新型抗hiv感染多肽及其利用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及用于抑制Hiv感染的多肽及其在制备抗HIV感染 或预防或治疗艾滋病的药物中的用途。
【背景技术】
[0002] 人免疫缺陷病毒（HIV)是艾滋病的病原体，目前全球有超过3000万感染者，每年 导致约200万人死亡，并且每年还新增约200万感染者，严重威胁人类的健康。目前世界范 围内HIV感染主要以1型（HIV-I)为主。
[0003] HIV-I通过其包膜糖蛋白（Env)介导的病毒-细胞膜融合感染宿主细胞。Env包 含表面亚基gpl20和跨膜亚基gp41，三个Env形成非共价复合体镶嵌在病毒表面。表面亚 基gpl20在病毒感染细胞过程中可以特异识别并结合于靶细胞表面的受体和辅助受体，同 时起着稳定跨膜亚基gp41功能,并在适当时机释放出gp41以启动融合；跨膜亚基gp41是 导致病毒-细胞膜融合的直接功能分子。
[0004] 在病毒细胞融合过程中，gp41的N-端螺旋区（NHR)和C-端螺旋区（CHR)通过折 叠形成了一个发夹状的六螺旋结构；该结构的形成为病毒-细胞膜融合提供了能量，对病 毒-细胞融合至关重要。晶体结构显示，在六螺旋中，三个由NHR形成的螺旋结构构成内核， 形成三个沟槽，三个CHR反平行结合在沟槽中。能够阻止HIV-I六螺旋形成的药物则可以 有效地抑制艾滋病毒-细胞膜融合从而阻止病毒感染和体内传播，用于艾滋病治疗，称为 融合抑制剂。
[0005] 最初NHR衍生多肽作为融合抑制剂的发现是1992年WiId等发现的DP107 (aa553-590)，其抑制病毒感染的活性在0. 2-liiM左右。另外，蛋白水解酶切产物N36 (aa546-581)也作为NHR衍生多肽设计的模板，原始序列的活性约为IiiM。直接衍生于NHR 的多肽（也称为N肽）抗融合活性比衍生于CHR的多肽要差很多，主要原因可能是单分子 的N肽在溶液中容易自身聚集，降低了其与靶点的结合几率；另外由于NHR序列比较保守， 改造空间相对较小。外源NHR衍生多肽可直接与病毒gp41亚稳态结构中的内源CHR结合， 形成无活性的六螺旋结构；或与内源NHR竞争性的结合形成复合螺旋（coiled-coil)内核 结构，阻碍其形成有正常功能的六螺旋。
[0006] 在NHR的螺旋结构中，每两圈螺旋所包含的七个残基可以依次标记为a-g位。在六 螺旋中，NHR通过其（a,d)位疏水残基自聚形成三聚体复合螺旋，并通过其（e，g)位残基与 外围的CHR结合。一般认为，在单独存在的溶液状态下，NHR的（a，d)位残基可以使其发生 寡聚形成卷曲复合螺旋，而（e，g)位点残基则主要使寡聚后的复合螺旋结构发生沉聚。单 独的N肽活性均比较低，其抑制病毒-细胞融合的IC50值约为I-IOiiM。根据文献报道，这 可能与其在溶液中容易发生自身折叠从而使得靶结合活性位点不易暴露有关。
[0007] 在克服NHR多肽自聚方面，一般通过在NHR的N或C末端引入有稳定三聚体卷曲 螺旋结构的模型肽，得到嵌合蛋白，使其在溶液状态下呈现稳定的三聚体结构，可大大改善 N肽的活性。但是这些嵌合蛋白分子量大，合成难度较高，作为药物开发仍存在一定距离。
【发明内容】
[0008] 本发明人经过深入的研究和创造性的劳动，令人惊奇地发现，在保留原始N肽长 度的基础上，通过在N肽的（a，d)位点引入疏水性氨基酸，并在N肽的（e，g)位点引入螺旋 结构稳定因素-盐桥，可以得到单体具有〇.IUM以下IC50值的有高融合抑制活性的N肽 融合抑制剂，这类多肽融合抑制剂的氨基酸残基均为天然氨基酸，具有明显的合成优势。由 此提供了下述发明：
[0009] 本发明的第一方面涉及一种多肽、其衍生物、或其可药用盐，其中，所述多肽包含 选自SEQIDNO: 1~SEQIDNO: 10所示的氨基酸序列：
[0010] QffKNLLEAIKAQQELLKLTVEGIKQLQERIKAVERYLK(SEQIDNO：1)；
[0011] QINNLLRAIEALQHLLQLLVffGIKQLQARILAVERYLK(SEQIDNO：2)；
