将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法,及其用途的制作方法

专利名称：将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法,及其用途的制作方法
技术领域：
本申请涉及将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法，新融合蛋白及其用途。
背景技术：
很多注意力都集中在产生免疫反应方面。对外源抗原的一种类型的免疫反应是产生抗体，通常称之为体液免疫。第二种形式的免疫反应是通过抗原呈递细胞(APC)呈递抗原产生的。这种类型的免疫反应被广义地称为细胞介导的免疫反应(CMI)，或T细胞反应。尽管这两种类型的免疫反应都是重要的，最近将主要注意力集中在CMI上。在处理诸如由人类免疫缺陷病毒(HIV)导致的AIDS的感染性疾病时，未能证实针对所述病毒及其部分的抗体反应足以产生免疫性。类似地，在处理与很多恶性肿瘤相关的外源蛋白时，也未能证实所述抗体反应是足够的。因此，将注意力集中在产生CMI反应方面。
为了诱导CMI，必须将一种抗原结合在APC表面上的主要组织相容性复合体(MHC)I类或II类分子上。I类分子通常将抗原，如内源蛋白，所述蛋白来自病毒感染，以及肿瘤抗原呈递到外面。当由宿主I类MHC编码的分子呈递病原体来源的(或癌)肽表位(通常8-10个氨基酸)时，抗原特异性T细胞通常能识别受感染的靶细胞(7)。所述表位源于被蛋白体裂解成小的肽片段的细胞质蛋白。这些片段随后被转运到内质网(ER)腔中，在这里它们与新合成的MHC-I分子复合，然后转运到细胞表面，在这里发生T细胞识别(8-13)。细胞外流体中的抗原(外源抗原)通常不能进入大多数细胞的这种加工区室。因此，用疫苗诱导CMI的一个主要挑战是，将外源抗原递送到胞质溶胶内，以便由MHC I类分子呈递。希望能够制备多种感染性疾病，如HIV，以及癌症，如前列腺癌，乳腺癌和黑素瘤的疫苗。
例如，越来越多的证据表明CMI在控制HIV感染方面发挥重要作用(Ogg等，Science 2792103-6(1998)；Schmitz等，Science 283857-60(1999)；Brodie等，Nat.Med.534-41(1999))。接触过HIV但是仍然没有被感染的个体，通常具有抗病毒CMI，但是没有抗体反应。在形成特异性抗体之前，初次感染的病毒血症，是通过病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)形成而解决的(Letvin，Science 2801875-96(1998))。以上数据表明了CMI在控制HIV感染方面发挥着关键作用。
很多肿瘤与特定蛋白的表达和/或某些蛋白的过量表达相关。例如，前列腺癌与升高水平的蛋白，如前列腺特异性抗原(PSA)相关。乳腺癌可能与诸如Her-2，Muc-1，CEA之类的蛋白的表达和/或过量表达相关。因此，相当大的注意力集中在试图产生免疫反应方面，特别是在治疗所述恶性肿瘤时产生针对所述抗原的CMI。
产生针对传染性疾病的细胞介导的免疫性的方法包括使用完整的感染剂，例如，通过制备遗传工程化的失活病毒或使用杀灭的感染剂。另一种方法是亚基疫苗，它能将一种或多种抗原(而不是完整病毒)呈递给受治对象。
为了产生CMI，必须将抗原递送到细胞内部。所述细胞对外源蛋白的吸收很差。因此，优选方法是使用诸如病毒载体、脂质体、裸DNA的方法或类似方法。不过，所述方法具有诸多缺陷。例如，很多重组病毒在反复施用时，其本身会产生抗原性反应。由于产生免疫反应的标准形式通常需要被称为激发的起始注射，和被称为加强的后续注射，以便获得满意的免疫性，这可能是一个严重问题。另外，尽管大部分注意力一直集中在改善病毒载体的安全性方面，但是总是存在某些危险。例如，很多目标群体，如HIV感染的群体可能具有减弱的免疫系统。因此，在很多个体中是完全安全的某些病毒载体在上述个体内会产生某种程度的危险。将蛋白递送到细胞内的方法也未能证明像本发明这样完全安全。因此，需要新的和简单的方法将抗原递送到胞质溶胶内，以便刺激CMI。
为了产生CMI反应，还存在难于测定所述反应的技术问题。
用于检测细胞介导的免疫反应的现有实验室测定方法具有严重缺陷，特别是在应用于各种临床设置中的大规模疫苗效力试验时更是这样，这是因为使用现有技术测定CMI所需要的现有设备和技术支持，通常在需要它们的野外设施中是很少的。人们认为CTL在控制HIV-1感染方面起着关键作用，并且设计了多种HIV-1疫苗候选物，以便刺激T细胞反应，和中和抗体(1-6)。不过，用于检测CMI，如HIV-特异性CTL的标准实验室方法是复杂的、费时间的、并且通常局限于高度专业化的设备。用于检测T细胞反应的改进方法，将会对T细胞依赖性疫苗或免疫治疗的开发产生显著影响。这种策略有可能被应用于其他研究领域，其中，已知CMI反应在预防和控制疾病方面起着重要作用。
体外检测CMI反应的一个困难是因为对抗原呈递的特殊需要。如上文所述，将外源蛋白递送到胞质溶胶内，以便通过MHC I类分子呈递给T细胞是一种重大挑战。所述I类途径的物理学分配一直是在体外检测T细胞反应的主要障碍。因此，大部分测定CMI的现有实验室方法，采用活病毒或细菌载体将抗原递送到胞质溶胶中，其中，诸如痘苗病毒的重组痘病毒是最常使用的。另一种方法是使用源于已知CTL表位的合成肽(10-20个氨基酸)从外部将MHC-I分子加载到靶细胞表面上。这种方法在一般临床应用中具有严格限制。诸如重组痘苗病毒的活病毒载体的使用，需要受过训练的和免疫过的实验室人员，包括最低污染设施，作为预防性安全措施。合成肽不仅价格十分昂贵，而且适合各种群体的多样性MHC-I分子的“通用”肽特征的设计也是极其困难的。因此，开发测定T细胞反应的测定方法的挑战是将外源抗原的大片段递送到胞质溶胶内，而又不依赖活的重组病毒或细菌载体。
因此，需要能够用于体外检测CMI的试剂盒。特别是可方便地在诸如非洲、印度和亚洲的遥远地方使用的试剂盒，在这些地方，有很多建议要检测大量的疫苗候选物，如抗HIV的疫苗。
现在，我们已经发现诸如炭疽芽孢杆菌的二分蛋白外毒素家族包含可用于将诸如蛋白的外源抗原递送到胞质溶胶中的片段。来自所述蛋白的一种优选的蛋白片段，是含有保护性抗原(PA)结合结构域的N-末端部分，而不是会产生对所述细胞的毒性的部分。更优选地，所述片段业已修饰过，以便除去结合PA的特定结构域。
炭疽芽孢杆菌是动物和人类炭疽病的致病剂。由炭疽芽孢杆菌产生的毒素由两种二分蛋白外毒素，致死毒素(LT)和水肿毒素组成。LT由保护性抗原(PA)和致死因子(LF)组成，而水肿毒素由PA和水肿因子(EF)组成。三种成分PA，LF和EF中，没有一种单独是有毒性的。不过，一旦组合在一起，水肿毒素能导致水肿，而LT通过在动物和人体内的系统性休克能导致死亡。与它在形成两种毒素中的关键作用吻合，业已将PA确定为抗炭疽病疫苗的保护性成分。目前对炭疽毒素作用的分子机制的假设如下PA是具有735个氨基酸的多肽，它通过细胞受体与哺乳动物细胞表面结合。一旦结合之后，通过细胞蛋白酶将PA裂解成63-kDa的分子而被激活，它在靶细胞的细胞质膜中能形成环形七聚体(

图1)(6，7)。所述PA七聚体然后与通过胞吞作用而内化的EF或LF结合。在内体酸化之后，PA使得EF或LF能进入胞质溶胶，推测是通过由所述七聚体的形成的一个孔进入的。在胞质溶胶中，EF起着腺苷酸环化酶的作用(8)，将ATP转化成cAMP。异常高水平的cAMP干扰了细胞代谢。
LF在胞质溶胶中的作用是通过一种尚不十分了解的机制导致宿主细胞死亡。LF能诱导大量淋巴因子的过量产生(9)，导致了宿主动物中的致死性系统性休克。最近的研究业已表明，LF具有两种酶促活性它能起着锌金属蛋白酶的作用(10)，并且它能使促分裂原活化的蛋白激酶失活(11)。尽管仍然不清楚LF的这两种酶促活性是如何联系在一起的，不过，这两种活性都是LF毒性所必须的。以前业已报导过，炭疽毒素B成分可用于递送表位，所述表位在存在PA的情况下又能通过所述免疫系统诱导免疫反应(WO 97/23236)。
LF是具有796个氨基酸的多肽，并且决定这两种酶促活性的功能结构域位于383-796号氨基酸之间(图2A)(12)。没有该催化结构域的N-末端截短的LF在与PA混合并且添加到培养的噬菌体中后，或在注射到动物体内后完全没有任何毒性作用。不过，它仍然能有效结合PA。LF的PA结合结构域(LFn)由1-225号氨基酸组成(图2B)(12)。
发明概述本发明提供了将外源抗原递送到细胞质中的方法，新融合蛋白及其用途。
