专利名称：：一种抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗体，其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种IgY抗体，具体说涉及一种抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体，还涉及该抗体的制备方法及用途。
背景技术：
：肉毒毒素(botulinumneurotoxin,BoNT)是世界上已知毒性最强的物质，由肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridiumbotulinum)在厌氧条件下产生，共有7种血清型(A-G)，其中引起人类致病的主要是A、B、E型。而A型肉毒毒素比其它型又能引起更为严重的中毒症状，导致更高的死亡率，人体的半数致死剂量LD50仅为0.1-lng/kg。中毒通常表现为眼部及喉部肌群的麻痹，然后发展为全身骨骼肌麻痹，最终由于呼吸衰竭而死。近几年，肉毒中毒事件时有发生，虽然肉毒中毒主要以食物污染、伤口感染、婴儿肠道中毒等方式出现，但由于肉毒毒素的毒性强烈，易于制备获得，使得其成为潜在的生物恐怖剂之一。肉毒毒素由肉毒梭状芽孢杆菌产生，最初是以无毒的单链多肽形式存在，约150kDa，之后经菌体蛋白酶或体外蛋白酶作用，将毒素前体消化成为由一个二硫键相连的双链形式多肽存在才具有毒性，包括通过羧基端与靶细胞受体结合并通过氨基端介导细胞内吞将毒素转运至细胞内部的重链部分(Heavychain,Hc)，约1OOkDa，以及具有锌依赖内肽酶活性的轻链部分(Lightchain,Lc)，约50kDa，可以特异切割靶细胞内肉毒毒素的底物，而发挥神经毒力。其中，重链是毒素的非毒性部分，而轻链则是毒素的毒性部分。肉毒毒素的底物根据其血清型不同而不同，并且针对同一种底物的几种不同血清型毒素各自的作用位点也不同。A、E、Cl型肉毒毒素作用的底物为突触小体相关蛋白(Synaptosomalassociatedproteinofmolecularmass25kDa,SNAP-25)，作用位点分别为A型:Q197-R198;E型:R180-I181;Cl型:R198-A199;B、D、F、G型肉毒毒素作用的底物为囊泡相关膜蛋白(Vesicleassociatedmembraneprotein，VAMPorSynaptobrevin)，作用位点分别为B型Q76-F77;D型K59-L60;F型Q58-K59;G型A81-A82;Cl型肉毒毒素还可以切割可溶N2乙基马来酰亚胺敏感因子胞膜整合蛋白(Syntaxin)，位点为K253-A254。这些底物共同被称为SNARE蛋白，在介导小泡定向和融合方面起重根据现有文献报道，肉毒毒素的致病分子机制主耍包括以下几步(1)肉毒毒素通过重链羧基端特异识别并结合靶细胞表面的特异受体；(2)受体介导发生能量依赖性细胞内吞作用(exdocytodsis)，通过重链氨基端将肉毒毒素轻链内化进入胞浆；(3)肉毒毒素轻链部分发挥其锌依赖的内肽酶活性，选择性切割在祌经递质释放过程中起重要作用的SNARE蛋白，从而封闭乙酰胆碱的释放，进而造成肉毒中毒。目前对于肉毒中毒主要使用肉毒多价抗毒素——马血清进行临床治疗，但只有在中毒前及中毒后24小吋使用才能保证效果。因此，对于肉毒中毒的防治来说，及时、准确地采取措施才能最大限度地发挥效果。而实现对于微量肉毒毒素的快速、准确的检测分析，无疑是及时准确采取防治措施、减少要作用其危害的前提和最重要的手段之一。迄今为止，对于肉毒毒素的检测分析法中，唯一公认的金标准是小鼠分析法(mousebioassay)，这种分析方法主耍通过向小鼠腹腔注射待测样品，进而观察小鼠是否出现中毒症状，如出现蜂腰，皮毛倒立，呼吸微弱，四肢麻痹，甚至死亡等症状，从而分析待测样品中毒素量的多少并用特异抗体确定型别如何，可以实现对皮克级(pg)毒素的分析。