[0012] QffNNLLEAIKALQELLKLLVEGIKQLQERIKAVERYLK(SEQIDNO：3)；
[0013] QffKNLLEAIKALQELLKLLVEGIKQLQERIKAVERYLK(SEQIDNO：4)；
[0014] WKNLLEAIKALQELLKLLVEGIKQLQERIKAVERYL(SEQIDNO：5)；
[0015] LLSGIVQQINNLLRAIEALQHLLQLIVWGIKQLQARIL(SEQIDNO：6)；
[0016] LLKGIVEQIKKLLEAIKALQELLKKIVEGIKWLQERIL(SEQIDNO：7)；
[0017] LLKGIVEQIKNLLEAIKALQELLKLIVEGIKWLQERIK(SEQIDNO：8)；
[0018] LWEQIRKLLSGIVQQINNLLRAIEALQHLLQKIVEGIK(SEQIDNO：9)；
[0019] LWKQIRELLKGIVEQIKNLLEAIKALQELLKLIVEGIK(SEQIDNO:10)。
[0020] 其中氨基酸缩写具有本领域公知的含义，例如：W为色氨酸、N为天冬酰胺、A为丙 氨酸、S为丝氨酸、K为赖氨酸、L为亮氨酸、E为谷氨酸、Q为谷氨酰胺、I为异亮氨酸、H为 组氨酸、M为甲硫氨酸、T为苏氨酸、D为天冬氨酸、R为精氨酸、Y为酪氨酸、F为苯丙氨酸。
[0021] 根据本发明第一方面任一项所述的多肽、其衍生物、或其可药用盐，其中，所述多 肽的N末端连接乙酰基、寡肽序列、或亲脂性基团，和/或C末端连接酰胺基、寡肽序列、亲 脂性基团、或胆固醇等；
[0022] 优选地，所述寡肽序列为1-10个氨基酸残基组成的寡肽序列(例如EEE、KKK、 GQAV、GEEE等）；
[0023] 优选地，所述亲脂性基团为含有3到20个碳原子的脂肪酸链，更优选含8-16个碳 原子的脂肪酸链。
[0024] 在本发明的实施方案中，所述多肽的N末端连接乙酰基（CH3CO-),和/或C末端连 接酰胺基（-CONH2 )。
[0025] 本发明第二方面涉及核酸分子，其编码本发明第一方面任一项所述的多肽。
[0026] 本发明第三方面涉及重组载体，其含有本发明第二方面所述的核酸分子。
[0027] 根据本发明第三方面任一项的重组载体，其中所述载体为克隆载体或表达载体， 所述表达载体例如为原核表达载体或真核表达载体。
[0028] 本发明第四方面涉及重组细胞，其含有本发明第三方面所述的重组载体。
[0029] 根据本发明第四方面任一项的重组细胞，其中所述细胞为原核细胞(例如大肠杆 菌）或真核细胞(例如酵母细胞、哺乳动物细胞)。
[0030] 本发明的另一方面涉及一种药物组合物，其包含本发明第一方面任一项的多肽、 其衍生物、或其可药用盐、或者本发明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任 一项的重组载体、或者本发明第四方面任一项的重组细胞；任选地，还包含药学上可接受的 载体或辅料。优选地，所述药物组合物为注射剂。
[0031] 通常本发明药物组合物含有0. 1 - 90重量％的本发明第一方面任一项的多肽、其 衍生物、或其可药用盐、或者本发明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任一 项的重组载体、或者本发明第四方面任一项的重组细胞。药物组合物可根据本领域已知的 方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明第一方面任一项的多肽、其衍生物、或其可 药用盐、或者本发明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任一项的重组载体、 或者本发明第四方面任一项的重组细胞与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂 结合，制成可作为人用的适当的施用形式或剂量形式。
[0032] 本发明的再一方面涉及本发明第一方面任一项的多肽、其衍生物、或其可药用盐、 或者本发明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任一项的重组载体、或者本 发明第四方面任一项的重组细胞在制备治疗和/或预防和/或辅助治疗包膜类病毒感染所 致疾病的药物中的用途。