另外，我们业已发现可以将被修饰而使毒素结构域失活的致死因子转运因子、其片段，如LFn和LFn的片段，如包括所述片段的羧基部分的片段用作转运因子与没有PA的靶抗原融合，以便将所述抗原递送到胞质溶胶内。所述转运因子优选是LFn或其片段。一种优选类型的LFn片段是不含PA结合结构域的片段。所述转运因子更优选是LFn。例如，LFn的最靠近羧基末端的60个氨基酸可以用作转运因子；更优选最靠近羧基末端的80个氨基酸。人们还可以使用其他片段。例如，可以使用含有更多致死因子蛋白的片段，只要使其毒素部分失活就行。所述转运因子片段优选包括LFn的最靠近羧基末端的80个氨基酸的部分，并且包括该片段的其他部分，只要除去了含有毒性的部分就行。所述片段优选为350个氨基酸或更少，更优选300个氨基酸或更少，甚至更优选250个氨基酸或更少。一种优选的片段是105个氨基酸或更少。一种更优选的片段是80个氨基酸或更少。然后，将该转运因子连接到希望递送到胞质溶胶中的抗原上。这一目的可以通过本领域众所周知的技术实现。例如，可以制备含有希望递送到所述细胞的胞质溶胶中的抗原的融合蛋白。
本发明的优选方法的特征在于在接受治疗的动物体内诱导细胞介导的免疫反应的新多肽。
本发明提供了编码本发明的新融合多肽的DNA，以所述DNA序列为特征的重组DNA分子，用所述DNA序列和分子转化过的单细胞宿主，以及使用所述序列、分子和宿主产生所述新多肽和对本发明所需的抗原的CMI免疫反应的方法。
在另一种优选实施方案中，本发明提供了包含一种或多种本发明的新融合肽的药物组合物。这种组合物能有效诱导细胞介导的免疫反应。在一种优选实施方案中，可将其用作疫苗。在另一种实施方案中，可以将所述融合蛋白用于制备生产细胞，优选用于生产多种蛋白特别是业已证实在所述细胞中难于表达的蛋白的细菌生产细胞。
在另一种优选实施方案中，本发明提供了一种用于检测细胞介导的免疫反应的方法。
在另一种优选实施方案中，本发明提供了用于体外检测细胞介导的免疫反应的试剂盒。
附图简述图1是表示PA-介导的LFn通过胞吞作用进入细胞，以及随后由MHC-I类分子呈递的示意图。
图2A-C表示各种致死片段(LF)多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO1)。图2A表示LF的完整长度氨基酸序列。图2B表示LFn的前289个氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。图2C表示致死因子的185-289号氨基酸的序列，有时称之为片段3(SEQ ID NO3)。
图3A-B是表示靶的LFn的呈递是不依赖于PA的曲线图。在标准铬释放测定中以10∶1的效应细胞与靶(E∶T)的比例，检测业已充分表征的CTL克隆的活性。靶细胞是HLA-匹配的EBV-转化细胞系，业已在有或没有PA的条件下用LFN敏化过夜。所使用的对照是重组痘苗载体(将NYCBH用于对照，而rVV-Nef或Env肽用于合适的克隆)。图3A表示Nef-特异性克隆(KM)的活性，所述活性是用Nef重组痘苗载体，对PA和LfnNef或LFn Nef自身温育过夜的B60限制性靶细胞测试的。包括每一种靶细胞的本底/对照(对照PA-LFn，LFn)。图3B表示Env-特异性CTL克隆(SP 511)能以剂量依赖性方式识别用LfnEnv标记过的靶细胞，并且，同样是不依赖于PA的。所使用的对照是肽Env 106B(100，μg/ml)。所列举的LFn构建体的剂量以μg/ml为单位(LfhEnv 5＝5μ/ml的LfnEnv)。
图4A-B是表示LFn-HIV识别是HLA限制性的曲线图。4A表示用HLA匹配的和错配的用LFn-p24敏化的B-LCL检测HLA-B14限制的Gag克隆(AC13)的活性，并且是在标准铬释放测定中检测的。用Rw-Gag作对照。图2B表示B60 Nef克隆(KM)的HLA-限制作用，这是用HLA匹配的和错配的用LFnNef敏化的靶细胞证实的。用Lfn-Nef和最佳Nef肽敏化TAP缺陷型(T2)，HLA-B60靶细胞，并且检测裂解。T2 LfnNef靶细胞缺乏活性表明需要蛋白体加工。所有克隆都是以10∶1的E∶T比例使用的，并且将裂解水平从所述本底对照中扣除。将NYCBH用于重组痘苗病毒对照，并且将LFn本身用于LFnP24和LfnNef。阳性对照包括Nef肽180和重组痘苗载体Gag(rvv-Gag)。
图5A-B是表示LFn-HIV的内化和加工的曲线图。图5A表示在存在布雷菲尔德菌素A、细胞松弛素B和氯喹的条件下，用LfnNef敏化的HLA-匹配的靶细胞与单独使用LfnNef相比敏化的HLA-匹配的靶细胞的Nef特异性克隆(KM)裂解作用。与细胞松弛素B和布雷菲尔德菌素A共同温育，破坏了Nef-特异性克隆的识别作用，但是与氯喹一起温育则不能。图5B表示相同Nef克隆的活性，用表达Nef的重组痘苗病毒感染靶细胞过夜，或用最佳表位肽Nef 180自身敏化或在存在氯喹、细胞松弛素B或布雷菲尔德菌素A的条件下敏化。当在存在细胞松弛素B、氯喹或布雷菲尔德菌素A的条件下温育靶细胞和CTL克隆时，没有发现活性的显著降低。所示出的裂解水平扣除了低于10％的本底裂解作用。
图6A-E是表示在Elispot测定中LFn-HIV表达的曲线图。将来自HIV-1感染的个体的具有已知HIV-特异性CTL活性或表位的低温保存的PBMCs用于Elispot测定，该测定使用了重组痘苗病毒或LFn-HIV。将LFn自身和NYCBH用作对照。使用重复的孔，每孔100K细胞。结果以SFC/百万(每一百万的成斑点细胞)形式报道。
图7A-B是表示在细胞内流式(flow-based)测定中LFn-HIV表达的FACS曲线图。IFN-γ在Nef特异性克隆(KM)中的细胞内生产(A)以及来自具有Env-特异性CTL活性的血清阳性个体(AC2)的PBMC(B)。将未刺激过的细胞用作阴性对照(1)，并且将重组痘苗病毒用作阳性对照(2)，分别使用LfnNef和LfnEnv(3)。
图8A和B是表示LFn融合蛋白的示意图。
图9是表示LFn融合蛋白的一系列示意图。
图10表示CHO细胞对LFn-GFP的细胞摄取。在胶原处理过的有隔室的载玻片中培养CHO细胞，达到80％的铺满度，然后与纯化的LFn-GFP一起温育1小时，然后用PBS和PBS+蛋白酶充分洗涤，以便除去膜结合蛋白。然后用抗运铁蛋白抗体对所述细胞进行染色，并且用低聚甲醛固定。通过共焦显微术分别检测所述载玻片的绿色(GFP，(Super-expose)如图10A-D所示)和红色(抗运铁蛋白，如图10E-H所示)。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，形成了每一个视野的第三种图像(图10I-L)。因此，黄色斑点表示GFP可能存在于与运铁蛋白相同的斑点内，因此，提供了对所述细胞内GFP定位的参考。如图10A-D所示，在用LFn-GFP处理1个小时的细胞中，有大量可见的绿色斑点，表明LFn-GFP确实可以进入细胞。
图11表示CHO细胞对GFP的细胞摄取，使用了与图10所述相同的条件。图11A，D和G表示用GFP温育CHO细胞1小时的结果；图11B-C，E-F和H-I表示用GFP温育CHO细胞2小时的结果。图11A-C表示通过共焦显微术检测绿色(GFP)的细胞视野；图11D-F表示通过共焦显微术检测红色(抗运铁蛋白)的相应视野；通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，提供了每一个视野的第三种图像(图11G-I)。GFP处理过的细胞表现出少数绿色斑点(图11)。
图12表示GFP和LAMP-2免疫荧光的共同定位，用于表明所述溶酶体，使用了与图10所述相同的实验方法。图12A-D表示通过共焦显微术检测红色的细胞视野(LAMP-2)；图12E-H表示通过共焦显微术检测绿色的相应视野(LN-GFP)。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，提供了每一个视野的第三种图像(图12I-L)。
图13表示GFP和EEA-1免疫荧光的共同定位，用于表明核内体，使用图10所述相同的实验方法。图13A-D表示通过共焦显微术检测红色的视野(EEA-1)；图13E-H表示通过共焦显微术检测绿色的相应视野(LN-GFP)。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，提供了第三种图像(图13I-L)。
图14表示GFP和抗高尔基抗体的共同定位，使用与图10所述相同的实验方法。图14A-B表示通过共焦显微术检测红色(抗高尔基抗体)的细胞视野；图14C-D表示通过共焦显微术检测绿色(LN-GFP)的相应视野。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，提供了每一个视野的第三种图像(图14E-F)。
图15表示GFP和抗-20s免疫荧光的共同定位，用于表示所述蛋白体。条件类似于在图10所使用的条件，所不同的是，将HeLa细胞与40μg/ml LNgfp共同温育2小时。图15A-D表示通过共焦显微术检测红色(抗20s抗体)的细胞视野，图15E-H表示通过共焦显微术检测绿色(LN-GFP)的相应视野。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，提供了每一个视野的第三种图像(图15I-L)。通过比较图12-15中的不同图像，具有大部分黄色斑点的叠加的图像是图15所示的图像，其中，绿色斑点表示细胞内LFn-GFP，它与表示细胞蛋白体的红色斑点显著重叠。
