基或细胞溶液等样品时，在两层挠性材料之间形成空间以容纳样品但实质上没有引入任何空气。可利用摇动来搅拌密闭容器。可利用摇动来搅拌安装于摇晃器平台上的密闭容器中的培养基。摇晃器使平台绕摇摆轴摇摆。所述摇晃器在动物细胞培养领域内为人熟知，并且可作为Cultibag(波浪生物技术公司或赛多利斯公司(Sartorius))的一部分购得。密闭容器为气密性的，并因而从当将培养基引入密闭容器中并给培养基接种肉毒梭菌时到当完成细胞的培养时，密闭容器的内部可维持在不会被从外部提供氧气的条件下。因此，进行培养时可不必为了维持厌氧条件而供给氮气、使用具有除氧活性的化学材料(例如硫代乙醇酸钠)或调节PH值。可在利用摇晃器摇动来搅拌的条件下进行培养，或可在无搅拌的条件下进行培养。在本发明方法中，从所获得的培养物移除细胞而获得包括表达于细胞外部的肉毒梭菌毒素的部分，并从所述部分中分离出毒素(操作(b))。在本操作中，分离出存在于已移除细胞的培养物中的毒素，并且此操作可使用分离包括于溶液中的毒素的习知方法来进在一个实施例中，操作(b)可包括从培养物中移除细胞，将酸添加到所获得的培养物中以使肉毒梭菌毒素沉淀析出，接着分离出沉淀物(操作(b-i))；将所分离的沉淀物溶解于液体介质中并超滤所得溶液(操作(b-2))；以及对已被超滤的溶液(即滞留物(retentate))进行阴离子交换色谱分离(b_3)。在操作(b-Ι)中，可使用至少一种选自由深层过滤和微量过滤组成的群组的方法来移除细胞。另外，可通过将酸添加到所获得的培养物中以维持培养物的PH值在3到4范围内来使毒素沉淀。所述酸可为硫酸、盐酸、乙酸(包括冰乙酸)等等。在操作(b-2)中，可使用截留分子量(molecularweightcutoff)为IOOkDa或以下的膜来进行超滤。可使用缓冲液(例如10-50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0-6.0))来溶解所分离的沉淀物。在操作(b-3)中，阴离子交换色谱分离可使用右旋糖酐(dextran)、基于琼脂糖的二乙基氨基乙基(DEAE)、Q琼脂糖凝胶(Qsepharose)或Q交联葡聚糖(Qs印hadex)。可仅使用柠檬酸盐缓冲液代替使用NaCl来进行洗脱。在另一实施例中，操作(a)和操作(b)中的至少一个操作可使用已预先灭菌的一次性容器来进行。另外，在各操作中，已预先灭菌的一次性容器中有样品流动的内部空间可能不与已预先灭菌的一次性容器外有操作人员工作的外部空间连通。举例来说，在习知开放系统中，可通过离心或过滤来从培养物中移除细胞。在这种情况下，在将培养物引入离心分离器或过滤器的过程中和在离心和过滤之后收集样品的过程中，样品可暴露于外部。另外，在习知开放系统中，在将样品引入分别用于沉淀、超滤和色谱分离的反应器、超滤器和色谱柱中的过程中和在沉淀、超滤和色谱分离之后收集样品的过程中，样品可暴露于外部。然而，在本发明中，使用已预先灭菌的一次性容器来进行操作(a)和操作(b)中的至少一个操作，并因而操作(a)和(b)中的至少一个操作中所用的容器可相互连接，以便不与容器外部空间接触。优选的是，操作(a)和(b)中所用的所有容器同时或依序地相互连接。本发明也提供一种制备肉毒梭菌毒素的方法，所述方法包括将培养基引入包括入口和出口并由挠性材料构成的密闭容器中，给所述培养基接种肉毒梭菌，并培养细胞以在培养物中表达肉毒梭菌毒素(操作(a))；以及从所获得的培养物中分离出肉毒梭菌毒素(操作(b))。在操作(a)中，将培养基引入包括入口和出口并由挠性材料构成的密闭容器中，给所述培养基接种肉毒梭菌，并培养细胞以在培养物中表达肉毒梭菌毒素。密闭容器在动物细胞培养领域内为人熟知，并且可于市面上购得(例如Cultibag,由波浪生物技术公司制造)。举例来讲，密闭容器可为W000/66706中所公开的密闭容器，但本发明不限于此。密闭容器被预先灭菌，并且可呈袋形式，例如呈塑料袋形式。可利用摇动来搅拌密闭容器。可利用摇动来搅拌安装于摇晃器平台上的密闭容器中的培养基。摇晃器使平台绕摇摆轴摇摆。摇晃器在动物细胞培养领域为人熟知，并且可作为Cultibag(波浪生物技术公司或赛多利斯公司)的一部分购得。密闭容器为气密性的，并因而从当将培养基引入密闭容器中并给培养基接种肉毒梭菌时到当完成细胞的培养时，密闭容器的内部可维持在不会被从外部提供氧气的条件下。因此，进行培养可不必为了维持厌氧条件而供给氮气、使用具有除氧活性的化学材料(例如硫代乙醇酸钠)或调节PH值。