虽然传统金标准对绝大部分样品分析的结果都是真实可靠的，但也存在许多缺点，主要表现在成本高(对动物饲养条件要求高，对操作人员专业技能要求高)；耗时长(需要4天);样品需要量大，不易推广等。因此传统金标准无法满足突发公共卫生事件中样本应急分析的耍求，亟需简便、快速、灵敏的新技术方法实现对传统金标准的有效替代。近几年，国内外许多学者在肉毒毒素的分析方法方面开展了相关研究，也己经有一些新型的分析方法问世，除了上面提到过的传统金标准外，主要包括(1)内肽酶活性分析法(endopeptidaseactivityassay),可以使用人工合成的含有酶切位点的肽段作为底物，利用检测标记的荧光信号等方法对待测样品中毒素进行分析；(2)质谱分析法，对毒素酶解底物产物直接进行检测，可以达到小鼠分析法的灵敏度甚至更高，但依赖特殊设备，且其结果容易被待测样品中其他物质所干扰；(3)细胞分析法，可以体外模拟肉毒中毒的过程，解决了小鼠分析法使用大量动物的问题，但操作较复杂，耗时长。根据文献报道，在正确折叠的SNAP-25蛋白上，A型肉毒毒素特异切割位点之前的数个氨基酸残基包埋于(x螺旋之中，经过毒素切割后便会失去空间构象(见图8)。依据底物的这一构象变化，可以针对底物酶解产物的线性肽设计特异抗体，应用其对内肽酶切割前后底物识别的差异，进行肉毒毒素的到目前为止，尚未见到利用SNAP-25蛋白制备鸡卵黄免疫球蛋白(IgY抗体)进行肉毒毒素的检测分析的报道。
发明内容针对快速、灵敏、便捷的肉毒毒素检测和毒力甄别方法的需求，本发明提供了一种IgY抗体，该抗体特异抗肉毒毒素底物肽SubA，并能高效检测A型肉毒毒素及其毒力。该抗体所针对的底物肽SubA的氨基酸序列为NKTRIDEANQ，如序列表中序列1所示。本发明还公开了上述抗肉毒毒素的IgY抗体的衍生物，是IgY抗体的蛋白酶消化产物，它保留了IgY抗体的抗原结合活性。本发明的抗肉毒毒素的IgY抗体分子量为180,000，制备纯度大于85%，具有较好的稳定性且易于保存、运输。本发明还公开了上述抗肉毒毒素的IgY抗体的制备方法。首先选择A型肉毒毒素切割SNAP25位点前10个氨基酸残基，即189N-198Q(命名SubA)，通过化学合成的方法进行合成，并在肽N'端进行KLP修饰。合成制备KLP-SubA做为免疫抗原，选用产蛋鸡，通过动物定向免疫方法，在动物体内诱导产生特异抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗体。收集产蛋，采用水稀释法、盐析或PEG法等提取卵黄免疫球蛋白，可以进一步采用DEAE色谱、凝胶过滤或亲和层析分离纯化方法等进行纯化。本发明的IgY抗体可以通过本领域己知的生物化学的方法进行大量制备。在IgY抗体全分子基础上，可以应用蛋白酶消化方法制备F(ab)'等衍生物，以优化改善其理化性质、提高或增加其应用性和应用范围。通过试验测定本发明IgY抗体可特异识别底物肽SubA，并具有良好结合活性，而与完整底物SNAP25不结合，显示其结合特异性，这种结合特异性可能是非构象依赖的，与抗体识别位点在线性底物肽SubA暴露而在完整底物SNAP25中不暴露或包埋有关。本发明同时公开了特异抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗体在A型肉毒毒素检测分析中的应用以及相关试剂的制备。具体包括(1)重组SNAP25蛋白的制备。基因工程技术和分子生物学方法，设计一对引物，通过RT-PCR从小鼠全脑组织总RNA中克隆得到SNAP25编码基因，并通过基因亚克隆手段构建重组表达SNAP25的原核基因工程菌一重组大肠杆菌，然后诱导表达并通过一系列纯化步骤，制备高纯度具有生物学活性的重组SNAP25蛋白。