图16表示与缺乏PA相比，在类似于图15所使用的条件下，添加PA不会增加细胞内绿色斑点的数量。图16A-F表示在没有PA的条件下用LN-GFP温育HeLa细胞；图16G-L表示在有PA的条件下温育HeLa细胞。图16A-B和G-H表示通过共焦显微术检测红色(抗20s抗体)的细胞视野，图16C-D和I-J表示通过共焦显微术检测绿色(LN-GFP)的相应视野。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像提供了每一个视野的第三种图像(图16E-F和K-L)。
图17中分别用不同的抗原制剂腹膜内注射免疫三组BALB/c小鼠，每组4只(15μg LFn-p24加4μg PA，15μg LFn-p24+4μg PA加明矾，15LFn-p24仅加明矾)。在免疫之后1周，将来自免疫过的BALB/c小鼠的脾单核细胞用作CTL源。通过与来自未免疫过的γ辐射过的和肽脉冲的BALB/c脾细胞一起培养，体外激活脾培养物中的CTL。在37℃下，在CO2孵育箱中培养6天之后，检测成熟的CTL(效应细胞)裂解51Cr-标记过的P20肽脉冲的P815细胞(阳性靶细胞)或51Cr-标记过的介质脉冲的细胞(阴性靶细胞)的能力。所示出的裂解百分比扣除了阴性靶细胞的本底裂解，并且是以每一组的平均值形式提供的。
图18中分别用15μg LFn-p24，15μg MLFn-p24和15μg p24通过腹膜内注射免疫三组BALB/c小鼠，每组4只。免疫1周之后，检测脾组织中的CTL。
发明详述现在，我们业已发现了一种用于将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法，包括在没有保护性抗原(PA)的条件下将靶抗原(如蛋白)结合于含有二分蛋白外毒素的片段的转运因子。优选将所述靶抗原融合于所述转运因子。所述转运因子优选是来自炭疽芽孢杆菌的致死因子的保护性抗原结合结构域，它由1-288号氨基酸(SEQ ID NO2)或其不包括PA结合结构域的片段，如羧基部分组成。例如，所述转运因子的优选类型的氨基酸LFn1氨基酸片段的最靠近羧基末端的大约80个氨基酸的片段包括至少80个氨基酸，通过用预设参数进行Blast分析，发现它与SEQ ID NO2具有至少80％的同源性。更优选的是，该片段与它具有至少90％的同源性，更优选，与它具有至少95％的同源性。所述片段优选不包括PA结合结构域。一种优选的转运因子是LFn片段或其部分。更优选的是，所述转运因子包括LFn的最靠近羧基末端的至少60个氨基酸，但不包括PA结合结构域。一种优选的片段具有来自SEQ ID NO2的羧基部分的大约105个氨基酸或更少。
所述靶抗原可以包括希望诱导针对它的CMI反应的任何分子，包括病毒抗原和肿瘤抗原。
本发明的一种实施方案提供了一种包含所生产的新融合多肽的组合物。本发明的另一种实施方案包括通过将外源蛋白递送到胞质溶胶中而检测CMI反应的测定方法。一种优选实施方案提供了用于检测CMI反应的试剂盒。
本发明的新融合多肽包括与靶抗原连接的转运因子。所述转运因子可以包括任何二分蛋白外毒素的片段，该片段能在缺乏保护性抗原的条件下将所述蛋白递送到胞质溶胶中，而且不包括任何有毒性的片段。该转运方法不依赖于PA相关的途径，因此不需要PA。一种优选的外毒素是炭疽芽孢杆菌的致死因子(LF) (SEQ ID NO1)(图2A)。LF的PA结合结构域是LFn的一部分，或它的可以跨过细胞膜的片段，由1-255号氨基酸组成(SEQ ID NO2)(图2B)。LFn的任何片段都可以用作转运因子。它优选不包括PA结合结构域，该结构域存在于LFn的N-末端的一半(1-149号氨基酸)。一种优选片段具有来自SEQ ID NO2的羧基部分的105个氨基酸或更少。优选最靠近羧基末端的60个氨基酸，更优选最靠近羧基末端的80个氨基酸，一种优选的转运因子是片段3(SEQID NO3)(图2C)。
人们还可以将其他片段用作转运因子。所述转运因子优选是350个氨基酸或更少，更优选300个氨基酸或更少，更优选它是250个氨基酸或更少。
优选用作所述转运因子的其他片段与LFn的片段3(SEQ ID NO3)具有至少55％的同源性(图2C)。例如，炭疽芽孢杆菌的水肿因子的片段使用预设参数通过Blast分析，发现与片段3具有大约57％的同源性。更优选它与之具有至少65％的同源性，更优选它与之具有至少75％的同源性；更优选它与之具有至少80％的同源性；更优选它与之具有至少90％的同源性；更优选它与之具有至少95％的同源性。
将所述转运蛋白连接在任何希望递送到胞质溶胶中的抗原上。所述连接优选是融合蛋白形式的。不过，可以产生现有技术中已知的其他接头。例如，一种接头单元可能是所述转运蛋白的一部分，然后通过化学方法将其连接在靶抗原上。优选的抗原包括病毒、细菌、寄生虫和肿瘤相关抗原。优选的病毒抗原包括来自任何病毒的蛋白，其中，需要一种细胞介导的免疫反应。特别优选的病毒包括HIV-1，HIV-2，肝炎(包括乙型和丙型肝炎)病毒，埃博拉病毒，西尼罗病毒和疱疹病毒，如HSV-2。优选的细菌抗原包括来自鼠伤寒沙门氏菌和分支杆菌(包括结核分支杆菌)的抗原。优选的寄生虫抗原包括来自疟原虫属(包括恶性疟原虫)的抗原。
优选的肿瘤抗原包括在诱导T细胞反应时被识别的表位，包括但不局限于以下各种前列腺癌抗原(如PSA，PSMA等)，乳腺癌抗原(如HER2/neu，小型-MUC，MUC-1，HER2受体，mammoglobulin，labyrinthine，SCP1，NY-ESO-1，SSX-2，N-末端封闭的可溶性细胞角蛋白，43kD人类癌抗原，PRAT，TUAN，Lb抗原，癌胚抗原，聚腺苷酸聚合酶，p53，mdm-2，p21，CA15-3，癌蛋白18/stathmin，和人腺体激肽释放酶)，和黑素瘤抗原等。
当人们希望在受治对象体内产生免疫反应时，优选还可以使用一种免疫佐剂。佐剂为本领域所公知，并且包括细胞因子，如IL-2，Ig-IL-2，CM-CSF，CpG，RIBL Detox(Ribi Immunochemical)，QS21(CambridgeBiotech)，不完全弗氏佐剂及其他。我们业已意外地发现，尽管明矾在现有系统中确实能抑制CTL诱导，还是将明矾优选用于刺激特异性CTL。
本发明的方法还可用于通过与CMI测定组合制备与所述转运因子融合的肿瘤抗原文库而鉴定其他癌抗原，如下文所述。
所述靶抗原可以是能够递送到胞质溶胶中的任何大小的抗原。所述靶抗原优选少于750个氨基酸，更优选少于600个氨基酸，更优选少于500个氨基酸。
本发明的新融合多肽可以包括单个靶抗原或多个靶抗原作为单个融合蛋白的一部分。一种优选的融合多肽包括若干种HIV-1蛋白的片段，如gag和nef(图8，9)。
人们还可以利用诸如HIV的感染性病毒的多种菌株制备表位(参见图9)。
所述新融合多肽可以是较大的多聚体分子的一部分，它可以是通过重组方法生产的或可以是化学方法合成的。所述多聚体还可以包括与除了氨基酸以外的部分，包括脂类和糖类融合或偶联的多肽。
所述多聚体蛋白优选由在同一分子内的重复的多个T细胞表位组成，所述表位是随机排列的，或者在它们之间具有间隔基(氨基酸或其他成分)。
可以方便地制备编码所述新融合蛋白的DNA序列。例如，编码LFn的序列是众所周知的，并且可以通过已知技术修饰，如缺失不需要的部分，如可变环，并且插入任何其他需要的编码序列，如接头片段。编码各种靶抗原的所述序列在本领域中也是已知的。另外，编码各种氨基酸残基的密码子是已知的，并且通过标准技术可以方便地制备其他编码序列。
DNA序列可以在多种动物中使用，以便表达所述新融合蛋白，所表达的融合蛋白可用于多种用途，包括用于疫苗组合物和用于CMI测定，如下文所述。
编码新融合蛋白的DNA能够以多种宿主/载体组合形式表达。载体包括化学偶联物，如披露于WO 93/04701中的偶联物，它具有导向部分(例如，细胞表面受体的配体)和核酸结合部分(例如聚赖氨酸)，病毒载体(例如，DNA或RNA病毒载体)，质粒，噬菌体等。所述载体可以是染色体、非染色体或合成载体。
例如，可用于真核宿主的表达载体包括含有源于SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺伴随病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列的载体。可用于细菌宿主的表达载体包括细菌质粒，如来自大肠杆菌的质粒，包括pBluescript，pGEX-2T，pUC载体，col E1，pCR1，pBR322，pMB9及其衍生物，较宽宿主范围质粒，如RP4，噬菌体DNAs，例如，λ噬菌体的多种衍生物，例如，λ.GT10和λ.GT11，以及其他噬菌体。可用于酵母细胞的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。可用于昆虫细胞的载体包括pVL 941。