培养基可为培养肉毒梭菌中所用的习知培养基。培养基可包括含有动物源性组分的培养基和含有植物源性组分的培养基中的至少一种，并且可优选为含有植物源性组分的培养基。在一个实施例中，含有植物源性组分的培养基可包含植物蛋白胨、酵母提取物和葡萄糖。另外，含有植物源性组分的培养基可进一步包含至少一个选自由以下组成的群组的组分植物胰胨、大豆胨和硫代乙醇酸钠。在一个实施例中，含有植物源性组分的培养基可为选自由以下组成的群组中的一个包含葡萄糖、酵母提取物和硫代乙醇酸钠并进一步包含至少两个选自由植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨组成的群组的组分的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠但不包含植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基；以及包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基。在另一个实施例中，以培养基总重量计，葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨在上述各培养基中的量可分别为0.2重量％到2重量％、0.5重量％到3重量％、0.05重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、以及0.5重量％到2重量％。在另一个实施例中，含有植物源性组分的培养基可为选自由以下组成的群组中的一个包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠以及至少两个选自由植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨组成的群组的组分和水的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠和水但不包含植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基；以及包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰胨、大豆胨和水的培养基。就此来讲，以培养基总重量计，葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨在上述各培养基中的量分别为0.2重量％到2重量％、0.5重量％到3重量％、0.05重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、以及0.5重量％到2重量％，并且培养基的其余部分可包含水。肉毒梭菌毒素可为选自由以下组成的群组中的一个肉毒毒素A、肉毒毒素B、肉毒毒素C、肉毒毒素D、肉毒毒素E、肉毒毒素F和肉毒毒素G，并优选为肉毒毒素A。当如上所述使用含有植物源性组分的培养基时，毒素被分泌到细胞外部。在这种情况下，分离出存在于已移除细胞的培养物中的毒素，并且此分离操作可使用分离包括于溶液中的毒素的习知方法来进行。在一个实施例中，操作(b)可包括从培养物中移除细胞，将酸添加到所获得的培养物中以使肉毒梭菌毒素沉淀析出，接着分离出沉淀物(操作(b-Ι))；将所分离的沉淀物溶解于液体介质中并超滤所得溶液(操作(b-2))；以及对已被超滤的溶液(即滞留物)进行阴离子交换色谱分离(b-3)。在操作(b-Ι)中，可使用至少一种选自由深层过滤和微量过滤组成的群组的方法来移除细胞。另外，可通过将酸添加到所获得的培养物中以维持培养物的PH值在3到4范围内来使毒素沉淀。所述酸可为硫酸、盐酸、乙酸(包括冰乙酸)等等。在操作(b-2)中，可使用截留分子量为IOOkDa或以下的膜来进行超滤。可使用缓冲液(例如10-50mM柠檬酸盐缓冲液(pH5.0-6.0))来溶解所分离的沉淀物。在操作(b_3)中，阴离子交换色谱分离可使用右旋糖酐、基于琼脂糖的二乙基氨基乙基(DEAE)、Q琼脂糖凝胶或Q交联葡聚糖。可仅使用柠檬酸盐缓冲液代替使用NaCl来进行洗脱。在另一实施例中，操作(a)和(b)中的至少一个操作可使用已预先灭菌的一次性容器来进行。另外，在各操作中，已预先灭菌的一次性容器中有样品流动的内部空间可能不与已预先灭菌的一次性容器外有操作人员工作的外部空间连通。