专利名称：提高转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法
技术领域：
本发明涉及一种转基因表达系统，具体涉及一种提高转基因昆虫细胞表达 外源基因水平的方法。
背景技术：
目前应用的昆虫杆状病毒表达系统主要有两个，一个以苜蓿尺蠖夜蛾核型 多角体病毒为载体，以秋粘虫细胞，菜青虫细胞或昆虫为宿主另一为以家蚕 核型多角体病毒为载体，以家蚕细胞或家蚕虫体及蛹体为表达宿主。两个表达 系统都以各自病毒载体的多角体蛋白基因或P10基因或极早期基因IE-1等强 启动子为外源基因表达的调控元件，通过将外源目的基因置于强启动子控制之 下的重组病毒感染宿主细胞，有重组杆状病毒在宿主和细胞体内进行大量复 制，在病毒感染宿主的晚期，外源基因的转录产物大量积累，在较短时间内得 到髙效表达。与上述昆虫杆状病毒表达载体系统相比，利用转化细胞表达外源基因有其 自身的优势(1) 翻译后加工完善，天然活性髙且稳定，可持续传代，生产效率髙；(2) 通过转化细胞表达，整个过程中不涉及杆状病毒，生物安全性相对提髙， 并且，外源基因整合进细胞基因组，不会出现因病毒感染而影响细胞功能的现 象，因此，表达产物能够得到更为有效的加工，如果借助无血清昆虫细胞培养 技术和分泌表达技术，表达产物将非常容易纯化。通常情况下，通过抗生素压力筛选可以获得稳定表达外源基因的转化细 胞。运用G418筛选哺乳动物转化细胞已有较多的报道，但通过稳定转化的昆 虫细胞表达外源基因的报道并不多见。Jarvis等用携带neo标记基因和ie-l(苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的极早期基因)启动子控制e -半乳糖苷酶基因表达盒的质粒转染sf-9细胞，通过G418压力筛选，获得转化sf-9细胞纯系，传 代50次(约6个月)后的细胞仍保留整合的质粒序列，传代IOO次的细胞仍能表达同质的e-半乳糖苷酶，但表达水平较低，约为杆状病毒表达载体系统(BEVS)的1% (J Cell Biochem， 1990,42:181-191)。最近，Invitrogeii公司开发了一种能在昆虫sf细胞稳定表达外源基因的载 体pIZT/V5-His,该载体利用黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)核型多角体 病毒的ie-2启动子控制外源基因，通过Zeochi的抗性标记筛选可获得稳定表 达外源基因的细胞系。鉴于利用转基因昆虫细胞表达外源基因具有的优越性，因此，独立研发提 高稳定转化昆虫细胞表达外源基因的水平的方法具有重要意义。发明内容本发明目的是提供一种提髙转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法。 为达到上述目的，本发明采用的技术方案是 一种提高转基因昆虫细胞表 达外源基因水平的方法，包括以下具体步骤(1) 构建昆虫细胞内具有活性的启动子X控制外源基因的载体；(2) 构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有报告基因的载 体pigA3-en;(3) 双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进 同样双酶切的pigA3-en,得带有增强子en和启动子X控制外源基因的载体；(4) 构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制新霉素抗性基因neo的重组 载体；(5) 酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制新霉素抗性基因的片段 Y-Neo,克隆进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有启动子X控制外源基因 表达盒、增强子元件、启动子Y控制新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的 重组转基因载体(6) 将步骤(5)所得重组转基因载体与表达转座酶的辅助质粒混合，转染昆虫 细胞系，通过G418的分段筛选获得转基因昆虫细胞，其中G418的终浓度为 800-2000fig/ml。上述技术方案中，昆虫细胞内具有活性的启动子X和Y选自杆状病毒的 极早期基因(ie-1)启动子、家蚕肌动蛋白(actin) A3启动子、巨细胞病毒(Cytomegalovirus)的CMV启动子、昆虫热激蛋白(hsp)启动子中的一种， 启动子X和启动子Y可以相同也可以不同；所述的增强子元件en选自家蚕丝 素蛋白轻链基因第1内含子序列一一fiben、杆状病毒的同源区一一hr3en中的 一种报告基因可以为荧光蛋白基因；昆虫细胞可以是家蚕细胞或者其他昆虫 组织建立的细胞系。上述技术方案中所述辅助质粒的选择为该技术领域中常规的技术，该领域 技术人员可以根据最后获得的具体转基因载体选择相应的辅助质粒。优选的技术方案中，昆虫细胞为家蚕细胞，启动子为杆状病毒的极早期基 因(ie-l)启动子和家蚕肌动蛋白(actin) A3启动子中的一种。上述技术方案中，转座子piggyBAC因子又称IFP2，是目前应用比较广 泛的昆虫转座子，已被证实在多种昆虫中可以发挥转座作用，可以通过转座而 将外源基因重组整合到昆虫基因组中，但据研究所知，piggyBac介导的转基 因家蚕细胞表达报告基因的水平较低(周文林等，蚕业科学，2007 ， 33(1):30-35),而且尚无用基于piggyBAC转座子的转基因载体提髙昆虫转基 因细胞表达外源基因的方法的报道。