专利名称：一种基于活细胞矩阵技术的物质毒性的确定方法
技术领域：
本发明涉及一种应用于快速确定物质毒性和其致毒机理的新方法，更具体的说是一种用于纯化合物或复杂环境介质样品的毒性预测致毒机理的高通量筛选方法。
背景技术：
关于从分子水平研究化合物致毒机理的研究，目前已经被大量实验验证的致毒机理有一氧化碳与血红蛋白的紧密结合，使其失去输氧能力而致毒；汞等重金属毒物会与酶活性中心的巯基结合，抑制酶的活性而致毒。还有实验验证，一些环境有毒污染物的致癌、致畸和致突变作用与它们能改变或损伤机体的DNA的结构和相应功能有密切关系。例如亚硝胺改变DNA的结构和转录功能，会造成染色体的突变而致癌；多环芳烃、芳香胺和芳香族偶氮化合物由于会引起DNA损伤，使细胞生长繁殖失控，从而形成肿瘤。然而，从宏观上全方位的评价一个化合物或环境毒物的致毒机理，仅仅掌握这些信息是远远不够的。·大肠埃希氏菌，又称大肠杆菌，作为一种通常用来揭示某种具有某种普遍规律的生命现象的模式生物，有研究者绘制其体内的染色体蓝图，并对其体内大部分基因的功能进行了推断和实验验证，这就为基于毒理生物个体从宏观上对环境毒物的致毒机理进行判断提供了一种可能。随后，在Nature Method有文章刊出，Alon Zaslaver等人进一步对大肠杆菌体内2000多个不同的、涵盖大部分基因的启动子进行标记，每一个启动子均由低拷贝质粒表达而来，这就使得大肠杆菌体内闻精度基因表达数据的获得提供一个便利的手段。目前，采用该技术相关研究报道，大多数仅限于某种或者某一类具有特定功能的基因。通过检索发现国内外文献没有关于采用全基因组对环境毒物进行毒性的确定和致毒机理评价的报道。
发明内容
I.发明目的针对现有的对环境毒物进行毒性的确定方法的完整性和准确度的缺乏，本发明提供一种基于大肠杆菌全基因组活细胞芯片技术的评价方法，通过本发明可以对环境毒物的细胞毒性和致毒机理进行高通量测试全基因组测试。2.技术方案
本发明的技术方案如下
一种基于高通量筛选技术和大肠杆菌全基因组的环境毒物致毒机理评价方法，其包括以下步骤
(1)首先，测试环境毒物对大肠杆菌的生长抑制作用，在96孔板内接种相同密度的大肠杆菌，当细菌吸光度0D600值达到O. I时，根据细菌对环境毒物的耐受性，加入具有一定剂量的环境毒物，并绘制S型曲线，求算环境毒物对细菌生长抑制的EC20 ；
(2)取出冻存于-80摄氏度的存有大肠杆菌的96孔板母板(共21块，大肠杆菌基因库购自Thermo Scientific公司),在室温下放置至其融化,迅速用复制触角将其转移复制入一块装有新鲜培养基的96孔板新板，培养细菌约3个小时，将其分装入384孔板，此时，板孔内吸光度0D600应该在O. I左右；
(3)选择O、O.01*EC20、0. 1*EC20和EC20作为4个测试浓度，在384孔板内快速加入受
试环境毒物；
(4)将加过受试化合物的384孔板放入酶标仪，记录其荧光读数在4个小时内的变化情况。本发明步骤(I)中的96孔板，由Corning (NY, USA)公司提供，货号CLS3599。步骤(2)中的384孔板由NUNC (NY, USA)公司提供，货号142761。步骤(3)中酶标仪由BioTek (Winooski, VT)公司提供。
有益效果
本发明基于高通量筛选技术，采用荧光标记的大肠杆菌作为模式生物，提供了一种涵盖大肠杆菌体内大部分基因的环境毒物致毒机理评价方法。它一方面具有基因芯片技术的研究效果，为研究者提供高品质的基因表达数据；同时该技术更快捷、简便，无需复杂的前处理过程；并且，该技术具有很高的可重复性；成本低，可以最大程度的避免人为操作误差或干扰。同时，该技术在污染毒物筛选中，不仅可以考虑到化合物的可利用性，同时可以兼顾多化合物的复合毒性，以便可以对生物样品的潜在毒性有一个更加全面的分析；它采用更敏感的基因表达变化作为指标，它结束了许久以来仅仅依靠细菌生长抑制、生存这些简单生理指标来判断化合物毒性的现状；它所标记的每一个菌种所标记的基因均代表一种致毒通道，这对于判断化合物的致毒机理提供了大量的信息。尽管该技术可以给实验者提供大量的基因变化信息从而判断化合物的生物毒性和致毒机理，然而，它并不需要高超的操作技能，只需要一般生物实验室所具有的操作平台。因此，具有广阔的应用前景。
具体实施例方式以下通过实例进一步说明本发明 实施例I:
采用整体稀释的方法，在96孔板内种入具有相同细菌密度的培养基，放入37摄氏度培养箱内培养约3小时，此时细菌的吸光度0D600值大约为O. I。配制浓度为2000 mg/mL的6-H0-BDE-47母液，并逐级稀释，将其加入培养好的96孔板内，保证板内6-H0-BDE-47的浓度梯度为 210、100、25、6· 4,1. 6,0. 39,0. 098,0. 024 和 O. 006 mg/mL(n=3)。在 37 摄氏度下继续培养4个小时，再次测定其吸光度值，观察不同浓度下细胞受抑制的情况，最终确定其半效应浓度 EC50 为 22. 52 ±2. 20 mg/L。实施例2
采用整体稀释的方法，在96孔板内种入具有相同细菌密度的培养基，放入37摄氏度培养箱内培养约3小时，此时细菌的吸光度0D600值大约为O. I。配制浓度为2000 mg/mL的6-H0-BDE-47母液，并逐级稀释，将其加入培养好的96孔板内，保证板内6-H0-BDE-47的浓度梯度为 210、100、25、6· 4,1. 6,0. 39,0. 098,0. 024 和 O. 006 mg/mL(n=3)。在 37 摄氏度下继续培养3个小时后，每一孔内加入10微升对细菌无毒性的阿尔马兰(Beijing CellChipBiotechnology Inc.，Beijing, BJ)，继续培养I个小时，测定其荧光值(发射光/吸收光545nm/590nm)，最终确定其半效应浓度EC50为12. 13土 L 12 mg/L。实施例3:
细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件，不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理，同时它也反应了三种结构不同的化合物对生物体的作用模式差异。将大肠杆菌暴露于三种化合物4小时后，观察其对细菌生长抑制情况，结果显示，在测试浓度下，BDE-47和6-Me0-BDE-47对大肠杆菌并无明显的抑制作用，然而6-H0-BDE-47却可以强烈抑制大肠杆菌的生长。这也从一定程度上证实了三种化合物由于结构官能团的不同，对大肠杆菌产生的毒性差异。同时，为了选取一个更为敏感的细胞活力判定指标，我们还尝试同时采用测定吸光度和阿尔马兰检测来判定大肠杆菌活力，两种情况下，算的其EC50值分别为22.52 土 2. 20和12. 13 土 1.12 mg/L，说明在吸光度表现出下降趋势前，细胞的生长已经开始受到抑制，同时也说明了阿尔马兰是一种更为敏感的大肠杆菌活力判定指标。实施例4:
从-80摄氏度冰箱中取出荧光标记的大肠杆菌母板，在室温下放置约半个小时待溶解，然后将其中的菌株一一对应地转新鲜的装有300微升LBX I培养基的96孔板中，在37摄氏度下培养约3个小时，此时细菌的吸光度0D600值约为O. 1，将其转入384孔板中，这里，96孔板每个孔对应384孔板上的4个孔，384孔板每个孔的菌液浓度为72微升。将用DMSO配制好的6-H0-BDE-47，按1/20的比例加入384孔板内，共4个浓度梯度，最终暴露浓度分别为9、0. 9、0. 09和O mg/L，加液体积为3. 75微升。加入化合物后，将384孔板放入酶标仪，测定大肠杆菌受6-H0-BDE-47暴露后的基因表达变化。共计21块大肠杆菌母板。实施例5:
暴露于6-H0-BDE-47后，大肠杆菌的基因表达同时表现出了时间依存性(time-dependent)和浓度依存性(concentration-dependent)。6-H0-BDE-47 所引起的基因下调数量要明显多于上调基因的数量，采用2. O作为基因异常倍数表达阈值，一共有65个基因被判定为异常表达，其中11个基因被上调，54个基因被下调；采用I. 5作为基因异常表达倍数判定阈值，一共129个基因被判定为异常表达，其中有97个基因呈现为下调趋势，32个基因表现为上调趋势。采用2. O作为基因异常表达倍数判定阈值，暴露于O. 09,0. 9和9mg/L的6-H0-BDE-47后，分别有11、17和60基因出现了异常表达的情况。若采用2. O作为基因异常表达判定阈值，暴露于三个浓度后，分别有40、55和116基因有异常表达的情况，其中有24个基因对三个浓度均有异常表达的现象。同时，有三个基因(yccF ygbA yddM)在6-H0-BDE-47浓度为O. 09mg/L时有异常表达，然后当其暴露浓度提升至O. 9和9mg/L时，并未出现异常表达，这也显现了其浓度依存性。基于这些异常表达的基因，6-H0-BDE-47的NOTEC和TEC50值分别被计算为O. 0438和O. 580mg/L，这两个基于基因水平的判定终点指标要比传统的EC50分别敏感了 274和21倍。实施例6:
基于这些异常表达的基因，6-H0-BDE-47的NOTEC和TEC50值分别被计算为O. 0438和