举例来说，在习知开放系统中，可通过离心或过滤来从培养物中移除细胞。在这种情况下，在将培养物引入离心分离器或过滤器的过程中和在离心和过滤之后收集样品的过程中，样品可暴露于外部。另外，在习知开放系统中，在将样品引入分别用于沉淀、超滤和色谱分离的反应器、超滤器和色谱柱中的过程中和在沉淀、超滤和色谱分离之后收集样品的过程中，样品可暴露于外部。然而，在本发明中，使用已预先灭菌的一次性容器来进行操作(a)和(b)中的至少一个操作，并因而操作(a)和(b)中的至少一个操作中所用的容器可彼此连接，以便不与容器外部空间接触。优选的是，操作(a)和(b)中所用的所有容器同时或依序地相互连接。在本发明方法中，肉毒梭菌可产生肉毒梭菌毒素，并可例如为A型肉毒梭菌HallA株(ATCC寄存编号3502)。可在所属
技术领域：
内已知的习知培养条件下培养肉毒梭菌。可在33°C至40°C的温度下进行培养。根据本发明方法，培养箱周围的工作环境与习知工作环境相同，并因此无需建立独立的无菌环境或无需进行洗涤。在本发明方法中，可使用一次性消耗品进行各操作。举例来讲，过滤系统(一次性深层过滤器和微量过滤器)可用作移除细胞时所用的离心分离或过滤系统，不与外部接触的一次性系统可用作沉淀系统，并且一次性超滤和色谱系统可分别用作超滤和色谱系统。另外，可使用一次性样品转移系统来转移样品。因而，可防止会由肉毒梭菌污染所引起的危险因素。有益效果根据本发明方法，肉毒梭菌毒素被表达于细胞外部，并因此可容易地且极其简单地纯化和制备肉毒梭菌毒素。另外，无需为了建立厌氧条件而吹扫氮气或使用其他设备，并且可甚至在一般工作环境中使用肉毒梭菌菌株来进行发酵。另外，根据本发明方法，可通过使用一次性消耗品在密闭系统中来培养肉毒梭菌和纯化肉毒梭菌毒素，并因此包括肉毒梭菌和肉毒梭菌毒素的容器内部不与操作人员工作所处的容器外部接触。因此，可安全地制备肉毒梭菌毒素。另外，即使在不使用以复杂方式控制的习知发酵和纯化系统时，也可制备具有高纯度的肉毒梭菌毒素。具体实施例方式最佳模式在下文中，将参考以下实例更详细地描述本发明。这些实例仅用于说明目的，而非意欲限制本发明的范围。实例1验证培养基组合物可在不合动物源性组分的培养基中产生大量表达于细胞外部的A型肉毒梭菌毒素使用多种植物培养基验证以下事实在不含动物源性组分的培养基中大量A型肉毒梭菌毒素被表达于细胞外部。所用培养基如以下表1所示。〈表1>[表1]权利要求1.一种制备肉毒梭菌毒素的方法，所述方法包含(a)在含有植物源性组分的培养基中培养肉毒梭菌以于细胞外部表达肉毒梭菌毒素；以及(b)从所获得的培养物移除所述细胞而获得包括表达于所述细胞外部的肉毒梭菌毒素的部分并从所述部分中分离出所述肉毒梭菌毒素。2.如权利要求1所述的方法，其中所述含有植物源性组分的培养基是选自由以下组成的群组中的一个包含葡萄糖、酵母提取物和植物蛋白胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和大豆胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、大豆胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基；以及包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基。3.如权利要求2所述的方法，其中以所述培养基总重量计，葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨在各培养基中的量分别为0.2重量％到2重量％、0.5重量％到3重量％、0.05重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、以及0.5重量％到2重量％。4.如权利要求1所述的方法，其中所述肉毒梭菌毒素是选自由以下组成的群组中的一个肉毒毒素A、肉毒毒素B、肉毒毒素C、肉毒毒素D、肉毒毒素E、肉毒毒素F和肉毒毒素G。5.如权利要求1所述的方法，其中所述操作(a)的培养是通过以下步骤来进行将培养基引入包含入口和出口并由挠性材料构成的密闭容器中，给所述培养基接种肉毒梭菌，并培养所述细胞。6.如权利要求5所述的方法，其中所述密闭容器被预先灭菌并呈袋形式。7.如权利要求5所述的方法，其中所述密闭容器是利用摇动来搅拌。