鉴定结果证明重组SNAP25蛋白具有能被A型肉毒毒素特异切割的活性，可以作为肉毒毒素底物制剂应用于祌经毒的检测。(2)应用特异抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗体检测A型肉毒毒素的主要步骤如下(ELISA):首先包被重组SNAP25蛋白于酶联板上，0.4ug/孔，4。C过夜或37。C2h;3%BSA封闭37。Clh;加入待检样品，以A型肉毒毒素或其ALc片段为对照，37。C反应lh;洗板去除未反应物，再加入特异工gY抗体，37。C反应lh;加入HRP标记的抗IgY抗体，37'C反应30min，显色处理并记录结果。在对A型肉毒毒素标准品分析实验中，获得本分析系统的LOD为O.1LD50(小鼠)/ml(相当于O.4pg/ml)，L0Q为1.6LD50(小鼠)/ml(相当于6.4pg/ml);使用E型肉毒毒素对分析系统的特异性进行验证，显示特异性良好；将A型肉毒毒素混入牛奶、人血清作为模拟样品对方法的精确性进行验证，结果显示在牛奶或人血清混合物中分析方法均具有良好的精确性(88%〈Recovery〈lll%，inter-assayandintra-assayCV〈20%)。基于特异抗肉毒毒素底物肽SubA的IgY抗体建立的检测分析系统操作简便，不依赖于特殊仪器设备，只需一般ELISA操作条件即可完成；分析效率高，能在3h内得到结果；结果灵敏度高，可以达到0.1LD50/ml(相当于0.4pg/ml)，且特异性、精确性良好。本发明利用A型肉毒毒素特异切割点，选择A型肉毒毒素切割SNAP25位点N'端IO个氨基酸残基，即189N-198Q(命名SubA)做为免疫抗原制备特异IgY抗体，并将其成功应用于A型肉毒毒素检测和毒力分析。提供了快速、灵敏、便捷的肉毒毒素检测试剂和毒力甄别方法，具有非常良好的市场前景，同时也具有重要的社会意义。图1为重组大肠杆菌/^T-5崩尸i^/瓜i7诱导表达产物的SDS-PAGE图谱，其中M.蛋白分子量标准；l.重组大肠杆菌诱导表达(箭头所指处为目的蛋白SNAP25);2.重组菌未诱导对照。图2为重组SNAP25纯化产物的SDS-PAGE(A)和Western印迹(B)图谱，其中l.纯化后的SNAP25;M.蛋白分子量标准。图3为A型肉毒毒素对重组底物SNAP25的内肽酶活性分析SDS-PAGE图谱，其中M.蛋白分子量标准；1.10ulSNAP25;2.lOtxlSNAP25+5ul毒素；3.10ulSNAP25+10u1毒素；4.10ulSNAP25+15u1毒素c;5.10ulSNAP25+20ul毒素。图4为anti-SubAIgY抗体纯化产物的SDS-PAGE图谱，其中箭头所指处分别为IgY的重链和轻链。图5为IgY抗体的特异性验证(ELISA)，其中，包被抗原分别为SubA、SNAP25和BSA。图6为应用anti-SubA工gY对A型肉毒毒素进行检测分析(ELISA)及分析系统的特异性验证，其中底物SNAP25包被量为0.4ttg/孔，毒素与底物反应条件37'C，1h。数据处理方法为A型肉毒毒素标准品的量(小鼠LD50)进行对数变换后作为X轴，OD，读数作为Y轴作图。使用E型肉毒毒素(BoNT/E)作为对照。具体实施例方式实施例1重组SNAP-25的表达与纯化1.材料1.1菌株工程菌株/^r-5TV^P25/5i^7应用分子生物学方法构建(刘昊等，军事医学科学院院刊，2009)，根据GenBank中己报道的SNAP25编码基因序列，设计特异引物，通过RT-PCR从小鼠全脑组织总RNA中得到5y^/^5基因，将全长基因克隆至原核表达载体pET22b中，获得的重组质粒转化入大肠杆菌￡coh'BL21构建工程菌株/五r-SA^尸Z5/B/J7，用于外源蛋白SNAP25表达。1.2试剂Ni亲和层析柱HisTRAPFF购自GE公司。2.