专利名称：壳聚糖替代外源植物激素培养生产植物离体细胞的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物离体细胞培养领域。更具体地，本发明涉及新的用壳聚糖替代外源植物激素培养生产植物离体细胞的方法以及含壳聚糖的植物细胞培养基。
在一般情况下的植物细胞离体培养，都需要添加外源植物激素，如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、激动素(KT)、萘乙酸(NAA)、吲哚乙酸(IAA)等。如果直接食用或人体外用这些培养细胞或未完全去除外源植物激素的生物活性物质，就会对人体产生副作用。因此，本领域迫切需要开发在植物细胞培养中去除外源植物激素，同时又能加速植物细胞生长的方法。
本发明的一个目的就是提供一种培养植物离体细胞的方法，该方法在加速植物细胞生长的同时又能使生产出的植物细胞仅含有极少或甚至不含有外源的植物激素。
本发明的另一目的是提供新的适用于本发明方法的植物离体细胞培养基。
本发明的另一目的是提供壳聚糖的新用途。
在本发明的第一方面，提供了一种培养植物离体细胞的方法，它包括在适合植物离体细胞生长的条件下，培养植物细胞，其中在培养基中不含有外源植物激素，且培养基中含有壳聚糖。
在本发明的一个实施例中，壳聚糖的浓度为0.005g/L-0.5g/L；更佳地，壳聚糖的浓度为0.01g/L-0.25g/L。
在本发明的第二方面，提供了一种植物离体细胞培养基，其中在培养基中不含有外源植物激素，且培养基中含有壳聚糖。
在本发明的第三方面，提供了一种壳聚糖的用途，其中，所述的壳聚糖替代外源植物激素用于植物离体细胞的培养。
在附图中，
图1显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖(低分子量)培养人参细胞28天的情况。从左至右，分别为-H8(去除外源植物激素后第8次继代培养)；0.1×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CL；1.0×10-3克/升CL；2.0×10-3克/升CL；4.0×10-3克/升CL。
图2显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖培养人参细胞56天的情况。从左至右，分别为-H(去除外源植物激素培养)；0.1×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CH；1.0×10-3克/升CH；2.0×10-3克/升CH；4.0×10-3克/升CH。
图3显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖培养人参细胞40天的情况。从左至右，分别为-H(CK对照)；0.1×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CL；1.0×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CH。
图4显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖培养人参细胞20天的情况。从左至右，分别为对照；0.01×10-3克/升CL；0.01×10-3克/升CH；0.005×10-3克/升CL；0.005×10-3克/升CH。
图5显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖培养人参细胞18天的情况。从左至右，分别为-H10(去除外源植物激素后第10次继代培养)；0.01×10-3克/升CL；0.02×10-3克/升CL；0.01×10-3克/升CH；0.02×10-3克/升CH；1.0×10-3克/升CH。
图6显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖悬浮培养人参细胞46天的情况。从左至右，分别为0.5×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CL；-H。
图7显示了在无外源植物激素下，添加壳聚糖悬浮培养人参细胞56天的情况。从左至右，分别为0.5×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CH；0.5×10-3克/升CL；0.5×10-3克/升CL。
本发明基于本发明人在筛选促进植物细胞生长的物质时发现，即壳聚糖具有明显加快植物细胞生长速度的作用。在此发现基础上，完成了本发明。
如本文所用，“外源植物激素”指不是培养中的植物细胞自身产生的、促进植物细胞生长的激素物质。常见的外源植物激素包括(但并不限于)2，4-D、KT、NAA、IAA。
