一种抗血管生成的多肽nr16及其改造肽的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种具有抗血管生成作用的多肽NR16及其改造肽[D-Ala^ARH。
【背景技术】
[0002]血管生成是在原有血管内皮细胞的基础上形成新血管的自然过程。研究表明，实体瘤的生长依赖于新生血管生成，血管生成在肿瘤生长和转移过程中起着非常重要的作用，不仅可以为肿瘤生长和转移提供必需的氧气和营养物质，而且可以排泄代谢产物。抗肿瘤血管生成疗法具有很多优点:①具有高效性，破坏少量的血管可使依靠其生长的大量的肿瘤细胞发生缺血性坏死血管细胞无或少突变，不易产生耐药性，可长期用药；③广泛的抑瘤谱，不同肿瘤的血管内皮细胞往往表达相同的特异性蛋白分子，针对这种蛋白分子的一种疗法就可能适用于多种肿瘤药物易于到达靶细胞，血管内皮细胞直接暴露于血液中，药物能直接发挥作用。
[0003]内皮细胞受体酪氨酸激酶VEGF-R2和Tie_2，及其配体血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素Angl和Ang2，在血管生成中起着重要作用。通过封闭VEGF受体途径或者封闭Tie-2受体途径，都能抑制肿瘤血管生成和肿瘤生长，并且抑制VEGF受体传导途径不能被Tie-2传导途径所补偿，反之亦然，两个途径相对独立，且同样重要；即同时抑制由VEGFR-2和Tie-2介导的信号通路比单独抑制其中一条通路有更强的维持正常血管及肿瘤相关血管完整和稳定的能力。
[0004]AS16作为一种由VEGFR2受体拮抗剂ATWLPPR (VI肽)和Tie2受体拮抗剂NLLMAAS (V2肽)通过柔性连接子(A— A)连接的多肽，在现有专利中已得到较为充分公开(CN101830971，一种新型抗肿瘤血管生成多肽)。但是作为一种多肽类药物，由于其分子量较小，在生物体内容易被酶降解，半衰期短，因而治疗效果容易受到较大影响，同时其对于抑制肿瘤新生血管生成的作用效果也存在进一步提升的空间。
【发明内容】
[0005]本发明主要目的是在现有AS16多肽基础上，通过对其研究改造，获得了一种新的多肽NR16及其改造肽[D-Ala^ARH，新的多肽结构相较于原有的AS16多肽，同样表现出较好地抗肿瘤血管生成作用，为抗肿瘤药剂的应用提供了新的可能。
[0006]下面对本发明的技术方案详细介绍如下。
[0007]—种抗血管生成多肽NR16及其改造肽，所述多肽NR16含有16个氨基酸，分子量为1683.0，序列如序列表SEQ ID N0.1所示，具体氨基酸序列为:
Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即 NLLMAASAAATWLPPR ；
相较于原有多肽AS16，在结构上其主要区别是ATWLPPR肽段与NLLMAAS肽段的连接顺序发生了颠倒； 所述AS16为现有专利中已公开的(申请号:2010101722261，公开号:CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中成为V3肽)多肽序列。
[0008]所述NR16改造肽，命名为[D-Ala^ARH，包含17个氨基酸，其分子量为1754.1，序列所SEQ ID N0.2所示，具体氨基酸序列为:
D-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即D-ANLLMAASAAATWLPPR ；
所述NR16改造肽[D-Ala1] AR17，通过在NR16肽N端增加一个D_Ala实现；
所述D-Ala、D-A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D-构型。
[0009]所述抗血管生成多肽NR16及其改造肽的制备方法，均采用Fomc固相多肽合成法制备而成，过程为:
首先将第一个氨基被Fmoc基团保护的氨基酸连接在不溶性固相载体Wang树脂上，然后脱掉氨基的保护基，第一个氨基酸即连接至固相载体上；
其次将氨基被Fmoc基团保护的第二个氨基酸的羧基用缩合剂活化，活化后的氨基酸再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基发生脱水缩合反应，形成肽键；
重复上述的肽键形成反应，使肽链从C端向N端生长，直至达到所需要的肽链长度，最后切割合成的多肽，经过乙醚沉淀与洗涤，得到粗肽；
经HPLC纯化后即可制得较高纯度的多肽样品。
[0010]具体包括以下步骤:
(1)溶胀树脂，于多肽合成仪中溶胀Wang树脂；
(2)第一个氨基酸的添加，计算称取精氨酸，同时按比例加入H0BT(1-羟基苯丙三唑)、DIC (Ν, Ν- 二异丙基二亚胺)，反应，反应结束后加封头液封头，洗涤；
(3)第二个氨基酸即脯氨酸的添加，合成是从肽链的C端到Ν端方向进行，对步骤(2)中第一个氨基酸添加后树脂脱保护，洗涤，然后茚检，按比例加入第二个氨基酸脯氨酸、Η0ΒΤ、DIC，反应，洗涤；
