昆虫定点基因敲入组合物及其使用方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及遗传学转基因技术以及生物生物技术领域。具体地说，本发明涉及将 带有可视性筛选标记的外源性DNA片段高效、精确地导入昆虫基因组的定点基因敲入组合 物及其使用方法和应用。
【背景技术】
[0002] 随着全基因组测序技术的不断发展完善以及大型基因组注释项目的实施，生物科 学的研究进入后基因组时代。研究重心也转向基因功能，即由测定基因的DNA序列、解释生 命的所有遗传信息转移到从分子整体水平对生物学功能的研究上，在分子层面上探索人类 健康和疾病的奥秘（Peltonen和McKusick，2001)。不过如何将海量枯燥的基因组信息数据 转换成有意义的基因组功能是很大的挑战，从而需要有高效、可靠的方法来研究基因型对 表型的影响。
[0003] 同源重组机制（HR)可以对基因进行定向失活（Targeted gene inactivation)， 从而帮助科研人员明确基因的功能（Capecchi，2005)。但该方法存，例如效率低、费时 费力、而且有可能导致突变等缺陷。RNA干扰技术（RNA interference, RNAi)等基因革巴 向敲除技术是快捷、廉价而且可以开展高通量研究的新方法（Hannon, 2002 ;McManus和 Sharp，2002)。但这种技术的敲除效果不彻底，每次试验以及每个实验室的试验结果都 会有差异，还存在不可预知的脱祀情况（off-target effect),故只能暂时抑制基因功能 (Jackson 等·，2003 ;Jackson 和 Linsley, 2004)。
[0004] 近十年来出现的"基因组编辑技术（genome editing)"可以对各种细胞和生物体 内的几乎任意基因进行人工操作。但采用这些技术实现基因组精准定点改造的效率依然很 低。
[0005] 昆虫的代表模式生物是果蝇，早期主要通过放射性诱变或者化学诱变使果蝇的基 因产生突变。随着转座子的发现，P因子在果蝇中成为制造突变体的主要方式。然而，单独 的P因子及其他很多转座子在基因组的一些位置很难插入。同时，上述这些方法不能对基 因组定点进行改造。
[0006] 传统的果蝇基因组定点改造技术基于DNA双链缺口（double-strain breaks, DSB)可以诱发HR的原理，可以分为Ends-out和Ends-in两种途径（Rong和 Golic, 2000 ;Maggert等.，2008)。然而，无论是Ends-out还是Ends-in途径，均存在着繁 琐，需要大量筛选实验，所需时间长（6个月甚至1年）的缺点。而且，采用这些方法进行基 因定点改造，HR的发生概率其实很低，通常低于0. 1% (Huang等.，2009)。总之，传统果蝇 基因定点改造的方法缺点是效率低、周期长。
[0007] 上述的基因编辑技术也已应用于果蝇。但是这些技术会产生indels(插入和缺 失，insertions and deletions),不能精确地整合外源DNA，而且外源基因的整合效率不高 (Bassett等·，2014 ;Gratz等·，2014)。虽然基因编辑技术缩短了操作时间，但是在HR效 率上没有明显改进。同时，这些新技术在进行果蝇基因同源重组的同时未能引入标记以提 高后续的转基因筛选效率。
[0008] 此外，由于昆虫细胞不似哺乳动物细胞那样，在建立转基因昆虫品系时，重组组 合物进入昆虫早期胚胎（如受精卵）后，随着胚胎的发育，组合物被随机分配入极少数 生殖前体细胞；生殖细胞本身的数目相对较少；昆虫早期发育细胞周期短、细胞快速分 裂导致实际复合物浓度快速稀释，但提供组合物的初始浓度不可能无限制地提高等等原 因，现有技术中在昆虫细胞中诱发同源重组整合并产生稳定遗传转基因昆虫品系的效率 往往不高。目前，现有技术中制备定点转基因整合昆虫品系的效率只能达到0.3%，参见 Gratz SJ 等· （2013)Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9nuclease. Geneticsl94:1029 - 35。在地中海黑腹果蝇中，如果预先制备好特殊的工 具转基因果蝇品系，然后在工具果蝇品系中进行定点转基因整合反应，效率也只达到〇~ 10% ;此外，由于需要事先制备工具转基因果蝇品系，不仅操作本身比较繁琐，而且对于其 他昆虫物种并没有实用价值。参见Gratz SJ等.（2014)Highly Specific and Efficient CRISPR/Cas9-Catalyzed Homology-Directed Repair in Drosophila. Genetics. On line publication。