[0033] 在本发明的实施方案中，所述包膜类病毒为人免疫缺陷病毒（HIV)，例如为 HIV-I。
[0034] 在本发明的实施方案中，所述包膜类病毒感染所致的疾病为艾滋病，例如为I型 艾滋病。
[0035] 本发明的再一方面涉及一种治疗和/或预防和/或辅助治疗包膜类病毒感染所致 疾病的方法，包括给予有需要的受试者有效量的本发明第一方面任一项的多肽、其衍生物、 或其可药用盐、或者本发明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任一项的重 组载体、或者本发明第四方面任一项的重组细胞的步骤。
[0036] 在本发明的实施方案中，所述包膜类病毒为人免疫缺陷病毒（HIV)，例如为 HIV-I。
[0037] 在本发明的实施方案中，所述包膜类病毒感染所致的疾病为艾滋病，例如为I型 艾滋病。
[0038] 本发明的再一方面涉及本发明第一方面任一项的多肽、其衍生物、或其可药用盐、 或者本发明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任一项的重组载体、或者本 发明第四方面任一项的重组细胞在制备作为HIV融合抑制剂或者抗HIV药物中的用途。
[0039] 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制HIV的方法，包括使用有效量的本 发明第一方面任一项的多肽、其衍生物、或其可药用盐、或者本发明第二方面任一项的核酸 分子、或者本发明第三方面任一项的重组载体、或者本发明第四方面任一项的重组细胞的 步骤。
[0040] 本发明的再一方面涉及一种在体内或体外抑制HIV-IEnv介导的细胞融合的方 法，包括使用有效量的本发明第一方面任一项的多肽、其衍生物、或其可药用盐、或者本发 明第二方面任一项的核酸分子、或者本发明第三方面任一项的重组载体、或者本发明第四 方面任一项的重组细胞的步骤。
[0041] 发明的有益效果
[0042] 本发明涉及的多肽长度为36-38个天然氨基酸残基，其活性较原始序列大大提 高，其中最佳活性序列较原始序列在活性上提高了近100倍，达到了 39nM。这些多肽作为直 接衍生于NHR的单体融合抑制剂，具有很好的应用价值，且其合成成本大大降低，具有非常 好的开发前景。同时，这些多肽水溶性好，在溶液状态下可形成稳定的螺旋结构，对于改善 药物水溶性和研究此类药物作用的机制非常有利。
【附图说明】
[0043] 图1多肽1单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0044] 图2多肽2单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0045] 图3多肽3单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0046] 图4多肽4单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0047] 图5多肽5单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0048] 图6多肽6单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0049] 图7多肽7单独溶液及其与CHR混合溶液的⑶谱
[0050] 图1-7中，横坐标为波长（nm)，纵坐标为0(deg?cm2 ?dmor1);其中的1-7分别 为多肽的编号。
[0051] 图8多肽1的⑶变温扫描曲线
[0052] 图9多肽2的⑶变温扫描曲线
[0053] 图10多肽3的⑶变温扫描曲线
[0054] 图11多肽4的⑶变温扫描曲线
[0055] 图12多肽5的⑶变温扫描曲线
[0056] 图13多肽6的⑶变温扫描曲线
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