优选的载体包括病毒载体，融合蛋白和化学偶联物。逆转录病毒载体包括Moloney鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一种优选的基于HIV的病毒载体包括至少两种载体，其中，gag和pol基因来自HIV基因组，而env基因来自另一种病毒。优选DNA病毒载体。所述载体包括疱疹病毒载体，如单纯疱疹I病毒(HSV)载体(Geller，A.I.等.，J Neurochem64487，1995；Lim，F.等.，见DNA CloningMammalian Systems，D.Glover，Ed.，Oxford Univ.Press，Oxford England，1999；Geller，A.I.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907603，1993；Geller，A.I.，I Proc Natl.Acad.Sci USA 871149，1990)，腺病毒载体(LeGalLaSalle等.，Science 259988，1993；Davidson，等.，Nat.Genet3219，1993；Yang，等.，R Virol.692004，1995)，和腺伴随病毒载体(Kaplitt，M.G.，等.，Na t.Genet.8148，1994)。将所述DNA序列与一种启动子可操作地连接，以便能在宿主细胞中表达。所述启动子为本领域所熟知，并且可以方便地选择。
可以将多种单细胞宿主细胞用于表达本发明的DNA序列。所述宿主可以包括众所周知的真核和原核宿主，如大肠杆菌、假单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉属、真菌、酵母，昆虫细胞，如草地贪夜蛾(SF9)，动物细胞，如CHO和小鼠细胞，非洲绿猴细胞，如COS 1，COS 7，BSC 1，BSC40和BMT 10，和人类细胞，以及组织培养的植物细胞。本发明的分子可用于制备多种生产细胞，这些生产细胞特别适用于生产某些目前难于在细胞中大量表达的蛋白。
包括由本发明的DNA序列编码的新融合多肽的分子可以从发酵物或细胞培养物中分离，并且用多种常规方法中的任意一种纯化，包括液相层析，如正相或反相层析，使用HPLC，FPLC等；亲和层析(如使用无机配体或单克隆抗体)；大小排阻层析；固定的金属螯合层析；凝胶电泳等等；在不超出本发明范围的前提下，本领域技术人员可以选择最合适的分离和纯化技术。
可以方便地制备所述新融合蛋白的稳定化形式，例如，通过偶联，如聚(烯化氧)偶联物。所述偶联物优选是通过将所述聚(烯化氧)的羟基末端共价键合于所述融合蛋白的不会影响其构象的部分的游离氨基而形成的。其他本领域认可的偶联所述物质的方法包括酰胺或酯连接。可以使用共价连接以及非共价偶联，如亲脂性或亲水性相互作用。
所述偶联物可以包括非抗原性聚合物，如葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，多糖，淀粉，聚乙烯醇，聚丙烯酰胺或其他类似的，基本上为非免疫原性的聚合物。优选聚乙二醇(PEG)。其他聚(烯化氧)包括单甲氧基-聚乙二醇聚丙二醇，聚乙二醇的嵌段共聚物，和聚丙二醇等。还可以用C1-4烷基取代单甲氧基基团对所述聚合物的远端进行封端。所使用的聚(烯化氧)在室温下必须可溶于液体。因此，其分子量优选为大约200-大约20,000道尔顿，更优选2,000-大约10,000，更优选大约5,000。
本领域技术普通技术人员可以理解的是，可以在所得到的本发明的新融合蛋白上偶联多种可能的成分。例如，参见″Conjugate Vaccines″，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse andR.E.Lewis，Jr(eds.)，Carger Press，New York，1989，该文献的所有内容被收作本文参考。
偶联可以通过结合两种分子的任何化学反应实现，只要所述新融合蛋白和其他部分保留其相应的活性就行。这种连接包括许多化学机制，例如，共价结合，亲和结合，嵌入，配位结合和复合。不过，优选的结合是共价结合，共价结合可以通过现有侧链的直接缩合或通过外部桥接分子的掺入而实现。很多二价和多价连接剂可用于将蛋白分子，如本发明的抗体与其他分子偶联。例如，典型的偶联剂可以包括有机化合物，如硫酯，碳二亚胺，琥珀酰亚胺酯，二硫氰酸盐，戊二醛，重氮苯和六亚甲基二胺。以上所列举的偶联剂并非是对本领域已知的各种类型连接剂的穷举，相反，它只是更常见的偶联剂的代表(参见Killen和Lindstrom，J.Immunol.1331335-2549，1984；Jansen，F.K.，等.，Imm.Rev.62185-216，1982和Vitettaetal.，同上)。
优选接头披露于文献中。例如，参见Ramakrishnan，S.，等.，CancerRes.44201-208(1984)，其中披露了MBS(M-马来酰苯甲酰-N-羟基琥珀酰亚胺酯)的用途。还可参见Umemoto等.，美国专利5,030,719，该专利披露了通过寡肽接头将卤化酰肼衍生物偶联在一种抗体上。特别优选的接头包括(i)EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基-丙基)碳二亚胺盐酸盐；(ii)SMPT(4-琥珀酰亚胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基-二硫)-甲苯(Pierce Chem.Co.，Cat.(21558G)；(iii)SPDP(琥珀酰亚胺基-6[3-(2-吡啶基二硫)丙酰氨基]己酸酯(Pierce Chem.Co.，Cat #21651G)；(iv)硫代-LC-SPDP(硫代琥珀酰亚胺基6[3-(2-吡啶基二硫)-丙酰胺]己酸酯(Pierce Chem.Co.Cat.#2165-G)；和(v)EDC偶联的磺基-NHS(N-羟基磺基琥珀酰亚胺Pierce Chem.Co.，Cat.#24510)。
上文所披露的接头包括具有不同作用的成分，因此，产生了具有不同生理化学特性的偶联物。例如，烷基羧酸酯的磺基-NHS酯比芳族羧酸酯的磺基-NHS值更稳定。含有NHS-酯的接头的溶解度比磺基-NHS酯的溶解度低。另外，所述接头SMPT含有空间位阻二硫键，并且，可以形成稳定性增加的偶联物。一般，二硫键的稳定性比其他键差，因为二硫键在体外被裂解，导致了较低的偶联物可利用性。具体地讲，磺基-NHS可以增强碳二亚胺偶联的稳定性。当碳二亚胺偶联(如EDC)被用于与磺基-NHS结合时，所形成的酯比碳二亚胺偶联反应本身更抗水解作用。
本发明的新融合蛋白可用于蛋白的稳定表达。例如，某些蛋白在某些表达系统中是难于表达的，这些系统包括细菌表达系统。与诸如LFn的转运因子融合之后，可以稳定某些所述蛋白。我们业已发现，所述转运因子优选为250个氨基酸或更少，更优选150个氨基酸或更少，更优选105个氨基酸或更少，甚至更优选80个氨基酸或更少。
本发明的融合蛋白可用于产生免疫反应，例如，作为疫苗。
典型的药物组合物是治疗有效量的新融合蛋白，它能诱导免疫反应，因此，起着预防性免疫原的作用，任选包含在可以药用的、并且相容的载体中。本文所使用的术语“可以药用的并且相容的载体”将在下文作更全面的说明，它包括(i)一种或多种相容的固体或液体填料稀释剂或胶囊化物质，所述物质适合给予人类或其他动物，和/或(ii)一种能够将所述分子递送到靶细胞中的系统。因此，在本发明中，术语“载体”表示天然的或合成的有机或无机成分，本发明的分子与它组合，以便有利于使用。术语“治疗有效量”是本发明的药物组合物能产生需要的结果或对要治疗的特定症状产生需要的影响的本发明药物组合物的量。例如，产生提供预防性保护作用的免疫反应所需要的量。通常，当所述组合物被用作预防性免疫原时，在初次给药之后，需要定期进行至少1次“加强”。在制备采用相同成分的组合物时可以使用各种浓度，以便提供针对接受治疗的患者的年龄、症状严重程度、治疗持续时间和给药方式的变化。
在一种优选实施方案中，将同样是免疫原性多肽的本发明的新融合多肽掺入多成分疫苗中，该疫苗可能包含其他免疫原性多肽。多成分疫苗可以包含本发明的新融合蛋白，以便诱导T细胞反应，并且包含其他抗原，以便诱导B细胞反应。
在一种优选的免疫方法中，可以用本发明的新融合蛋白激发，然后用不同的新融合蛋白加强。
人们还可以用含有多种不同新融合蛋白的混合物激发，并且可以用多种不同的新融合蛋白或用包含多种抗原的融合蛋白加强(图8，9)。
可以将所述新融合蛋白用于制备能够识别并且与之相互作用的多种抗原，例如，来自不同HIV菌株的抗原的多种T细胞。还可以将所述新融合蛋白的DNA序列用作亚单位疫苗。