O.580mg/L，这两个基于基因水平的判定终点指标要比传统的EC50分别敏感了 274和21倍。同时，这里也验证了，NOTEC作为一个新出现的化合物毒性评价终点判定指标，它反映了生物的亚致死和分子水平的一些特征，相比传中的毒性判定终点指标，它更敏感。实施例7:基于 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)数据库，metabolicpathway>phosphoenolpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase system (PTS)和aminoacyl-tRNAs被判定为最可能被6-H0=BDE_47干扰的通路。采用2. O作为基因异常表达倍数阈值，所筛选出来的基因中有十个属于metabolie pathway通路,其中fdhF和katG呈现上调趋势，ofct/ dgkA IacZ IpxC manX moaA pepD则表现出了下调的趋势。通常来说,代谢反应是指生物体内的物质利用一系列的酶最终转化为另一类物质的过程。6-H0-BDE-47表现出了对代谢通路的破坏性，这与文献报道中6-H0-BDE-47难以代谢转化的事实相符。phosphoeno lpyruvate (PEP)-dependent phosphotransferase system (PTS)的通路则与微生物摄取碳源的过程息息相关，尤其是己糖、己糖醇和二糖。暴露于6-H0-BDE-47后，一些与PTS相关的基因(jmnX, srlA，treB)出现了下调的情况。氨基酰基-tRNAs则是可能被6-H0-BDE-47调控的另一条通路，它在氨基酸的转录和翻译中起着至关重要的作用，其中有三个基因在暴露于6-H0-BDE-47后的下调倍数超过了 2，包括ileX, 和serlh这些基因的下调，将造成氨基酸向核糖体转运过程的阻断。环境胁迫基因，是一类当细胞受到外来压力就开始异常表达的广谱性基因，当阈值设定为2. O时，4个胁迫基因被判定为异常表达，分别为 bolA、katG、ybgl 和 yhjX,他们分别与 general stress, redox stress,general function 和 drug resistance/sensitivity 有关。·
权利要求
1.一种基于活细胞矩阵技术的物质毒性的确定方法，包括以下步骤 (1)首先，测试环境毒物对大肠杆菌的生长抑制作用，在培养管或微孔板内接种相同密度的大肠杆菌，当细菌进入对数生长期时，根据细菌对环境毒物的耐受性，加入稀释浓度的化合物、混合物、环境样品的提取物或馏分并绘制S型曲线，求算环境毒物对细菌生长抑制的 EC20 ； (2)取出冻存于-80摄氏度的存有大肠杆菌的培养管或微孔板，在室温下放置至其融化，迅速用复制触角将其转移复制入一块装有新鲜培养基的培养管或微孔板，培养细菌3个小时，此时，细菌进入对数生长期，将其分装入多孔微孔板； (3)选择一个或多个测试浓度，在培养管或微孔板内快速加入受试环境毒物； (4)将加过受试化合物的培养管或微孔板放入酶标仪，记录报告基因信号在此后随时间变化的情况。
2.根据权利要求I所述的一种基于活细胞矩阵技术的物质毒性的确定方法，其特征在于细菌进入对数生长期为当细菌吸光度OD600值达到O. I时。
3.根据权利要求I所述的一种基于活细胞矩阵技术的物质毒性的确定方法，其特征在于步骤(3)中0,0. 01*EC20、0. 1*EC20和EC20作为4个测试浓度。
全文摘要
一种基于活细胞矩阵技术的物质毒性的确定方法，属于物质毒性的确定方法。其步骤为首先，测试环境毒物对大肠杆菌的生长抑制作用，求算环境毒物对细菌生长抑制的EC20；取出冻存有大肠杆菌的培养管或微孔板，融化，迅速转移复制入一块装有新鲜培养基的培养管或微孔板，培养细菌3个小时，将其分装入多孔微孔板；选择一个或多个测试浓度，在培养管或微孔板内快速加入受试环境毒物；将加过受试化合物的培养管或微孔板放入酶标仪，记录报告基因信号在此后随时间变化的情况。本发明可以提供高品质的基因表达数据；同时更快捷、简便，无需复杂的前处理过程；并且，具有很高的可重复性；成本低，可以最大程度的避免人为操作误差或干扰。
文档编号G01N21/64GK102925532SQ201210372540
公开日2013年2月13日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者张效伟, 苏冠勇, 夏洁, 于红霞 申请人:南京大学