方法与结果2.1重组SNAP-25在大肠杆菌中的诱导表达将工程菌株p五r-57V/LP25/e丄"接种至含100Pg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基，37"C振荡过夜，次日以l:IOO接种至LB液体培养基，继续在37。C振荡培养，至菌液浓度达到OD600为0.40.6，加入IPTG至终浓度为lmM，25°C，120r/min水浴摇床振荡培养过夜。诱导培养产物4。C，6000r/min离心20min收集菌体。SDS-PAGE分析收集经过诱导的重组菌体进行SDS-PAGE电泳，结果显示重组菌体样品中出现分子量为28kDa的蛋白条带，与SNAP-25预期分子量相符(附图1)。2.2重组SNAP25的纯化将离心收集的菌体用缓冲液A(0.02M磷酸钠、0.5M氯化钠、0.04M咪唑，pH7.4)悬浮，置于冰浴中超声波破碎菌体，每次300W超声波处理20s，间隙10s，90个循环。破碎后的菌体悬液4。C10000g离心10min收集上清样品。以缓冲液A平衡亲和柱HisTRAPFF，样品以2mL/min速度上样后仍以缓冲液A平衡，以缓冲液B(0.02M磷酸钠、0.5M氯化钠、0.4M咪唑，pH7.4)线性梯度洗脱，60min内缓冲液B升至100。/。浓度，收集280nm洗脱峰。纯化产物经SDS-PAGE及Westem-blot分析(附图2)，结果显示重组目的蛋白纯度大于85%，可以被特异抗体所识别。2.3重组SNAP-25蛋白可以被A型肉毒毒素特异切割将A型肉毒毒素与反应缓冲液(50mmol/LHEPES，2mmol/LDTT，10umol/LZnC12，pH7.5)按2:1的比例37。C孵育15min后，分别取0，0.5，1，2，4，8(il与10|ilSNAP-25纯化产物在37。C下共孵育lh，经SDS-PAGE分析肉毒毒素与SNAP-25蛋白的反应结果。结果显示，随着毒素量的增加，SNAP-25的量逐渐减少，而在预期位置出现的切割后产物量逐渐增加(附图3)，说明重组蛋白SNAP-25具有能被A型肉毒毒素特异切割的活性，可以应用于肉毒毒素内肽酶活性的检测分析。实施例2特异抗肉毒毒素底物肽SiibA的IgY抗体制备1.材料产蛋来航鸡由北京实验动物中心提供，完全和不完全佐剂均购自Sigma公司。底物肽SubA序列为188NKTRIDEANQ197,如序列表中序列1所示，SubA及其修饰多肽KLP-SubA由上海波泰生物技术有限公司合成，纯度90%。2.方法与结果2.1动物免疫使用合成短肽KLP-SubA抗原免疫SPF来航蛋鸡，首次免疫使用福氏完全佐剂与短肽按照1:1的比例混匀，乳化后以1.0mg/kg的剂量进行注射，使用福氏不完全佐剂分别于3w，6w，11w进行第2、3、4次免疫。收集免疫后的鸡蛋。2.2IgY抗体的提取将免疫来航鸡所产鸡蛋于消毒液中浸泡15分钟，灭菌纱布拭净。去蛋青留取蛋黄，按l:8的体积比加入灭菌蒸馏水(pH4.2-4.4)，充分搅拌混匀，4"C静置过夜。移液管小心吸取上清液，滴加饱和硫酸铵溶液至终浓度20%并搅拌均匀，4'C静置4小吋以上。10000g离心IO分钟后吸取上清液，向其中继续滴加饱和硫酸铵溶液至终浓度40%并搅拌均匀，4t:静置过夜。10000g离心15分争l'，去尽上清，沉淀重溶于10mMPBS(pH7.4)溶液中，经10mMPBS(pH7.4)透析后，即为提取的IgY。对提取的IgY进行SDS-PAGE分析，结果显示提取的抗体纯度大于85%(附图4)。2.3anti-subAIgY抗体效价的动态检测(ELISA)以SubA为抗原包被酶联板，每孔100ng，ELISA方法检测IgY效价，二抗为HRP标记兔抗鸡抗体(SIGMA公司)。结果显示，随着免疫次数增加，抗体效价呈明显上升趋势，经四次免疫后，抗体效价可达5.12X105，在免疫结束后一年效价保持稳定。