为了产生免疫反应，如用一种疫苗组合物产生免疫反应，优选还使用一种佐剂。佐剂包括，但不局限于明矾，RIBI Detox(RibiImmunochemical)，QS21(Cambridge Biotech)，和不完全弗氏佐剂。明矾是优选的佐剂。另一类佐剂包括诸如细胞因子的免疫刺激剂，如IL-12，IL-4和诸如B7的共刺激分子。已知具有免疫刺激作用的多种分子包括诸如ICAM和LFA的辅助分子。在一种优选实施方案中，在最初的免疫给药之前，给予患者GM-CSF。GM-CSF可以用一种病毒载体给药，或作为药物制剂中的分离的蛋白给药。可以使用佐剂的组合，如GM-CSF，I CAM和LFA。尽管通常会产生针对感染性疾病抗原的强的免疫反应，而对于肿瘤相关抗原来说，通常会产生较弱的免疫反应。因此，优选将上文所述的免疫刺激剂与它们一起使用。如上文所述，明矾是优选的佐剂。
本发明的免疫刺激组合物可有利地与其他治疗方案一起使用。例如，所述系统可以与传统治疗方案联合用于癌症治疗，包括手术、放疗、化疗和激素治疗。例如，包含本发明新融合蛋白的乳腺癌疫苗可以与能干扰雌激素活性的柠檬酸他莫昔芬联合使用。该系统还可以与免疫治疗联合，例如，使用HerceptinTM(trastuzumab)，即为了阻断HER2受体而开发的一种抗HER2人源化单克隆抗体；骨髓移植；和外周血干细胞治疗也可以使用。可以与本发明组合物联合使用的其他优选的治疗方案，包括血管发生抑制剂和细胞毒性剂。
本文所使用的术语“相容性”表示所述药物组合物的成分能够与本发明的小分子、核酸和/或多肽混合，并且彼此混合，其方式使得不会显著破坏需要的药效。
本发明药物组合物的剂量根据受治对象以及所使用的特定给药途径而变化。剂量可以为0.1-100000μg/kg/天，更优选1-10000μg/ml。所述组合物的优选剂量优选为至少2μg/ml。仅仅是举例来说，对于人类而言可以使用例如大约1mg-大约300mg/的总的剂量范围。该剂量可以根据组合物以定期的间隔递送。例如，至少分2次给药，优选间隔大约4周。其他化合物可以每天给药。本发明的药物组合物还可以按照多种其他业已充分鉴定的方法给予受治对象。例如，某些目前被接受的免疫方案包括以下方案(i)给药时间为，第一个剂量在选定日期给药；第二个剂量在第一个剂量之后1个月给药；第三个剂量在随后的日期，例如，在第二剂量之后5个月给药。参见Product Information，Physician′sDesk Reference，Merck Sharp & Dohme(1990)，1442-43.(例如，乙型肝炎疫苗型方案)；(ii)例如，对于其他疫苗来说，所推荐的儿童给药方法是第一个剂量在选定日期给药(6周大或更大一些)；第二个剂量在第一个剂量之后4-8周给药；第三个剂量在第二个剂量之后4-8周给药；第四个剂量在第三个剂量之后6-12个月给药；第五个剂量在4-6岁大时给药；在最后一个剂量之后，每隔10年进行额外的加强。参见Product Information，Physician′s Desk Reference，Merck Sharp&Dohme(1990)，879(例如，白喉、破伤风和百日咳型疫苗方案)。用于递送特定组合物的多个剂量的理想的时间间隔，可以由本领域普通技术人员通过少量常规实验就可以确定。
本发明的新融合蛋白还可以单独(纯粹)给药，或者以可以药用的盐的形式给药。在用于医药中时，所述盐应当是可以药用的，但是非可以药用的盐可以被方便地用于制备它的可以药用的盐，并且没有被排除在本发明范围之外。所述可以药用的盐包括，但不局限于用以下酸制备的盐盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、唾液酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、和苯磺酸。另外，可以药用的盐可以制备成碱金属或碱土金属盐，如羧酸基团的钠、钾或钙盐。因此，本发明还提供了用于医学使用的药物组合物，它包含本发明的核酸和/或多肽，以及一种或多种它的可以药用的载体，并且任选包含任何其他治疗成分。
所述组合物包括适合口服、直肠、阴道内、局部、鼻内、眼内或肠胃外给药的组合物，上述所有给药途径都可以用作使用本发明物质的给药途径。其他合适的给药途径包括直接鞘内给药至脑脊液(CSF)，直接注射到动脉表面和通过实质内注射，直接注射到器官内靶部位。优选适合肠胃外给药的组合物。术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或输液技术。优选肌内给药。
所述组合物可以方便地以单位剂量形式提供，并且可以通过药物学领域所熟知的任何方法制备。所述方法通常包括将本发明的活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合在一起的步骤。
适合口服的本发明的组合物可以以独立的单位形式提供，如胶囊、扁胶囊、片剂或锭剂，各自在脂质体中含有预定数量的本发明的核酸和/或多肽，或作为悬浮在含水液体或无水液体中的悬浮液，如糖浆、酏剂、或乳液。
适合肠胃外给药的优选组合物通常包含本发明分子的无菌含水制剂，该制剂优选是与受体血液等渗的。所述含水制剂可以按照已知方法，用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂配制。无菌注射制剂还可以是溶解在无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如溶解在1，3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂包括水、Ringer′s溶液、和等渗氯化钠溶液。另外，通常将无菌固定油用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何无刺激性固定油，包括合成的一或二甘油酯。另外，诸如油酸的脂肪酸可用于制备注射剂。
为了进一步改进产生本发明提供的细胞介导的反应的可能性，可以分析由本发明的核酸序列所编码的多肽的氨基酸序列，以便鉴定可能与受体结合相关的氨基酸序列的需要部分。例如，可以对多肽序列进行计算机分析，以便确定所述位点。
通过合适的测定方法，如下文所披露的CMI测定，以及通过其他常规类型的免疫测定方法，可以检测与本发明分子形成的复合物。
本发明提供了体外测定细胞介导的免疫反应的测定方法。用于检测CMI反应的现有的实验室鉴定方法存在严重缺陷，特别是在各种临床场合下应用于大的疫苗效力试验时更是如此。这是因为现有的设备和技术支持是有限的。如上文所述，人们认为CTL在控制HIV-1感染方面发挥关键作用，设计了多种HIV-1疫苗候选物以刺激T细胞反应，以及中和抗体(1-6)。
本发明的用于测定T细胞反应的方法对于开发所有T细胞依赖型疫苗或免疫疗法具有重要作用。该策略可应用于其他研究领域，其中，CMI反应在预防和控制有关疾病方面发挥重要作用。
在一种优选实施方案中，本发明提供了新融合多肽在Elispot测定中的用途。Elispot测定的主要优点是，可以对大量人群的大量CTL反应进行有效和经济的评估(例如，参见Lalvani等.，J.Exp.Med.186859-65(1997))。Elispot测定可以使用任何标准细胞，包括低温保存的PBMCs，以及CD8+CTL细胞。例如，来自HIV-1阳性个体的CD8+CTL克隆。
另一种优选实施方案提供了将所述新型融合多肽用于流式细胞内细胞因子测定的用途。基于流式细胞术的测定，可以在体外刺激抗原特异性T细胞之后检测细胞因子的细胞内积累。用抗原刺激CTLs，并且与布雷菲尔德菌素A一起温育，它能抑制蛋白转运，并且在细胞内积累新合成的蛋白，如细胞因子。表面标记(CD8，CD3)和IFN-γ和CD69的细胞内染色，可以在未表征过的MHC背景中针对抗原性表位对特定细胞群进行检测和定量。
使用本发明新型融合多肽的CMI测定，可用于评估针对多种病毒、细菌和肿瘤抗原的细胞免疫反应。所述测定可用于评估疫苗效力或抑制传染性病原体的感染状态。
使用本发明的新型融合多肽的CMI测定还可用作检测癌抗原的早期诊断试剂盒。
本发明还提供了用于检测CMI反应的试剂盒。一种优选的试剂盒包含装在试管、孔等中的新融合蛋白。所述试剂盒优选包含用于体外检测CMI反应的含有病毒或肿瘤的试剂。所述试剂盒优选包含用于抽取诸如血液的生物学样品的装置。在一种优选实施方案中，所述试剂盒包含指导检测CMI反应的说明书。所述试剂盒优选包含冷冻干燥形式的新融合蛋白。
一种优选的试剂盒包含冷冻干燥的，并且涂敷在用于采集血液的试管内侧上的新融合蛋白。这样，可以将血液直接从个体体内抽入所述试管中，以便温育数小时(例如4小时)，然后固定。这种固定样品可长时间(例如2周)稳定用于CMI测定。所述试剂盒特别适用于野外校正样品，例如，在疫苗效力试验期间使用，这种情况通常出现在偏远地区。类似地，其他优选实施方案包括涂敷在诸如平皿、孔或试管的任何表面上的冷冻干燥的蛋白，可以在它上面添加小体积的生物学样品。优选的生物学样品包括血液、尿液、唾液、粪便、来自脑脊液的上清液和细胞样品。