[0009] 综上所述，本领域急需能将外源性DNA片段高效、精确地导入昆虫基因组的物质 手段和技术手段，所述外源性DNA片段可以带有筛选标记，更优选可视性筛选标记。
【发明内容】
[0010] 本发明的目的是提供用于昆虫定点基因敲入的组合物。
[0011] 本发明的另一目的是提供在昆虫细胞中稳定、高效地进行定点基因敲入的方法。
[0012] 本发明还有一目的是提供制备转基因昆虫的方法。
[0013] 在第一方面，本发明提供一种用于昆虫定点基因敲入的重组因子组合物，所述重 组因子组合物由重组因子RecA、Rec0、RecF和RecR中的一种或多种组成或由所述重组因子 的编码多核苷酸中的一种或多种组成，
[0014] 其中，所述重组因子RecA是：
[0015] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白；或
[0016] (ii)由SEQ ID N0:3所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0017] 所述重组因子RecA的编码核苷酸序列是：
[0018] ⑴如SEQ ID N0:4所示的核苷酸序列；或
[0019] (ii)由SEQ ID N0:3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:3所7K蛋白功能的衍生蛋白的编码序列；
[0020] 所述重组因子RecO是：
[0021] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的蛋白；或
[0022] (ii)由SEQ ID N0:5所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:5所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0023] 所述重组因子RecO的编码核苷酸序列是：
[0024] ⑴如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列；或
[0025] (ii)由SEQ ID NO:5所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:5所7K蛋白功能的衍生蛋白的编码序列；
[0026] 所述重组因子是RecF是：
[0027] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示的蛋白；或
[0028] (ii)由SEQ ID N0:7所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0029] 所述重组因子RecF的编码核苷酸序列是：
[0030] ⑴如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；或
[0031] (ii)由SEQ ID N0:7所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:7所7K蛋白功能的衍生蛋白的编码序列；
[0032] 所述重组因子RecR是：
[0033] ⑴氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白；或
[0034] (ii)由SEQ ID N0:9所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID N0:9所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0035] 所述重组因子RecR的编码核苷酸序列是：
[0036] ⑴如SEQ ID N0:10所示的核苷酸序列；或
[0037] (ii)由SEQ ID N0:9所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID N0:9所7K蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
[0038] 在优选的实施方式中，所述重组因子组合物由重组因子RecA、RecO、RecF和RecR 组成或由所述重组因子的编码多核苷酸组成。
[0039] 在第二方面，本发明提供一种用于昆虫定点基因敲入的组合物，所述组合物包含 以下组分：
[0040] 1).单切口酶或其编码多核苷酸；
[0041] 2).重组因子或其编码多核苷酸；和
[0042] 3).任选的，包含外源性基因的供体DNA。
[0043] 在优选的实施方式中，所述单切口酶在欲加以改造的DNA序列上产生双重单链缺 口或多对双重单链缺口。
[0044] 在优选的实施方式中，所述单切口酶在欲加以改造的DNA序列上产生双重单链缺 □。