上述技术方案中，增强子(enhaiicer)指增加同它连锁的基因转录频率的 DNA序列。增强子是通过启动子来增加转录的。有效的增强子可以位于基因 的5'端，也可位于基因的3'端，有的还可位于基因的内含子中。增强子的 效应很明显， 一般能使基因转录频率增加10 200倍，有的甚至可以髙达上千 倍。增强子的作用同增强子的取向无关，甚至远离耙基因达几千kb也仍有增 强作用。本发明的基本原理为构建带有启动子X控制外源基因表达盒、增强子 元件、启动子Y控制新霉素抗性基因和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体 后，与表达转座酶的辅助质粒混合，转染昆虫细胞系，通过G418的分段筛选， 由于G418对一般细胞有杀伤作用，而转染的目的质粒上带有NEO抗药基因， 因此最后可以获得将外源基因整合入系统的转基因昆虫细胞；同时，为了提髙 转基因昆虫细胞对外源基因的表达水平，在构建转基因载体的过程中，克隆进 了增强子，并使用了 piggyBAC转座子，而且G418也可以给转染细胞压力， 使外源基因不易在染色体复制的过程中丢失。为进一步提髙昆虫转基因细胞对外源基因的表达水平，可以采用进一步的 技术方案，将获得的转基因细胞通过细胞克隆技术结合外源基因表达水平的实 际检测，获得外源基因高水平表达的工程细胞。本发明可以采用分泌表达并结合昆虫细胞无血清发酵培养技术，制备表达 产物工艺简单，成本低。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1. 由于采用转基因昆虫细胞表达外源基因，而没有采用昆虫杆状病毒表 达载体系统，因而可以实现外源基因的持续表达；表达产物无杆状病毒污染、 生物安全性髙；表达产物后加工完善、天然性好。2. 本发明在转入外源基因时增加了可用于压力筛选的抗性基因，不仅提 高转基因细胞筛选效率，同时G418也可以给转染细胞压力，使外源基因不易 在染色体复制的过程中丢失。3. 本发明的技术方案、原理不同于 Jarvis ( J Cell Biochem， 1990,42:181-191)的技术原理，也不同于Invitrogen公司开发的一种能在昆虫 sf细胞稳定表达外源基因载体pIZT/V5-His的技术原理，并将增强子元件引入 载体，使用了 piggyBAC转座子，并通过细胞克隆技术，结合外源基因表达水 平的实际检测，筛选得到外源基因髙水平表达的工程细胞。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例一一种提高转基因家蚕细胞表达人胰岛素样生长因子-I方法(A3 启动子控制下的IGF-I 、丝蛋白轻链基因第1内含子fiben、 IE-1启动子控制 的neo)，具体包括以下步骤1.人胰岛素样生长因子-I基因的制备根据业已公开的人胰岛素样生长因子-I基因的cDNA序列(GenBank登 录号M11568)，按常规人工合成人胰岛素样生长因子-I活性肽对应的DNA 序列TGGATATCACCATGggaccggagacgctctgcggggctgagctggtggatgctcttcagttc gtgtgtggagacaggggcttttatttcaacaagcccacagggtatggctccagcagtcggagggcgcctcagacaggcatcgtggatgagtgctgcttccggagctgtgatctaaggaggctggagatgtattgcgcacccctcaa gcctgccaagtcagctTAAGCTTCTCGAGAT为了便于克隆表达和提高表达水平，在5'端引入起始密码子ATG和 EcoRV的酶切位点，3'端引入终止密码子TAA和Xho I的酶切位点。2. 构建带有cDNA基因的pBluescriptII SK(+)重组质粒 将人工合成的DNA序列用EcoRV和Xho I双酶切，常规法回收酶切片段，与用EcoRV和Xho I双酶切的pBluescriptlISK(+)质粒(Stratagene公 司产品)连接。T4DNA连接酶为GIBCO BRL公司产品，连接条件为16'C, 12小时。连接产物转化大肠杆菌TG1菌株，通过蓝白斑培养筛选获得重组转化子， 小批量提取质粒DNA (参见《分子克隆》，1989，科学出版社)，用EcoRV 和Xho I酶切鉴定，有一条约230bp的片段被克隆，经测序证明已成功克隆了 IGF-I基因，所获得的重组质粒称之为pSK-IGF。3. A3启动子控制IGF-I基因的构建根据 pigA3GFP(参见Cary， L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156—69)的 序列，设计特异性弓l物A3-1 (tag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg)和A3-2(ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c), 以pigA3GFP为模板，常规PCR扩 增出A3启动子(约210 bp),经EcoR I 、 EcoRV双酶切后克隆进同样双酶 的pSK-IGF载体，获重组pSK-A3-IGF载体。