在一种特定例子中，诸如上文所述的可能仅含有LFn的羧基部分的LFn融合蛋白，可以在缺乏PA的情况下，以MHC-I限制方式敏化CTL靶细胞。在这种向MHC-I途径呈递外源蛋白抗原的新方法中，抗原的胞质溶胶递送取决于与细胞内抗原加工相关的功能性转运，而不依赖于活的病毒或细菌载体。所述LFn片段是能够从胞质溶胶进入MHC-I途径的新类型蛋白的例子。事实上，例如，LFn可以在缺乏PA的条件下将HIV-I抗原递送到细胞质中，这一点与现有的对有关炭疽致死毒素如何起作用的假说相矛盾(32)。在正常情况下，LF(炭疽致死因子)是取决于PA的，以便发挥其毒性作用，并且LF的毒性结构域可能具有防止进入细胞的未知功能。
另外，诸如LFn-HIV的融合蛋白，可以用作调整和简化用于在疫苗试验中检测T细胞反应的方法的工具。该方法还可用于研究其他细胞内病毒或细菌疾病，如病毒性肝炎，TB，和疟疾。本发明可消除在现有CMI测定中使用活的重组痘苗病毒的必要性。与使用重叠的合成肽相比，它还具有若干优点，这种重叠的合成肽不仅昂贵，并且尚未证实对具有HLA-I多样性的不同群体的理论覆盖率。所述新抗原递送提供了简化的CMI测定，该测定方法被普遍应用于野外用途。另外，所述LFn融合蛋白便于在大肠杆菌中生产，可以用相对简单的方法纯化，并且稳定。
本发明所提供的所有新融合多肽，以及编码所述多肽的DNA序列基本上不含炭疽芽孢杆菌保护性抗原或其片段，因此可安全地用于多种用途，而没有对宿主造成意外损伤的危险。因此，本发明的新型融合多肽特别有利于用于产生针对靶抗原的多种细胞介导的反应的组合物和方法。
下面的实施例用于说明本发明，而不是要以任何形式限定本发明。
实施例1材料和方法LFn-HIV融合蛋白通过PCR扩增来自HIV-HXB的编码env gp120，gag p24的DNA片段，克隆到LFn表达质粒pET15bLFn上，并且测序，以便证实LFn和HIV编码序列之间的框内融合。由HIV-ELI扩增Nef编码序列。LFn及其融合衍生物的蛋白表达载体是pET15b质粒(Novagen；Madison，WI)。该载体系统的主要特征包括诱导型T7启动子，用于蛋白纯化的内部His-标记，和多个克隆位点。重组LFn是以细胞内可溶蛋白形式在大肠杆菌中表达的，在其N-末端具有6个串联的组氨酸残基(14)。在10升Bioflow2000台式生物反应器(New Brunswick Scientific，NJ)中生长细菌。使用市售试剂盒，按照生产商(Novagen)的方法纯化带有His-标记的蛋白。通过现有技术修饰LFn编码区可以制备LFn片段。
试剂在Applied Biosystems肽合成仪(Model 430A)上合成合成肽。所使用的重组痘苗病毒是vAbT 141(Gag)，vAbT 299(Env)和Nef(15)，用NYCH作为对照痘苗载体。将布雷菲尔德菌素A，细胞松弛素B和氯喹(Sigma，St Louis，MO)添加到细胞培养物中，培养2小时，并且洗涤2次，然后重新添加到所述细胞中。用于流式分析的抗体是从Becton-Dickinson(San Jose，CA)获得的。
流式细胞内细胞因子染色用LFN-HIV(30μg/ml)、重组痘苗载体(MOI 3-5)或肽(10μg/ml)在37℃下，在5％CO2中温育低温保存的PBMCs过夜。用最佳肽(10μg/ml)、LFn-HIV(10μg/ml)或重组痘苗病毒(MOI 3-5)温育自体B-LCLs过夜，洗涤2次，并且在存在共刺激抗CD28和抗CD49d(1μg/ml，Becton-Dickinson，San Jose，CA)的条件下以10∶1的E∶T比例添加到效应细胞中。然后添加布雷菲尔德菌素A(10μl，1μg/ml)，并且在37℃下温育细胞培养物6小时(对于APC来说使用IgG1，对于FITC来说使用PE，PerCP和IgG2b)或别藻蓝蛋白(APC)标记的CD3单克隆抗体(Mab)，藻红蛋白(PE)标记的抗-CD8 Mab(Becton Dickinson)的饱和溶液染色。在4℃下遮光温育20分钟之后，用FACS洗涤液洗涤2次。添加100μl试剂A(Fix and Perm试剂盒，Caltag Laboratories，Austria)，并且在室温下(RT)遮光温育20分钟之后，用FACS洗涤液洗涤2次。然后添加100μl试剂B(Fix and Perm试剂盒)，并且在室温下温育细胞5分钟。在添加FITC-IFNγ和多甲藻素叶绿素蛋白(PerCP)-偶联的CD69 Mab(CD69 perCP)抗体并且在4℃下遮光温育之后，用FACS洗涤液洗涤所述细胞两次，并且在Becton DickinsonFACScalibur流式细胞计上，用Cell Quest软件分析。
使用FACSCalibur流式细胞仪(Becton Dickinson)和Cellquest软件(Becton Dickinson)通过四色染色分析样品。所使用的阴性对照和阳性对照是未刺激过的细胞和分别用促分裂原植物凝集素PHA(0.25μg/ml，Murex Biotech)刺激过的细胞。
细胞系和培养条件将自体Epstein-Barr病毒(EBV)-转化过的B类淋巴母细胞以及T1和T2(HLA-B60)细胞系用作抗原呈递细胞(APCs)。用合适的指数肽或LFn-HIV构建体脉冲靶细胞，或用重组痘苗病毒感染过夜。AC 13(HLA B14限制的p24[DRFYKTLRA])和KM(HLV B60限制的Nef[KEKGGLEGL])是Gag和Nef-特异性克隆(分别)和AC2(HLA B44限制的gp120[AENLWVTVY])。都是从HIV感染的个体体内获得的，对这种个体的CTL反应业已作过充分鉴定(Rosenberg，个人通信)，并且通过一个血清阳性乌干达人制备了Env特异性克隆(SP 511)(16)。用于Elispot研究的PMBCs是来自塞内加尔和乌干达的HIV-1感染的个体(15，16)。为了研究布雷菲尔德菌素A，细胞松弛素B或氯喹对LFn-HIV MHC-I类限制呈递的影响，用所述蛋白构建体标记APCs，在RPMI 1640m 10％FCS中培养，并且与相应的试剂共培养1小时，然后洗涤，并且通过标准铬释放测定检测。
Elispot对低温保存的PBMCs进行Elispot测定。在4℃下，用0.5mg/ml的单克隆抗体1-D1K(Mabtech，Stockholm，Sweden)对96孔硝酸纤维素平板(Millititer，Millipore Corp.，Bedford，MA)预包被过夜。然后用磷酸缓冲的盐溶液(PBS)洗涤所述平板6次，分别以每孔50,000个细胞，和每孔25,000个细胞的密度添加PBMCs至双份的孔。在37℃下，在5％CO2中温育所述平板过夜，并且以0.5mg/ml的浓度添加生物素化的单克隆抗体抗IFN-Mab(Mabtech)，温育10分钟，然后添加链亲和素-ALP(Mabtech)在室温下温育1小时。用PBS洗涤所述平板3次，并且添加5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基兰(Sigma)，以便使反应显色。15分钟之后，添加自来水以便终止反应。以暗斑形式检测各个细胞因子生长细胞，观察所述细胞，并且以SFC/孔(成斑点集落/孔)形式定量。从所述斑点数量中扣除对照孔的数量，并且将4个孔加以平均计算CTL频率(CTLp)。最终的CTLp是作为每106个细胞的平均频率形式报导的。如果SFCs至少为对照的2倍的话，就将其反应视为是阳性的。本底SFC平均低于15/孔。
铬释放测定在存在重组IL-2的条件下，用抗CD3单克隆抗体(12F6)刺激CD8+CTL克隆，并且在7天内测定活性。用表达HIV-1基因产物的重组痘苗病毒(感染复数为3-5)或用LFn蛋白(5-30μg/ml)感染靶细胞，包括自体B-LCL或HLA-匹配的APCs过夜，并且用放射性铬(51Cr)标记。在200μl的最终体积中，效应细胞靶细胞的比例(E∶T)为10∶1，所有特征都是在双份的孔中进行的。4小时之后收获上清液，并且根据以下公式确定特异性裂解的百分比100×[(实验释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)]。HIV-特异性CTL活性被定义为高出本底/对照10％。对于所有测定来说，自发释放小于最大释放的30％。
在没有PA的条件下由LFn-HIV介导的HIV-1抗原进入和加工为了评估LFn-HIV与细胞表面上的MHC-1分子缔合的能力，在存在或不存在PA的条件下，用LFn-HIV敏化类淋巴母细胞B细胞系(B-LCL)，并且通过标准铬释放测定，用若干业已充分表征的HIV-特异性CTL克隆进行测定(图3)。我们发现在有或没有PA的条件下，用LFn-HIV对CTL识别的靶细胞的敏化程度相当。裂解水平是取决于剂量的，并且获得了与阳性对照相当的水平，其中，B-LCLs是用表达相同HIV抗原的重组痘苗病毒感染的。只有在靶细胞与LFn-HIV一起长时间(8小时与1小时)(数据未发表)温育时，才证实了HIV-特异性CTL活性，表明了表面抗原出现的推迟和需要细胞内加工。