[0045] 在优选的实施方式中，所述单链缺口之间的距离为50-500bp ;优选70-400bp ;最 优选 80-200bp。
[0046] 在优选的实施方式中，所述单切口酶包括但不限于：基因工程改造过的I-scel、 I-AniI、Talen-FokI、CRISPR/Cas9 以及一些合成的多核苷酸，如 LNA、PNA。
[0047] 在优选的实施方式中，所述单切口酶是Cas9_D10A。
[0048] 在优选的实施方式中，所述单切口酶是Cas9_D10A，其是：
[0049] ⑴氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白；或
[0050] (ii)由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺 失或添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋 白；或者
[0051] 所述单切口酶Cas9_D10A的编码核苷酸序列是：
[0052] ⑴如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列；或
[0053] (ii)由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氣基酸序列如SEQ ID NO: 1所7K蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。
[0054] 在另一优选的实施方式中，所述重组因子是RecA、Rec0、RecF和RecR中一种或多 种的组合；优选地，所述重组因子是RecA、RecO、RecF和RecR的组合。
[0055] 在另一优选的实施方式中，所述组合物由以下部分组成：
[0056] 1) ·单切口酶Cas9_D10A或其编码多核苷酸；
[0057] 2).重组因子RecA、Rec0、RecF和RecR的组合或所述重组因子的编码多核苷酸的 组合物；
[0058] 3).根据欲加以改造的昆虫DNA序列设计的两种或两种以上的sgRNA ;和
[0059] 4).任选的，包含外源性基因的供体DNA。
[0060] 在第三方面，本发明提供一种昆虫细胞定点基因敲入的方法，所述方法包括：
[0061] 1).利用单切口酶或其编码多核苷酸在欲加以改造的DNA序列上产生双重单链缺 口或多对双重单链缺口；和
[0062] 2).利用重组因子将外源性基因敲入昆虫细胞的基因组。
[0063] 在优选的实施方式中，利用单切口酶或其编码多核苷酸在欲加以改造的DNA序列 上产生双重单链缺口。
[0064] 在优选的实施方式中，在欲加以改造的DNA序列上产生的单链缺口之间的距离为 50-500bp ;优选 70-400bp ;最优选 80-200bp。
[0065] 在另一优选的实施方式中，所述重组因子是RecA、Rec0、RecF和RecR中一种或多 种的组合。
[0066] 在另一优选的实施方式中，所述重组因子是RecA、Rec0、RecF和RecR的组合。
[0067] 在优选的实施方式中，所述昆虫包括但不限于：果蝇、蝇、蚊、蝗虫、白蚁、水稻虱、 蚜虫、棉铃虫等致病或有害昆虫,或瓢虫、螳螂等有益昆虫，蜜蜂、蚂蚁等经济昆虫有益昆 虫。
[0068] 在优选的实施方式中，所述组合物或方法可在昆虫细胞中精确整合10kb以上的 外源性DNA片段。
[0069] 在优选的实施方式中，所述组合物或所述方法在昆虫细胞中诱发同源重组整合的 效率高于40% ;更优选地，高于50% ;最优选地，所述组合物或所述方法诱发同源重组整合 的效率为55~70%。
[0070] 在优选的实施方式中，所述组合物或所述方法在昆虫细胞中诱发同源重组整合并 广生稳定遗传转基因昆虫品系的效率商于25%。
[0071] 在第四方面，本发明提供一种制备转基因昆虫细胞或个体的方法，所述方法包括 以下步骤：
[0072] 1).利用本发明第二方面所述的组合物将外源性基因导入昆虫细胞；和
[0073] 2).由得到的细胞衍生昆虫个体或品系。
[0074] 在优选的实施方式中，所述昆虫包括但不限于：果蝇、蝇、蚊、蝗虫、白蚁、水稻虱、 蚜虫、棉铃虫等致病或有害昆虫,或瓢虫、螳螂等有益昆虫，蜜蜂、蚂蚁等经济昆虫有益昆 虫。
[0075] 在优选的实施方式中，所述昆虫细胞包括但不限于昆虫受精卵、昆虫原代培养细 胞、昆虫细胞系如S2、Sf9等等。
[0076] 在第五方面，本发明提供本发明第一或第二方面所述的组合物在昆虫细胞定点基 因敲入或制备转基因昆虫动物中的用途。
[0077] 在优选的实施方式中，所述昆虫包括但不限于：果蝇、蝇、蚊、蝗虫、白蚁、水稻虱、 蚜虫、棉铃虫等致病或有害昆虫,或瓢虫、螳螂等有益昆虫，蜜蜂、蚂蚁、家蚕等经