根据GenBank已公开的序列(GenBank登录号M76430)设计特异性引 物TPFib隱L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt "g cgt tag g)和TPFib-L-4 (gcg gta cce act gtc caa tec acc gtc)，以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，扩增出约 290 bp的片段，测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经Xho I 和Kpnl双酶切后，与同样酶切的pSK-A3-IGF载体连接，获得重组载体 pSK-A3-IGF-polyA。4. 带有丝蛋白轻链增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体构建根据已公开的丝蛋白轻链基因的序列(GenBank登录号M76430)设计物 异性弓l物TPFib-L-5 (cgg ata tct atg ggc tcc agt aac c)和TPFib-L-6 (gcg tcg acg gtc agg tta gat taa cgg g),以家蚕基因组DNA为模板，常规PCR扩增， 获得丝素轻链基因第l内含子中具有增强子功能的约400bp左右的序列，Sal I 和EcoRV双酶切后，克隆进经Sal I和Sma I双酶切的PigA3GFP质粒，获 带有增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体，命名为pigA3-fiben。5. 带有增强子元件和A3启动子控制IGF- I外源基因的转基因载体的构建pSK-A3-IGF-polyA用EcoR I和Kpn I双酶切，回收A3控制IGF- I基 因的片段，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的pigA3-fiben载体，获得的新载 体命名为pigA3-A3-IGF-fiben6. 构建带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因 neo的重组载体以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，用IE-1基因启动子的特异性引物 对(5'ttc gaa ttc gat ttg cag "c ggg ac3', 5'gcg gat atc agt cgt ttg gtt gtt ca3') 进行PCR扩增，PCR产物用EcoRl 、 EcoRV双酶切后，克隆在 pBluescriptnSK(+)载体，获得带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子的载 体pSK隱IE。以pcDNA3.1载体(Invitrogen公司产品)为模板，以Neol (5'ctg ata tea tga "g aac aag atg g3')和Neo3 (5'agc tcg aga a" cta get aga ggt cga c30为 引物，PCR扩增出neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列(约1,1 kb), 经EcoRV、 Xho I酶切消化后，克隆进经过同样处理的pSK-IE载体中，获得 pSK-IE-Neo载体。7. 构建带有A3控制IGF- I表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo) 和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体pSK-IE-Neo载体用EcoRl酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆进同样酶切的pigA3-A3-IGF-fiben质粒，获的重质粒 命名为pigA3-A3-IGF-fiben-neo。8. 转基因细胞的筛选采用常规脂质体介导法进行细胞转染。分别取二个eppendorf管，A管加 入重组质粒pigA3-A3-IGF-fiben-neo 2fig,辅助质粒helper 4pg(参见Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-deHved vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84),以TC-100培养基(FBSFree)将总体积补至50^L,混匀 备用。B管加入脂质体转染试剂(Lipofection) 10 ^L，以TC-100培养基(FBS Free)将总体积补至50 pL，将A、 B 二管混匀，室温静置30 min后转染Bm-N 细胞。转染第4天，添加G418至终浓度1000Hg/mL,筛选培养l个月后，添 加G418至终浓度1，500ng/mL,继续筛选2个月，获转IGF-I基因的细胞。9.克隆髙水平表达IGF- I的转基因细胞方法获得的转IGF- I基因细胞系通过极度稀释分注到96孔板，倒置荧光显微 镜观察寻找仅有一个荧光细胞的孔，注入正常的Bm-N细胞培养1周，添加 G418至终浓度lOOOjig/mL,筛选培养1个月后，添加G418至终浓度 1，500jig/mL,继续筛选2个月，获得克隆细胞株，对克隆细胞株进行ELISA 检测，筛选出髙水平(4pg/mL)表达IGF-I的克隆细胞，即工程细胞。