如本文所用，“壳聚糖”是脱去分子中乙酰基的甲壳素。而甲壳素是由2-乙酰胺-2-脱氧葡萄糖单体通过β-(1，4)糖苷联结而成的直链多糖[胡玉文，吴姣莲，1994，植物生理学通讯，30(4)294-296]。
适用于本发明的壳聚糖没有任何限制，它可以是各种规格的壳聚糖，例如分子量较低的壳聚糖(如103道尔顿级的壳聚糖(简称为“CL”))和分子量较高的壳聚糖(如105道尔顿级的壳聚糖(简称为“CH”))。通常，壳聚糖的均分子量为1×103-1×106道尔顿或更高，较佳地为1×103-5×105道尔顿。
在本发明中，壳聚糖的使用浓度范围通常为0.001g/L～1g/L，较佳地为0.005g/L～0.5g/L，更佳地为0.01g/L～0.25g/L。
适用于本发明的植物离体细胞没有任何特别限制，它包括各种植物细胞。例如合适的植物离体细胞包括(但并不限于)人参、西洋参、紫草、铁皮石斛、番红花、甜菊。较佳地，所述的植物细胞选自人参、西洋参、紫草、铁皮石斛、番红花、甜菊。
适用于本发明的植物培养基包括任何植物细胞培养中常用的培养基。合适的培养基例子包括(但并不限于)67-V培养基、MS培养基、White培养基、AA培养基、B5培养基、CPW培养基、KM8P培养基、KPP(Kao)培养基、N6培养基、NN培养基、NT培养基、WPM培养基。
通常，植物培养基包括的营养成分包括氮、磷、钾、钙、镁、铁、微量元素和维生素等，另外还要根据需要，添加不同的植物激素。然而，本发明的培养基中不含有外源植物激素，或者只含有极低浓度(如浓度为常规有效浓度的约25％或更低，例如以激动素为例，浓度小于0.05毫克/升，较佳地低于0.02毫克/升；以2，4-D为例，浓度小于0.5毫克/升，较佳地低于0.2毫克/升)的外源植物激素。
利用本发明，不仅可以显著地减少或消除外源植物激素的使用，而且同样可以实现促进植物的生长。
此外，壳聚糖本身又是一种保健品。具有多种功能免疫调节作用，抑制肿瘤作用，调节血脂，抗菌、保湿、透气、促进组织再生作用，是目前已知的唯一带阳离子的动物性纤维。壳聚糖还具有治疗顽固性皮肤病的作用。因此用它来替代外源植物激素，不仅促进了植物细胞生长，而且没有副作用，还具有附加的治疗、营养、保健、美容的作用。
在经济植物细胞培养过程中往往需要利用寡聚糖类的激发子来提高细胞合成生物活性物质的能力。而壳聚糖可来源于真菌、昆虫、水生生物等。在真菌、昆虫侵染和食用植物时，植物会产生抗性反应。而产生这种抗性反应的结果往往就是植物体内的生物活性物质的提高。因此在利用壳聚糖促进植物细胞生长的同时，往往还可以同时提高培养植物细胞的生物活性物质的产量。
在另一方面，植物经壳聚糖处理后，往往它们的壳多糖酶(几丁质酶)会提高。这就有利于降解加入培养基中的高分子量的壳聚糖。因为壳聚糖的均分子量与它的保健功效息息相关。实现高分子壳聚糖体外降解，使均分子量适当降低来提高壳聚糖的吸收和作用效果，是问题的关键。通常采用的是化学的方法或微生物降解的方法。在本发明方法中，利用在培养具有高效营养价值的经济植物细胞的同时，可提高壳聚糖的功效，这是本发明的一大优点。即利用壳聚糖替代外源植物激素促进培养植物细胞生长的系统，又成了同时降解壳聚糖的生物转化系统。
因此，在植物细胞培养基中加入壳聚糖，不仅可促进植物细胞生长，又可进一步提高生物活性物质的产量，还可利用植物细胞降解高分子量壳聚糖从而生成低分子量的壳聚糖。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1用壳聚糖替代外源植物激素培养人参植物离体细胞1.1材料培养人参(Panax ginseng C.A.Meyer)愈伤组织细胞，培养在用0.8％琼脂固化的67-V固体培养基上(Veliky和Martin，1970，Can JMicrobiol，16223～226)，并在培养基中附加CoCl2和ZnSO4各2.5mg/L的[李新兰和朱蔚华，1993，中药材，16(6)3～4]，25℃暗培养。人参悬浮细胞培养在67-V液体培养基中，25℃，100rpm的恒温振荡器中进行暗培养。人参细胞均28天转接一次。
1.2人参皂苷提取与测定称取人参细胞，以无水乙醇研磨提取，再以水饱和的正丁醇萃取，最后用香荚醛-冰乙酸法进行比色测定，并以人参二醇为标准样品[王慕邹等，1979，药学学报，14(5)309～315；章观德等，1980，药学学报，15(3)175-180]。
1.3去除外源植物激素的人参细胞培养从培养基中含有2，4-D、NAA、IAA和KT的原人参细胞系出发，开始去除外源植物激素培养人参细胞的工作。采用筛选细胞、驯化和选择非植物激素类的物质来获得不加外源植物激素培养并能快速生长的人参细胞。在此过程中发现壳聚糖具有独特的效果。
1.4壳聚糖实验用于本实施例的壳聚糖有(1)均分子量在103D级的分子量较低的壳聚糖(CL)和(2)均分子量在105D级的分子量较高的壳聚糖(CH)。