(4 )后续氨基酸的添加，添加的方法同上述第二个氨基酸的添加过程，直至加完所有氨基酸；
在制备NR16改造肽[D-Ala1]AR17时，需要注意的是，除了最后一个氨基酸改为D型丙氨酸，其他的氨基酸均为L型氨基酸；
(5)多肽的切割，向步骤(4)中装有树脂的多肽合成仪中加入适量的脱保护液，洗涤；然后在通风橱中将配置好的切割试剂倒入合成仪中进行切割反应；切割完毕后，用旋转蒸发仪将切割液中的TFA去除；由于多肽序列中含有精氨酸，需再进行冰切；冰切完成后获得粗肽；粗肽烘干后利用RP-HPLC纯化，纯化后产物首先于_80°C低温冰箱冷冻过夜，然后用冷冻干燥机冻干成白色粉末后于-20°C冰箱保存备用，即为所合成的多肽成品。
[0011]所述抗血管生成多肽NR16及其改造肽，在作为肿瘤治疗药物中的应用，所述肿瘤例如H22肝癌所导致肿瘤。
[0012]现有技术中，多肽AS16虽然表现出较好的抑瘤效果，但就作为药剂实际而言，仍然存在药剂类型单一，效果有待进一步提高等缺陷。本发明所提供的多肽NR16及其改造肽[D-Ala1] AR17，与多肽AS16结构存在一定的类似程度，同时更为重要的是，同样表现出了较好的抑瘤效果，因而就其未来应用前景而言，是可以较好地作为多肽AS16的补充甚至替代多肽AS16的，同时也为未来新的肿瘤药剂的研制、开发提供新的借鉴和可能。
【附图说明】
[0013]图1为AS16的质谱鉴定图；
图2为NR16的质谱鉴定图；
图3为[D-Ala1]AR17的质谱鉴定图；
图4为多肽AS16、多肽NR16、多肽[D_Alal]AR17对Balb/c小鼠的生长曲线图；
图5为多肽AS16、多肽NR16、多肽[D_Alal]AR17对Balb/c小鼠的H22瘤重；
图6为多肽AS16、多肽NR16、多肽[D_Alal]AR17对Balb/c小鼠的抑瘤率。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，对本发明中所用部分样品、药剂及仪器设备简要说明如下。
[0015]实验试剂
Fomc固相多肽合成中，Wang树脂和Fmoc保护的L型氨基酸及D型氨基酸均购于吉尔生化(上海)有限公司；
细胞培养中，RPM1-1640培养基(500mL/瓶)购于北京Solarb1公司；FBS (胎牛血清，100mL/瓶)购于杭州四季青生物有限公司。
[0016]小鼠样品及癌细胞
Balb/c小鼠，无特定病原体动物(SPF)级，雌性，18-20g，购自北京华阜康生物医药科技有限公司；
昆明小鼠，清洁级，18-20g，河南省实验动物中心提供；
H22小鼠肝癌细胞，来自于河南省医学科学研究院。
[0017]Balb/c小鼠移植瘤模型的建立具体步骤如下:
(1)取出在培养瓶中培养的H22小鼠肝癌细胞，调整细胞浓度至IX107个/mL，常规消毒；用lmL注射器吸取0.2mL (含2 X 106个细胞)肿瘤细胞(H22小鼠肝癌细胞)悬液，注射入昆明小鼠的腹腔内；
(2)将H22小鼠肝癌细胞经过两次以上腹腔传代之后，取出腹水，800r/min离心8min，弃上清，生理盐水重悬，吸取重悬液用0.2%台盼兰染色，显微镜下观察确认细胞成活率>95%时可以进一步应用。调整细胞浓度至1\107个/!^，常规消毒备用；
(3)吸取0.2mL (含2X 106个细胞)肿瘤细胞(H22小鼠肝癌细胞)悬液注射入Balb/c小鼠右上肢腋下，建立Balb/c小鼠移植瘤模型，并观察记录肿瘤的生长情况。
[0018]实施例1
本申请所提供的抗血管生成多肽NR16及其改造肽，所述多肽NR16含有16个氨基酸，分子量为1683.0，具体氨基酸序列为:
Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即NLLMAASAAATWLPPR ；
所述NR16改造肽，命名为[D-Ala^ARH，包含17个氨基酸，其分子量为1754.1，具体氨基酸序列为:
D-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser-Ala-Ala-Ala -Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，即D-ANLLMAASAAATWLPPR ；
所述NR16改造肽[D-Ala1] AR17，通过在NR16肽N端增加一个D_Ala实现；
所述D-Ala、D-A代表该多肽序列中第一个氨基酸丙氨酸为D-构型。
[0019]AS16为现有专利中已公开的(申请号:2010101722261，公开号:CN101830971A，一种新型抗肿瘤血管生成多肽，在该专利中为V3肽)多肽序列，与现有多肽序列相比，多肽NR16在结构上与其主要区别是ATWLPPR肽段与NLLMAAS肽段的连接顺序发生了颠倒。
[0020]多肽NR16采用Fomc固相多肽合成法制备而成，具体制备过程如下:
(1)溶胀树脂，称取0.3g的Wang树脂，再将称量好的Wang树脂倒入洗干净且干燥的多肽合成仪中，之后加入DMF