取12周所产蛋，按照如前所述的方法使用硫酸铵沉淀法提取鸡卵黄抗体，使用Bradford法进行蛋白含量测定，经计算可知其蛋白含量为35.51mg/ml;对其效价进行测定，结果如表l所示，抗体在l:32000时仍具有良好的结合活性。表lIgY-BoNT/A的效价测定<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>2.4鸡卵黄抗体anti-subA工gY特异性的验证通过ELISA法对anti-subAIgY的特异性进行验证。使用anti-subAIgY，分别对其与重组SNAP-25、人工合成subA的结合活性进行检测，方法如下(1)将SNAP-25、subA以50ng/100ul/孔，三复孔包被，以BSA为空白对照，4'C包被过夜；(2)0.1。/。PBST洗涤三次，每次3min，3%BSA37。C封闭30min;(3)0.P/。PBST洗涤三次，每次3min，加入l:40000稀释的鸡卵黄抗体，100u1/孔，37。Clh;(4)0.1%PBST洗涤三次，每次3min，加入HRP标记的兔抗鸡二抗，100"1/孔，37。C30min;(5)加入A、B液显色，使用2MH2S0〗终止，0045(}读数。结果如附图5所示，anti-subA工gY对subA有显著结合活性，对未经A型肉毒毒素切割的完整重组底物SNAP-25不具有结合活性，表明anti-subAIgY具有底物切割产物线性肽特异识别活性，可以应用于A型肉毒毒素的检测和内肽酶活性(神经毒力)分析。实施例3IgY抗体在A型肉毒毒素检测中的应用1.材料SpectroPlus全自动酶联免疫检测仪为MD公司产品，抗lgY-HRP购自SIGMA公司，酶联板及显色试剂购自百奥康公司。2.方法与结果2.1对A型肉毒毒素标准品进行分析操作步骤为将溶解于Ni-NTA洗脱缓冲液(0.02M磷酸钠、0.5M氯化钠、0.4M咪唑，pH7.4)中的SNAP-25三复孔包被于酶联板上，每孔0.4ug，4C过夜;拍掉包被液，使用0.WPBST洗涤三次，每孔200yl，每次3min;使用3。/。BSA封闭，每孔200"1，室温2h;拍掉封闭液，将溶解于切割反应缓冲液(5Ommol/LHEPES，2mmol/LDTT,10umol/LZnCl2，pH7.5)中的A型肉毒毒素标准品按照梯度浓度加入到酶联板中，使用切割反应缓冲液补齐每孔100yl，37。C反应lh;拍掉反应液，使用O.P/。PBST洗涤三次，每孔200ul，每次3min;加入anti-subAIgY(—抗)，1:40000稀释使用，每孔100ul，37。Clh;拍掉一抗，使用0.P/。PBST洗涤三次，每孔200ii1，每次3min;加入HRP标记兔抗鸡抗体(二抗)，1:2000稀释使用，每孔100txl，37。C30min;加入AB液显色10min，2MH2S(Xi终止，OD450读数;根据分析结果确定分析系统对A型肉毒毒素的LOD(LimitofDetection)及L0Q(LimitofQuantitation)。结果显示对毒素反应温度37。C、反应时间lh，底物包被每孔0.4ug条件下使用分析系统对A型肉毒毒素标准品分析的结果进行处理(结果见表2)，将A型肉毒毒素标准品的量(小鼠LD50)进行对数变换后作为X轴，0D45Q读数作为Y轴作图(附图6)，结果显示，OD彻读数随加入的A型肉毒毒素标准品的量的增加而变大，呈现出量效关系。表2.