首先在去除了激素的人参细胞培养基(67-V培养基)中加入了浓度从0.1-4.0g/L的壳聚糖CL和CH。
结果如
图1-3所示。
结果表明，在壳聚糖浓度较高的情况下，比如浓度达2.0和4.0g/L时对细胞的生长是不利的，这可能是由于高浓度壳聚糖影响了细胞吸收培养基中的养分(
图1和2)。而在壳聚糖浓度较低时，比如0.1-1.0g/L时有改善人参细胞生长状况的现象(
图1、2和3)。
实施例2壳聚糖的使用浓度为了确定最佳的壳聚糖使用浓度。在本实施例中进一步降低了壳聚糖的使用浓度。其中CH和CL的用量分别为0.01和0.005g/L。
结果如图4和5所示。结果表明，在CL和CH浓度低至0.01g/L和0.005g/L时，壳聚糖仍可以显著的促进细胞的生长。
对人参细胞鲜重的测定也证实了这一结果(表1)。
表1.比较培养23天人参细胞的鲜重
对细胞中人参皂苷含量测定发现，加入适量壳聚糖进行培养的人参细胞中，人参皂苷的含量增高了约30％(表2)。这表明，人参细胞中的活性物质含量增加了。
表2.比较培养23天人参细胞中皂苷含量
实施例3壳聚糖分子量高低对培养的影响在该实施例中，在液体培养基(67-V)中分别加入0.01g/L的CL和CH，以及0.5g/L的CL和CH。
结果如图6和7所示。结果表明，在液体培养基中分别加入0.01g/L的CL和CH人参细胞能够良好的生长。在分别加入0.5g/L的CL和CH进行人参细胞悬浮培养，出现了不同的结果。在第一个月中加入CL的培养基中人参细胞生长良好，而加入CH的培养基中人参细胞生长受到抑制。然而在经2个月的培养后，人参细胞就又可以生长了。这可能是人参细胞分解了高分子的壳聚糖后，又重新开始生长(图6和7)。在加入壳聚糖后悬浮培养的人参细胞中人参皂苷的含量更高(表3)。
表3比较悬浮培养1.5月人参细胞中皂苷含量
实施例4含有壳聚糖以替换外源植物激素的培养基按常规配方配制含有壳聚糖以替换外源植物激素的培养基67-V培养基、MS培养基、White培养基、AA培养基、B5培养基、CPW培养基、KM8P培养基、KPP(Kao)培养基、N6培养基、NN培养基、NT培养基、WPM培养基，不同点仅在于壳聚糖的浓度为0.005g/L，0.05g/L，0.5g/L，而且这些培养基中不含有其他任何外源植物激素。
实验结果表明，这些培养基同样可满足植物细胞生长的需要。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.一种培养植物离体细胞的方法，它包括在适合植物离体细胞生长的条件下，培养植物细胞，其特征在于，在培养基中不含有外源植物激素，且培养基中含有壳聚糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，壳聚糖的浓度为0.005g/L-0.5g/L。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，壳聚糖的浓度为0.01g/L-0.25g/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物离体细胞是选自下组的植物细胞人参、西洋参、紫草、铁皮石斛、番红花、甜菊。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖的均分子量为1×103-1×106道尔顿。
6.一种植物离体细胞培养基，其特征在于，在培养基中不含有外源植物激素，且培养基中含有壳聚糖。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，壳聚糖的浓度为0.005g/L-0.5g/L。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的壳聚糖的均分子量为1×103-1×106道尔顿。
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的外源植物激素选自下组2，4-二氯苯氧乙酸、激动素、萘乙酸、吲哚乙酸。
10.一种壳聚糖的用途，其特征在于，所述的壳聚糖替代外源植物激素用于植物离体细胞的培养。
全文摘要
本发明公开了一种培养植物离体细胞的方法,它包括在适合植物离体细胞生长的条件下,培养植物细胞,其中在培养基中不含有外源植物激素,且培养基中含有壳聚糖。本发明还公开了用壳聚糖替换外源植物激素的培养基。用本发明培养植物细胞,不仅可促进植物细胞生长,又可进一步提高生物活性物质的产量,还可利用植物细胞降解高分子量壳聚糖从而生成低分子量的壳聚糖。
文档编号C12N5/04GK1347984SQ0012563
公开日2002年5月8日 申请日期2000年10月10日 优先权日2000年10月10日
发明者蔡伟明 申请人:中国科学院上海植物生理研究所