LFn-HIV在经典MHC-I途径中呈递我们随后证实了LFn-HIV是由经典的MHC-I途径提供的，表现为CTLs对所述构建体的识别是HLA-I限制性的(图4)。用呈递LFn-Nef或LFn-p24的HLA匹配的和错配的靶细胞，分别检测HLAB60-和B14-限制型的两种Nef-(KM)和Gag-特异性(AC13)克隆。只有HLA-匹配的靶细胞表现出显著裂解，证实了LFn-HIV的MHC-I呈递。
我们还检查了LFn-HIV的摄取和加工的潜在机制。为了确定LFn-HIV在细胞表面上的内化是否是活跃进行的，我们用100μM的细胞松弛素B(17，18)——一种吞噬作用抑制剂预温育B-LCL，然后添加LFn-HIV抗原。在存在细胞松弛素B的情况下，破坏了CTL识别，这表明它是一种胞吞介导的内化过程。
如果将外源LFn融合蛋白导入胞质溶胶，并且随后进行加工的话，就需要TAP蛋白(与抗原加工相关的转运蛋白)，以便将肽转运到ER腔中与MHC-I结合(19-21)。为了评估在胞吞作用之后对抗原加工的要求，我们检测了LFn-HIV融合蛋白敏化B60-表达细胞系T1和T2以便由CTL裂解的能力。T2细胞(22-24)是缺乏TAP功能的T1细胞的衍生物，它能将肽从蛋白体转运到ER腔中，以便与MHC-I结合(19，20)。在T2细胞中的识别受到破坏(图4B)，表明在加工之后需要表位转运。如果用直接针对表面“空”MHC-I分子的最佳表位肽脉冲所述细胞的话，相同克隆对TAP缺陷型靶细胞的识别得以保持，避免了对细胞内加工的需要。
为了进一步证实外源蛋白进入MHC I类途径的机制，用布雷菲尔德菌素A处理靶细胞，它能抑制来自ER和高尔基复合体的蛋白的胞吐作用，并且抑制新组装的肽-MHC复合体到达细胞表面(25)。在给靶细胞呈递LFn-HIV之前添加布雷菲尔德菌素A，能有效阻断CTLs的识别作用(图5)。这一发现，连同以前对HLA限制和TAP需求的验证，证实了LFn-HIV是由MHC I类途径中的B-LCL加工和呈递的。
LFn-HIV的加工对氯喹是不敏感的很多外源抗原在MHC-I分子上的呈递涉及到在胞吞腔室中的蛋白水解作用(26-28)，并且所述肽随后得以进入胞质溶胶，在这里它进入MHC I类途径。为了研究LFn介导的抗原呈递作用是否需要在酸性小泡中的蛋白水解作用，我们在接触LFn-HIV期间用氯喹处理B-LCL(图5)。已知氯喹能提高内体和溶酶体区室的pH，从而抑制组织蛋白酶的蛋白水解作用，这种酶的活性需要酸性环境(29，30)。我们的发现表明，具有渗漏特征的吞噬体不是LFn-HIV进入胞质溶胶的必要条件。
如果用最佳八聚体表位脉冲靶细胞表面的话，添加细胞松弛素B、布雷菲尔德菌素A或氯喹，不会影响靶细胞的识别和裂解，这表明所述试剂既不会影响CTL功能，又不会影响靶细胞存活力(图5)。
通过不同的CMI测定比较LFn-HIV和重组痘苗病毒在证实了LFn-HIV用MHC-I分子将CTL表位呈递到细胞表面的能力之后，我们进一步试验了LFn融合蛋白在各种CMI测定中的可应用性，包括酶联斑点(Elispot)测定和流式细胞内干扰素测定。这些测定方法提供了对T细胞反应的更简单和更快速的评估，并且，理论上更适合大规模临床测试，特别是用于疫苗研究领域。Elispot测定的主要优点是，可以在大量人群中对HIV-特异性CTL反应进行有效和经济地评估(31)。目前，有多种抗原刺激被用于该测定，包括能表达HIV抗原的重组痘苗病毒或重叠的合成肽。在Elispot测定中，测试了来自若干HIV-1阳性个体的冷冻保存的PBMCs和CD8+CTL克隆，与能表达相同抗原的重组痘苗病毒平行使用LFnp24，LFn-Nef或LFn-gp120。用LFn-HIV观察到了相当的斑点形成集落，并且在某些场合下，与重组痘苗病毒相比出现了更少的本底斑点(图6)。
通过流式细胞测定检测在体外刺激抗原特异性T细胞之后细胞因子的细胞内积累。用抗原刺激CTLs，并且用布雷菲尔德菌素A温育，它能抑制蛋白转运，并且使得诸如IFN-γ的新合成的细胞因子在细胞内积累。表面标记(CD8，CD3)和IFN-γ和CD69的细胞内染色，可以在未鉴定过的HLA-I背景中对针对抗原性表位的特异性T细胞群进行检测和定量。用LFn-Nef刺激Nef-特异性克隆(KM)，并随后通过流式分析评估干扰素的细胞内生产(图7A)。在CD8+细胞群中，用LFn-Nef和表达Nef的重组痘苗病毒检测Nef-特异性反应。用LFn-Env和表达Env的重组痘苗病毒(rVV-Env)敏化来自具有已知gp120表位的个体(AC2)的新分离的、未刺激过的PBMCs。与用rVV-Env温育的细胞相比，在接触LFn-Env的细胞中，在CD8+细胞群中细胞内IFN-γ的百分比更高一些(图7B)。
实施例2在没有PA的条件下，LFn融合蛋白也能以MHC-I限制的方式敏化CTL靶细胞。LFn融合蛋白的这种胞质溶胶递送，取决于与抗原呈递细胞内的细胞内抗原加工相关的功能性转运(Cao H，Agrawal D，Kushner N，Touzjian N，Essex M，and Lu Y.J Infect.Dis.185244-251(2002))。我们业已证实与LFn融合的绿色荧光蛋白(GFP)在没有PA的情况下能进入细胞。我们还证实外源GFP的这种PA非依赖型LFn递送与细胞蛋白体相关，这一结论与以前的观察吻合。
LFn-GFP和GFP构建和纯化通过将来自pEGFP-Cl(Clontech)的GFP开放读框插入在以前的研究中所披露的LFn表达载体中，构建了LFn-GFP融合蛋白(Lu，Y.，R.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 978027-32(2000))，所述融合蛋白可溶于细菌细胞提取物中，并且可以通过一个步骤的亲和层析纯化。纯化融合蛋白的分子量大约为55kD，并且其溶液具有亮绿色(资料未发表)。为了对该实验进行适当控制，将GFP自身构建在相同的细菌表达载体pETl5b中，以便在GFP和LFn-GFP的表达、纯化和使用中的唯一差别是，在GFP中缺少LFn序列。
LFn-GFP能进入CHO细胞，而GFP则不能将CHO细胞在胶原处理过的有隔室的载玻片中培养达到80％的铺满度，然后用纯化的LFn-GFP温育1-2小时，然后用PBS和PBS+蛋白酶进行充分洗涤，以便消除膜结合蛋白。然后用抗运铁蛋白抗体对所述细胞进行染色，并且用低聚甲醛固定。通过共焦显微术分别检查所述载玻片的绿色(GFP)和红色(抗运铁蛋白)。通过叠加相同细胞的绿色图像和红色图像，提供了每一个视野的第三种图像。因此，黄色斑点表示GFP可能存在于与运铁蛋白相同的斑点内，因此提供了GFP在细胞内的定位的参考。如图10所示，在用LFn-GFP处理1小时的细胞中存在大量可见的绿色斑点，这表明LFn-GFP确实进入了细胞。在完全相同的实验条件下，GFP处理过的细胞表现出少量绿色斑点(图11)。
LFn-GFP在处理过的细胞内的定位使用与上述图10-11相同的实验方法，我们分别用抗溶酶体抗体(图12)，抗核内体抗体(图13)，抗高尔基抗体(图14)和抗蛋白体抗体(图15)取代了抗运铁蛋白抗体。通过比较不同的图像，具有最多的黄色斑点的图像是图15所示的图像，其中，绿色斑点表示细胞内LFn-GFP与表示细胞蛋白体的红色斑点显著重叠。
PA的存在不能增强细胞对LFn-GFP的摄取我们进一步检验了在存在PA的条件下是否能增强LFn-GFP的摄取，检验是在图10-15所使用的实验条件下进行的。如图16所示，与缺乏PA的细胞相比，添加PA不能增加细胞内绿色斑点的数量。另外，PA的存在似乎减少了黄色斑点的数量。很显然，在这种条件下，这些黄色斑点仍然可能表示LFn-GFP的进入仍然是PA非依赖型的。
实施例3
缺失LFn的N-末端一半，以及明矾对LFn免疫的佐剂作用其他动物免疫结果表明，包括PA结合结构域的LFn的N-末端一半可以缺失，而不会对抗原递送产生负面影响。非常意外的是，我们发现添加明矾能显著增强LFn融合蛋白的CTL诱导。