8.如权利要求5所述的方法，其中所述密闭容器为气密性的。9.如权利要求5所述的方法，其中所述培养是在没有为了维持厌氧条件而供给氮气、使用具有除氧活性的化学材料或调节PH值的情况下进行。10.如权利要求1所述的方法，其中操作(b)包含(b-1)从所述培养物中移除所述细胞，将酸添加到所获得的培养物中以使肉毒梭菌毒素沉淀析出，并接着分离出沉淀物；(b-2)将所分离的沉淀物溶解于液体介质中并超滤所得溶液；以及(b-3)对已被超滤的溶液进行阴离子交换色谱分离。11.如权利要求10所述的方法，其中在操作(b-Ι)中，所述细胞的所述移除是使用至少一种选自由深层过滤和微量过滤组成的群组的方法来进行，并且所述毒素的所述沉淀是通过将酸添加到所获得的培养物中以将所述培养物的PH值维持在3到4范围内来进行，而且在操作(b-2)中，所述超滤是使用截留分子量为IOOkDa或以下的膜来进行。12.如权利要求1所述的方法，其中操作(a)和(b)中的至少一个操作是使用已预先灭菌的一次性容器来进行，并且在每一操作中，以不与所述容器的外部连通的方式转移样品。13.一种制备肉毒梭菌毒素的方法，所述方法包含(a)将培养基引入包含入口和出口并由挠性材料构成的密闭容器中，给所述培养基接种肉毒梭菌，并培养细胞以在培养物中表达肉毒梭菌毒素；以及(b)从所获得的培养物中分离出肉毒梭菌毒素。14.如权利要求13所述的方法，其中所述密闭容器被预先灭菌并呈袋形式。15.如权利要求13所述的方法，其中所述密闭容器是利用摇动来搅拌。16.如权利要求13所述的方法，其中所述密闭容器为气密性的。17.如权利要求13所述的方法，其中所述培养是在没有为了维持厌氧条件而供给氮气、使用具有除氧活性的化学材料或调节PH值的情况下进行。18.如权利要求13所述的方法，其中所述培养基是选自由以下组成的群组中的一个:包含葡萄糖、酵母提取物和植物蛋白胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨和大豆胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、大豆胨和植物胰胨的培养基；包含葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基；以及包含葡萄糖、酵母提取物、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨的培养基。19.如权利要求18所述的方法，其中以所述培养基总重量计，葡萄糖、酵母提取物、硫代乙醇酸钠、植物蛋白胨、植物胰胨和大豆胨在各培养基中的量分别为0.2重量％到2重量％、0.5重量％到3重量％、0.05重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、0.5重量％到2重量％、以及0.5重量％到2重量％。20.如权利要求13所述的方法，其中所述肉毒梭菌毒素是选自由以下组成的群组中的一个肉毒毒素A、肉毒毒素B、肉毒毒素C、肉毒毒素D、肉毒毒素E、肉毒毒素F和肉毒毒素G021.如权利要求13所述的方法，其中操作(b)包含(b-Ι)从所述培养物中移除所述细胞，将酸添加到所获得的培养物中以使肉毒梭菌毒素沉淀析出，并接着分离出沉淀物；(b-2)将所分离的沉淀物溶解于液体介质中并超滤所得溶液；以及(b-3)对已被超滤的溶液进行阴离子交换色谱分离。22.如权利要求21所述的方法，其中在操作(b-Ι)中，所述细胞的所述移除是使用至少一种选自由深层过滤和微量过滤组成的群组的方法来进行，并且所述毒素的所述沉淀是通过将酸添加到所获得的培养物中以将所述培养物的PH值维持在3到4范围内来进行，而且在操作(b-2)中，所述超滤是使用截留分子量为IOOkDa或以下的膜来进行。23.如权利要求13所述的方法，其中操作(a)和(b)中的至少一个操作是使用已预先灭菌的一次性容器来进行，并且在每一操作中，以不与所述容器的外部连通的方式转移样品O全文摘要本发明提供一种通过使用含有植物源性组分的培养基来制备肉毒梭菌毒素的方法和一种通过使用挠性密闭容器来制备肉毒梭菌毒素的方法。文档编号C12P21/04GK102089438SQ200880130354公开日2011年6月8日申请日期2008年7月2日优先权日2008年5月19日发明者丁贤壕,尹英淑,李炳国,梁起赫,洪衡杓,金学佑申请人:玫帝托克斯股份有限公司