分析系统对BoNT/A的毒力分析数值LD5000.0150.030.060.120.240.480.961.927.6815.360.0220.0380.0430.060.0780.1230.1530.2180.2720.4010.627OD4500.030.0290.0560.0830.1270.1440.1190.210.2950.5040.70.0270.040.0630.0720.1150.1270.1620.2370.2660.5420.697MeanOD4500.0260.0360.0540.0720.1070.1310.1450.2220.2780.4820.675SD0.004040.005860.01010.01150.025540.011150.022680.013870.015310.072960.0413CV15.35%16.43%18.79%16.05%23.94%8.49%15.68%6.26%5.51%15.13%6.12%对BoNT/A加入量的值进行对数变换后得到公式y二0.219e。襲，R2=0.9931。根据背景平均值加两倍标准差为cutoff值计算，0.01LD50/100ixl(相当于O.4pg/ml)为分析系统的L0D(LimitofDetection)，以CV〈16%为限，则0.16LD50/100iU(相当于6.4pg/ml)为分析系统的L0Q(LimitofQuantitation)。2.2分析系统的特异性验证使用分析系统在反应温度37。C，反应时间lh，底物包被量每孔0.4yg条件下，对E型肉毒毒素进行分析，操作方法同前。将结果与同样条件下对A型肉毒毒素分析得到的结果进行对比。将毒素量(小鼠LD50)进行对数变换后作为X轴，以0D450读数为Y轴作图(见附图6)，结果显示BoNT/E的分析结果并未呈现量效关系，证明分析系统的特异性良好。2.2模拟样品的检测分析使用模拟样品对分析系统的可靠性进行验证，方法如下将待测的A型肉毒毒素分别使用反应缓冲液、人血清和牛奶对倍稀释混匀，分别取出梯度浓度的样品作为待测样品。使用分析系统在反应温度37"C，反应吋间lh，底物包被量每孔0.4iig条件下，对待测样品进行分析，操作方法同前。对结果进行处理，根据OD,加读数按照前述公式分别计算出模拟样品中毒素的含量，并与模拟样品中毒素的实际含量进行比较，计算出组内及组间CV、Recovery值(见表4)。结果显示，使用分析系对反应缓冲液或人血清、牛奶中的模拟样品进行分析的结果其Recovery均在88%-111%之间，证明分析系统具有良好的组内精确性(accuracy);对组内及组间CV值进行比较，其CV值均小于20%(inter-assayandintra-assayCV〈20%)，证明分析系统具有良好的精确性(precision)。表4.使用模拟样品对分析系统的精确性进行验证毒素实际值(LD5。)组别B组0.24LD50M组S组B组0.32LD50M组S组B组0.48LD50M组S组0.1200.1250.1240.1460.1380.1410.1590.1630.148OD4500.1290.1150.1230.1410.1280.1330.1570.1420.1640.1190.1320.1370.1390.1380.1300.1510.1610.152毒素计算0.22650.25050.24550.36750.31980.33720.45360.48230.3801值0.27070.20390.24070.33720.26560.29190.43970.34310.4897(LD50)0.22180.28650.31410.32550.31980.27590.39940.46790.4059Intra-M0.23970.24700.26680.34340.30170.30170.43090.43110.4252Intra-SD0.02700.04140.04100.02170.03130.03180.02810.07650.0573Intra-CV11.3%16.8%15.4%6.3%10.4%10.5%6.5%17.8%13.5%Rscovsry99.9%102.9%111.2%107.3%94.3%94.3%89.8%89.8%88.6%Inter-M0.25110.31560.4291Inter-SD0.03440.03240.0499Inter-CV13.7%10.3%11.6%(Intraandinter-assaypresicionpresentationasCV,accuracypresentationasRscovery.)