实施例二 一种提髙转基因草地夜蛾Sf细胞表达人粒细胞-巨噬细胞集落 刺激因子的方法(A3启动子控制下的hGM-CSF、丝蛋白轻链第1内含子fiben、 IE-l控制的neo),具体步骤包括1. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因的制备人的T-淋巴样细胞系细胞100 mg,加液氮磨碎，加入GIBCOBRL公司 生产Trozol RNA提取液lmL,轻轻摇动10分钟后加入500 U L氯仿，在室温 下放置10分钟，12 OOOrpm离心10分钟，取上清，加入2倍上清体积的100% 冷乙醇，混匀后，12 OOOrpm离心10分钟，弃上清，加入反转录酶及4dNTPs 进行反转录，37'C, l小时，获得由mRNA反转录合成的cDNA。将获得的 cDNA , 加入 hGM-CSF 基因的上游引物 (tggatatcACCATGGGCatgtggctgcagagcctgc ， atctcgagaagcttatcactcctggac tggctccc，)进行PCR扩增，获得长度约为450 bp的hGM-CSF的cDNA片段。2. 构建带有hGM-CSF基因的pBluescriptn SK(+)重组质粒获得的hGM-CSF的cDNA片段用EcoRV和Xho I双酶切，常规法回收 酶切片段，与用 EcoRV和 Xho I双酶切的 pBluescriptll SK(+)质粒 (Stratagene公司产品)连接。T4 DNA连接酶为GIBCO BRL公司产品，连 接条件为16'C, 12小时。连接产物转化大肠杆菌TGI菌株，通过蓝白斑培养筛选获得重组转化子， 小批量提取质粒DNA (参见《分子克隆》，1989,科学出版社)，用EcoRV 和Xho I酶切鉴定，有一条约450bp的片段被克隆，经测序证明已成功克隆了 hGM-CSF基因，所获得的重组质粒称之为pSK-hGM-CSF。3. A3启动子控制hGM-CSF基因的构建根据 pigA3GFP(参见Cary, L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989， 172:156—69)的 序列，设计特异性弓l物A3-1 (tag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg， ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c)，以pigA3GFP为模板，常规PCR扩增出 A3启动子(约210 bp),经EcoRl 、 EcoRV双酶切后克隆进同样双酶切的 pSK-hGM-CSF载体，获重组pSK-A3-hGM-CSF载体。根据GenBank已公开的序列(GenBank登录号M76430)设计特异性引 物TPFib-L-3 (ggc tcg age aaa ttg tgt ttg cgt tag g)和TPFib-L-4 (gcg gta ccc act gtc caa tec acc gtc)，以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，扩增出约 290 bp的片段，测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经Xho I 和KpnI双酶切后，与同样酶切的pSK-A3-hGM-CSF载体连接，获得重组载 体pSK國A3-hGM-CSF-polyA。4. 带有丝蛋白轻链增强子元件fibeii的基于piggyBAC转座子的转基因 载体构建同实施例一中步骤4。5. 带有增强子元件fiben和A3启动子控制hGM-CSF外源基因的转基因 载体的构建pSK-A3-hGM-CSF-polyA用EcoR I和Kpnl双酶切，回收A3控制 hGM-CSF基因的片段，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的pigA3-fiben载体，获得的新载体命名为pigA3-A3-hGM-CSF-fiben。6. 构建带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因 neo的重组载体同实施例一中步骤6。7. 构建带有A3控制hGM-CSF表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo) 和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体pSK-IE-Neo载体用EcoRl酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo，克隆进同样酶切的pigA3-A3-hGM-CSF-fiben质粒，获的 重质粒命名为pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo。8. 转基因细胞的筛选采用常规脂质体介导法进行细胞转染。分别取二个eppendorf管，A管加 入重组质粒pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo 2pg，辅助质粒helper 4pg (参见 Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84),以TC-100培养基(FBSFree)将总体积补至50 |iiL,混匀 备用。