尽管在过去两年中进行了很多成功的尝试，我们一直未能证实在存在PA的条件下LFn-p24能在免疫过的BALB/c小鼠体内刺激CTL。以前的研究业已证实，诸如LFn-V3，LFn-LLO，和LFn-OVA的LFn融合蛋白能够在小鼠体内刺激特异性CTL(Lu，Y.，等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 978027-32(2000)；Ballard，J.D.等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，12531-12534(1996)；Ballard，J.D.，等.，Infect.Immun.66，615-619(1998))。所述融合蛋白仅具有12-33个氨基酸，而LFn-p24具有大约230个氨基酸。因此，插入抗原的大小可能产生差异。我们决定检验添加免疫佐剂是否能提高LFn-p24的免疫原性。在测试过的试剂中，包括重组IL-2，Ig-IL2，CpG，明矾及其他，明矾意外地表现出最佳佐剂活性。人们普遍认为某些实验佐剂，如QS21和PCPP能增强细胞介导的免疫反应，而明矾实际上能抑制CTL诱导(Schiembeck，R.，等.，J.Immunol.1521110-1119(1994)；Barouch，D.H.等，Science 290486(2000)；Davis，H.L.等.，J.Immunol.160870-876(1998)；Payne，L.G.等.，Dev.Biol.Stand.9279-87(1998))。
图17中分别用不同的抗原制剂腹膜内注射免疫三组BALB/c小鼠，每组4只(15μg LFn-p24加4μg PA，15μg LFn-p24+4μg PA加明矾，15LFn-p24仅加明矾)。在免疫之后1周，将来自免疫过的BALB/c小鼠的脾单核细胞用作CTL源。通过与来自未免疫过的γ辐射过的和肽脉冲的BALB/c脾细胞一起培养，体外激活脾培养物中的CTL。在37℃下，在CO2孵育箱中培养6天之后，检测成熟的CTL(效应细胞)裂解51Cr-标记过的P20肽脉冲的P815细胞(阳性靶细胞)或51Cr-标记过的介质脉冲的细胞(阴性靶细胞)的能力。所示出的裂解百分比扣除了阴性靶细胞的本底裂解，并且是以每一组的平均值形式提供的。
如图17所示，通过添加明矾，我们能够证明LFn-p24能够在有或没有PA的条件下在免疫过的小鼠体内刺激特异性CTL。以上结果进一步证实了PA的存在并非是体内抗原递送所必需的。
其中的LFn的N-末端一半业已缺失的LFn融合蛋白仍然是有活性的。
为了证实在没有PA的情况下LFn-p24能够诱导CTL，我们构建了一种突变型LFn融合蛋白(MLFn-p24)，其中，去掉了LFn的N-末端一半(1-149)，以便破坏其结合PA的能力。我们通过为了测试PA-依赖型膜转运而专门设计的实验方法证实了这一点。简单地讲，在4℃下，用CHO-K1细胞温育胰蛋白酶切口的PA。然后用冷PBS洗涤所述细胞，并且与35S-标记过的LFn-NG或LFn-ENV一起，在4℃下温育2小时。充分洗涤所述细胞，并且在37℃下接触MES/葡糖醛酸缓冲液(pH 4.8)2分钟。然后添加链霉蛋白酶E或缓冲液，消化尚未内化的表面结合的LFn融合蛋白。然后再次洗涤所述细胞，裂解，并且计数。按照以下公式计算通过PA转运的蛋白的百分比。比例＝100×(在有PA和链霉蛋白酶处理过的细胞的情况下的计数-在没有PA和链霉蛋白酶处理过的细胞的情况下的计数)/(在有PA和模拟处理过的细胞的条件下的计数-在没有PA和模拟处理过的细胞的条件下的计数)。在这种特殊测定方法中，PA将高达7 2％的膜结合LFn转运到细胞内，而由PA转运的MLFn的量是无法检测的。
然后，我们在免疫过的小鼠体内比较了LFn-p24和MLFn-p24对CTL的诱导。在图18中，通过腹膜内注射，分别用15μg LFn-p24，15μgMLFn-p24和15μg p24对三组BALB/c小鼠，每组四只进行免疫。免疫1周之后检测脾组织中的CTL。
如图18所示，在进行一次免疫接种之后，LFn-p24和MLFn-p24都能刺激显著的CTL活性。事实上，与LFn-p24诱导的反应相比，我们重复观察到了由MLFn-p24引起的改进的CTL诱导。本实验还证实了LFn的C-末端一半(150-253)确实负责所述细胞内抗原递送，因为从所述抗原(p24)中缺失MLFn序列，能破坏有效的CTL诱导。
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本文所披露的所有文献都被收作本文参考。
权利要求
1.一种将靶抗原递送到细胞的胞质溶胶中的方法，包括将所述靶抗原结合于一种转运因子，其中，所述转运因子包含对所述细胞没有毒性的二分蛋白外毒素的片段，并且，其中不使用保护性抗原(PA)。
2.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子包含SEQ ID NO2(LFn)或其部分。
3.如权利要求2的方法，其中，所述转运因子是不包含SEQ ID NO2的结合PA的部分的片段。
4.如权利要求3的方法，其中，所述转运因子是LFn的最靠近羧基末端的80个氨基酸。
5.如权利要求3的方法，其中，所述转运因子不包含SEQ ID NO2的1-149号氨基酸。
6.如权利要求3的方法，其中，所述转运因子是由SEQ ID NO3编码的。
7.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子是具有至少80个氨基酸的片段，它与SEQ ID NO2具有至少80％的同源性。
8.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子是具有350个或更少氨基酸的片段。
9.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子具有300个或更少氨基酸。
10.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子具有250个或更少氨基酸。
11.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子具有105个或更少氨基酸。
12.如权利要求11的方法，其中，所述转运因子具有SEQ ID NO2的150-253号氨基酸或更少。
13.如权利要求1的方法，其中，所述靶抗原选自下列一组病毒抗原、细菌抗原和肿瘤抗原。
14.如权利要求13的方法，其中，所述病毒抗原是HIV抗原。
15.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子通过表达一种融合多肽与所述靶抗原结合，其中，由单个核酸编码序列编码所述转运因子和靶抗原。
16.如权利要求1的方法，其中，所述转运因子通过化学键与所述靶抗原结合。
17.一种包含靶抗原和转运因子的分离的多肽，其中，所述转运因子包含二分蛋白外毒素的一个片段，该片段对所述细胞没有毒性，并且起着将靶抗原递送到细胞的胞质溶胶中的作用。
18.如权利要求17的分离的多肽，其中，所述转运因子不包含与相应保护性抗原(PA)结合的结构域。
19.一种分离的DNA，它编码权利要求18的多肽。
20.如权利要求16的分离的DNA，还包含含有至少一个用于表达肽的启动子序列的5’侧翼区。
21.一种载体，含有权利要求20的分离的DNA。
22.一种药物组合物，包含免疫原性量的分离的包含靶抗原和转运因子的多肽，其中，所述转运因子包含二分蛋白外毒素的一个片段，该片段对所述细胞没有毒性，并且起着将靶抗原递送到细胞的胞质溶胶中的作用，并且其中不存在相应的保护性抗原。
23.如权利要求22的药物组合物，还包含一种佐剂。
24.如权利要求23的药物组合物，其中，所述佐剂是明矾。
25.一种在哺乳动物体内产生细胞介导的免疫反应的方法，包括给予所述哺乳动物权利要求22的药物组合物。
26.如权利要求25的方法，其中，所述药物组合物是通过皮下或肌内给药方法给药的。
27.如权利要求25的方法，其中，所述药物组合物是通过口服摄取给药的。
28.一种生产蛋白的方法，包括在一种细胞中表达权利要求18的分离的核酸。
29.如权利要求28的方法，其中，所述细胞选自下列一组细菌细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞。
30.如权利要求29的方法，其中，所述细胞是细菌细胞。
31.一种测定细胞介导的免疫反应的方法，包括将权利要求17的多肽用于细胞介导的免疫反应测定。
32.如权利要求31的方法，其中，所述细胞介导的免疫反应测定选自下列一组Elispot测定和流式细胞内细胞因子测定。
33.一种用于体外检测细胞介导的免疫反应的试剂盒，包含权利要求17的新多肽。
全文摘要
本发明涉及一种用于将外源蛋白递送到胞质溶胶中的方法，包括将靶抗原(如一种蛋白)结合于包含二分蛋白外毒素的片段的转运因子，但不是相应的保护性抗原。优选将所述靶蛋白融合于所述转运因子。优选的转运因子包括来自炭疽芽孢杆菌的致死因子(LFn)的保护性抗原结合结构域，它包括1－255号氨基酸，优选与LFn具有至少80％同源性的至少80个氨基酸的片段，以及来自羧基部分的不结合PA的大约105个氨基酸的片段。所述靶抗原可以包括希望诱导CMI反应的任何分子，包括病毒抗原和肿瘤抗原。
文档编号C12N15/74GK1636060SQ02810886
公开日2005年7月6日 申请日期2002年3月28日 优先权日2001年3月28日
发明者Y·卢, H·曹 申请人:哈佛大学校长及研究员协会, 综合医院公司