(B组.将待测的A型肉毒毒素使用反应缓冲液对倍稀释混匀；M组.将待测的A型肉毒毒素使用牛奶对倍稀释混匀；S组.将待测的A型肉毒毒素使用人血清对倍稀释混匀；M.mean计算值平均值；intra.组内；inter.组间)17抗肉继底物肽抗体序列表<110〉中闺人民制'放军军￥阪学科学院微生物流行病研究所<120〉一种抗肉想母索底物肽SubA的IgY抗体，JL:制备方法和用途<130〉〈160〉1<170〉Patentlriversion3.2〈210〉1〈211〉10<212〉PRT〈213>〈柳>1AsnUsThrArglieAspGluAlaAsnGin1510权利要求1.一种抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体，其特征在于特异识别肉毒毒素底物肽SubA，该底物肽SubA的氨基酸序列如序列表中序列1所示。2.权利要求1所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体的衍生物，是IgY抗体的蛋白酶消化产物，其特征在于保留IgY抗体的抗原结合活性。3.权利要求1所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体，其特征在于通过将肉毒毒素底物肽抗原免疫鸡，然后从其蛋黄中提取卵黄免疫球蛋白，进一步纯化或蛋白酶消化进行制备，该IgY抗体分子量为180,000，制备纯度大于85%。4.权利耍求l所述抗肉毒毒素底物肽IgY抗体的制备方法，包括如下步骤(1)重组制备肉毒毒素底物肽抗原(底物肽SubA或其修饰体)；(2)应用肉毒毒素底物肽抗原多次加强免疫产蛋鸡；(3)收集鸡蛋，分离出蛋黄，提取卵黄免疫球蛋白；(4)纯化IgY抗体或进一步蛋白酶消化加工。5.根据权利要求4所述的制备方法，其中制备肉毒毒素底物肽抗原采用化学合成或基因工程重组表达方法。6.根据权利要求4所述的制备方法，其中提取卵黄免疫球蛋白采用水稀释法、盐析或PEG法。7.根据权利要求4所述的制备方法，其中纯化IgY抗体采用DEAE色谱、凝胶过滤或亲和层析分离纯化方法。8.权利要求1所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体或权利要求2所述抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体的衍生物在制备检测A型肉毒毒素以及产A型肉毒毒素病原菌的诊断试剂中的用途。9.根据权利要求8所述用途，其中肉毒毒素来自产生肉毒毒素的微生物:肉毒梭菌。全文摘要本发明公开了一种抗肉毒毒素底物肽的IgY抗体，该抗体可以通过以下方法制备化学合成或基因重组表达的方法制备SNAP25短肽subA，通过subA免疫产蛋鸡，收集鸡蛋，应用生物化学方法提取和纯化卵黄免疫球蛋白。该抗体具有高特异性的结合底物线性短肽subA，而不结合完整底物SNAP25的特点，具有特异识别A型肉毒毒素酶解SNAP25作用的能力，可以作为检测试剂应用于A型肉毒毒素的检测和神经毒力或内肽酶活性分析，以及临床肉毒中毒诊断，具有良好的市场前景和重要的社会意义。文档编号C07K16/12GK101648997SQ20091009228公开日2010年2月17日申请日期2009年9月9日优先权日2009年9月9日发明者侯晓军,昊刘,晶史,涛李,慧王,琴王申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所