B管加入脂质体转染试剂(Lipofection) 10 pL,以TC-100培养基(FBS Free)将总体积补至50 pL，将A、 B 二管混匀，室温静置30 min后转染草地 夜蛾Sf细胞。转染第4天，添加G418至终浓度lOOOpg/mL,筛选培养1个 月后，添加G418至终浓度1，500ng/mL,继续筛选2个月，获转hGM-CSF基 因的细胞。9. 克隆髙水平表达hGM-CSF的转基因细胞获得的转hGM-CSF基因细胞通过极度稀释分注到96孔板，倒置荧光显 微镜观察寻找仅有一个荧光细胞的孔，注入正常的sf细胞培养1周，添加G418 至终浓度lOOO^ig/mL,筛选培养l个月后，添加G418至终浓度l，500ng/mL， 继续筛选2个月，获得克隆细胞株，对克隆细胞株进行ELISA检测，筛选出 髙水平(5pg/mL)表达hGM-CSF的克隆细胞，即工程细胞。实施例三 一种提高转基因家蚕细胞表达hGM-CSF的方法(A3启动子 控制下的hGM-CSF、 hr3的en、 IE-1控制的neo),具体包括下列步骤1. 人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子基因的制备 同实施实例二中步骤1。2. 构建带有hGM-CSF基因的pBluescriptII SK(+)重组质粒 同实施实例二中步骤2。3. A3启动子控制hGM-CSF基因的构建 同实施实例二中步骤3。4. 带有hr3增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体构建 根据GenBank登录号L33180的公开序列设计引物，以家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的基因组DNA为模板，以TPhr3-l(ctg gta ccg ccg tgc cca gtc acg tgt acg cc)和TPhr3隱2 (etc ccg ggg tga aca gcc cat tcg agg c) 为弓l物， 常规PCR扩增，获得家蚕核多角体病毒(BmNPV)同源区序列(homologous region)的hr3中具有增强子功能的约740 bp左右的序列，Kpn I和Sma I双 酶切后，克隆进经Kpn I和Sma I双酶切的PigA3GFP质粒，获带有hr3增 强子元件的基于PiggyBAC转座子的转基因载体，命名为pigA3-hr3en。5. 带有增强子元件hr3和A3启动子控制hGM-CSF外源基因的转基因载 体的构建pSK-A3-hGM-CSF-polyA用EcoR I和Kpnl双酶切，回收A3控制 hGM-CSF基因的片段，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的pigA3-hr3en载体， 获得的新载体命名为pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en6. 构建带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因 neo的重组载体同实施例一中步骤6。7. 构建带有A3控制hGM-CSF表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo) 和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体pSK-IE-Neo载体用EcoR I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆进同样酶切的pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en质粒，获的 重质粒命名为pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en-neo。8. 转基因细胞的筛选同实施实例二中步骤8，所不同的是pigA3-A3-hGM-CSF-fiben-neo被pigA3-A3-hGM-CSF-hr3en-neo所取代，细胞使用家蚕Bm-N细胞。 9.克隆髙水平表达hGM-CSF的转基因家蚕细胞方法同实施实例二中步骤9。不同的是通过极度稀释和ELISA实际检测 获得髙水平(5jig/mL)表达hGM-CSF的转基因家蚕细胞。实施例四 一种提高转基因家蚕细胞表达IGF- I的方法(IE启动子控制 下的IGF-I、 hr3增强子、IE-l控制的neo),具体包括以下步骤1. 人胰岛素样生长因子-I基因的制备 同实施例一中步骤1。2. 构建带有IGF- I基因的pBluescriptlISK(+)重组质粒 同实施例一中步骤2。3. IE启动子控制IGF-I基因的构建根据GenBank登录号L33180的公开序列，以家蚕核型多角体病毒的DNA 为模板，用IE-1基因启动子的特异性引物(5'ttc gaa ttc gat ttg cag ttc ggg ac3'， 5'gcg gat atc agt cgt ttg gtt gtt ca3')进行PCR扩增，PCR产物用 EcoRl、 EcoRV双酶切后，克隆进同样双酶的pSK-IGF载体，获重组 pSK-IE-IGF载体。