专利名称：将外源物质大量导入活细胞的方法
技术领域：
本发明的领域是生物技术。
基因工程是七十年代发展起来的一项生物高技术。这项技术为改造生物性状和快速育种提供了有力的工具。它包括相对独立的两大部分。其一，用分子克隆手段分离出目的基因(如抗病抗虫基因，耐盐碱基因，抗旱抗逆基因等等)。其二，将目的基因导入生物细胞，使目的基因在细胞或个体水平上表达。目前，克隆目的基因已有一些较为有效的方法，而将外源目的基因有效地导入细胞，尤其是导入农作物细胞和动物受精卵则是基因工程的一大难题。
目前，往植物细胞导入外源基因还没有一种行之有效的方法。如土壤农杆菌-Ti质粒载体系统，是研究的最深入的植物转化系统，但它仅适于转化双子叶植物，对单子叶植物不能普遍适用。病毒载体法是以植物病毒做为载体，将外源DNA导入植物细胞，它严格受制于植物病毒的寄主范围。显微注射法则利用显微注射器直接将外源DNA注入细胞内，但其操作非常烦琐，技术条件要求高，难以推广。PEG法、电击法以及脂质体介导法虽使植物转化成功的机会增多，但这些方法都以植物原生质体为受体，工作量大，成功率低。因为植物原生质体再生是一项极为困难的工作，并且许多植物原生质体至今难以再生成植株。基因枪法虽然以不去壁的植物材料为受体，但它导入受体的DNA量少，实际转化效率不高。国外已有人用激光微束穿刺植物细胞，试图通过激光孔转化植物细胞，但他们只能造成细胞壁穿孔，而不能保证外源物质大量进入细胞内，因此收效甚微。
在动物受精卵的转化中，最常用的是显微注射法，也有人用PEG法、电击法等，总的来说效率都不高。
我们认为创造一种高效的细胞转化方法对于加速基因工程研究进程具有重要意义。新的转化方法必须满足两点要求①对生物细胞造成的损伤小，不影响细胞的生理活性。②能够使外源物质大量进入细胞内，以保证有足够的DNA分子进入细胞核，使目的基因整合到染色体上。
本发明的原理是用高渗缓冲液浸泡细胞一定时间，使细胞内部部分水分外流，然后将细胞转入含有DNA的普通培养液中，以形成细胞渗透压内高外低的梯度。此刻，在用物理方法造成细胞膜穿孔，在细胞渗透压的作用下，细胞周围的物质就通过这些微孔迅速进入细胞内，在很短的时间内，细胞穿孔自然闭合。这样，细胞外环境中的DNA就大量地进入了被穿孔的细胞。
受体细胞的预处理是本发明成功的关键。各种植物的渗透压一般在0.25-0.65mol/L之间。因此，要人工建立起细胞渗透压内高外低的梯度，就必须将细胞浸入比细胞渗透压高的缓冲液中，这样才能使细胞内水分外流。据此我们设计高渗缓冲液浓度在0.5-1.0mol/L之间。根据不同植物材料，配制相应的高渗液，以高渗液浓度与细胞渗透压之差超过0.05mol/L为准。
配制高渗缓冲液一般采用对细胞无毒的糖醇类分子，如葡萄糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖等，其通式为C6H12-14O6或C12H22O11缓冲液采用Tris-盐酸缓冲液，磷酸缓冲液等，pH5.6-7.5。
植物材料在高渗缓冲液中浸泡的时间，以出现明显的质壁分离为准，一般应超过20分钟，最佳浸泡时间范围为1-5小时。
将高渗缓冲液浸泡过的细胞转入含有外源DNA的普通培养液中，就建立起了细胞渗透压内高外低的梯度，这时应尽快用物理方法造成细胞壁穿孔，使细胞周围溶液迅速进入细胞内。造成细胞壁穿孔的方法有激光微束照射、用基因枪加速的金属微粒、超声波、高压电击等。
以水稻悬浮细胞的转化为例，具体操作方法如下水稻悬浮细胞在继代3-4天后，转入高渗缓冲液(10mMTris·Cl，pH7.2，0.7M山梨醇)中浸泡3-4小时。在超净台上，将高渗液处理过的细胞用80目筛网过滤，取0.1ml过滤后的小细胞团转入1.5mlEppendorf管中，用普通培养液洗一次，立即加入5μgPBI121质粒DNA，混匀后将细胞装进Rose小室进行激光显微照射。照射装置为Nd-YAG四倍频脉冲显微仪。输出波长为1060nm、532nm、355nm和266nm，脉宽为10ns。激光器在532nm波长时，输出能量为10mJ。激光束经匹配引入一台相差显微镜，用40X物镜聚焦于待照射的细胞，光斑直径为1.3μm。照射时，通过前后左右移动载物台使激光脉冲在植物细胞团上进行扫描照射，激光照射时间为每样品60分钟，约打4000个脉冲。照射后的细胞按常规方法进行培养、筛选、检测及再生。
本发明具有的优点和应用范围渗透压梯度加膜穿孔转化方法是一套简便，高效的转化方法。因为它能保证外源物质大量进入细胞，同时使受体细胞所遭受的损伤减至最小，转化后的细胞能保存其正常的生理状态。
本方法以细胞渗透理论作为基础，因此具有维持细胞渗透压功能的植物细胞和组织、动物细胞与受精卵，甚至微生物细胞均可用本方法进行外源基因导入。从理论上讲，本方法可将任何经分子克隆手段得到的基因导入任何活的生物细胞。因此本方法可适用于许多方面①将农艺性状优良的基因导入作物细胞，培育出新的作物新品种。②将产生某种生物药品的基因导入动物或植物细胞，然后通过组织培养法生产药品。③将优良性状基因导入动物受精卵，培育出动物新品种。④在基因治疗时，可先用本方法将目的基因导入人类细胞，筛选出整合细胞后再将后者植入患者体内，就可达到治疗目的。
权利要求
1.一种将外源物质导入活细胞的方法，其特征是将细胞在高渗缓冲液中浸泡20分钟以上，最佳时间为1--5小时，然后将该细胞转入含有外源物质的普通培养液，尽快使用物理方法使细胞壁穿孔，外源物质就大量进入细胞内。
2.根据权利要求1所述方法，其特征是配制高渗缓冲液使用对细胞无毒的糖醇类分子，通式为C8H12-14O6或C12H22O11，采用Tris-盐酸缓冲液或磷酸缓冲液，pH5.6-7.5。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是糖醇类分子，最好使用葡萄糖、肌醇、甘露醇、山梨醇、蔗糖等。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是预导入活细胞的外源物质主要指通过分子克隆手段分离得到的各种基因。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所说物理方法是激光微束照射，用基因枪加速的金属微粒，超声波，高压电击法。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征是激光微束照射输出波长为1060nm、532nm、355nm和266nm，脉宽10ns，激光在532nm时输出能量为10mJ。
全文摘要
本发明属于生物技术领域。用高渗缓冲液浸泡细胞，使细胞内部部分水分外流，然后将细胞转入含有外源物质的普通培养液中，以形成细胞渗透压内高外低的梯度，用物理方法造成细胞膜穿孔，外源物质就大量进入细胞。用本方法可以改良动植物的遗传特性，生产生物药品以及对疾病进行治疗。
文档编号C12N15/63GK1078261SQ92103259
公开日1993年11月10日 申请日期1992年5月7日 优先权日1992年5月7日
发明者郭延德, 王兰岚, 宋桂英, 徐正平, 张健, 田文忠 申请人:中国科学院遗传研究所