根据GenBank登录号M76430的公开序列，设计特异性引物TPFib-L-3 (ggc tcg agc aaa "g tgt ttg cgt tag g)和TPFib-L-4 ( gcg gta ccc act gtc caa tec accgtc),以家蚕菁松品种的基因组DNA为模板，扩增出约290 bp的片段， 测序证明为丝素轻链基因的polyA信号序列，该片段经Xho I和Kpn I双酶 切后，与同样酶切的pSK-IE-IGF载体连接，获得重组载体pSK-IE-IGF-polyA。4. 带有hr3增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体构建 同实施例三中步骤4。5. 带有增强子元件和IE启动子控制IGF- I外源基因的转基因载体的构建pSK-IE-IGF-polyA用EcoR I和Kpnl双酶切，回收IE启动子控制 IGF-I基因的片段，克隆进EcoR I和Kpn I双酶切的pigA3-hr3en载体，获 得的新载体命名为pigA3-IE-IGF-hr3en6. 构建带有家蚕核型多角体病毒IE-1基因启动子控制新霉素抗性基因 neo的重组载体同实施例一中步骤6。7. 构建带有IE控制IGF- I表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo) 和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体pSK-IE-Neo载体用EcoR I酶切，回收带有IE启动子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆进同样酶切的pigA3-IE-IGF-hr3en质粒，获的重质粒 命名为pigA3-IE-IGF-hr3en-neo。8. 转基因细胞的筛选同实施例一中步骤8。所不同的是这里使用了 pigA3-IE-IGF-hr3en-neo 替代pigA3-A3-IGF-fiben-neo。9. 克隆高水平表达IGF的转基因细胞方法 同实施例一中步骤9。实施例五 一种提髙转基因家蚕细胞表达IGF- I的方法(A3启动子控制 下的IGF- I 、丝蛋白轻链第1内含子fiben、 A3控制的neo)，具体包括下列 步骤1. 人胰岛素样生长因子-I基因的制备 同实施例一中步骤1。2. 构建带有IGF- I基因的pBluescriptlISK(+)重组质粒 同实施例一中步骤2。3. A3启动子控制IGF-I基因的构建 同实施例一中步骤3。4. 带有丝蛋白轻链增强子元件的基于piggyBAC转座子的转基因载体构建同实施例一中步骤4。5. 带有增强子元件和A3启动子控制IGF- I外源基因的转基因载体的构建同实施例一中步骤5。6. 构建带有家蚕核型多角体病毒A3启动子控制新霉素抗性基因iieo的 重组载体根据 pigA3GFP(参见Cary， L.C. et al. Transposon mutagenesis of baculoviruses: analysis of Trichoplusia ni transposon IFP2 insertions within the FP-locus of nuclear polyhedrosis viruses. Virology, 1989, 172:156-69)的 序列，设计特异性引物A3-l "ag aat tct gcg cgt tac cat ata tgg tg, ctg ata tea gta tta tta aat aag tga caa gta c)，以pigA3GFP为模板，常规PCR扩增出 A3启动子(约210 bp),经EcoRl 、 EcoRV双酶切后克隆进同样双酶切的 pBhiescriptllSK(+)载体，获得带有家蚕核型多角体病毒A3启动子的载体 pSK-A3。以pcDNA3.1载体(Invitrogen公司产品)为模板，以Neol (5'ctg ata tea tga ttg aac aag atg g3')和Neo3 (5'agc tcg aga a" cta get aga ggt cga c3')为 引物，PCR扩增出neo基因的编码序列及其下游的polyA信号序列(约1.1 kb)， 经EcoRV、 Xho I酶切消化后，克隆进经过同样处理的pSK-A3载体中，获 得pSK-A3-Neo载体。7. 构建带有A3控制IGF- I表达盒、增强子元件、新霉素抗性基因(neo) 和荧光蛋白报告基因的重组转基因载体pSK-A3-Neo载体用EcoR I酶切，回收带有A3启动子控制新霉素抗性基 因的片段IE-Neo,克隆进同样酶切的pigA3-A3-IGF-fiben质粒，获的重质粒 命名为pigA3-A3-IGF-fiben-A3neo。8. 转基因细胞的筛选釆用常规脂质体介导法进行细胞转染。分别取二个eppendorf管，A管加 入重组质粒pigA3-A3-IGF-fiben-A3neo 2pg，辅助质粒helper 4pg (参见 Tamura Toshiki. et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori Lu using a piggyBac transposon-derived vector. Nature Biotechnology, 2000,18:81-84)，以TC-100培养基(FBSFree)将总体积补至50nL，混匀 备用。B管加入脂质体转染试剂(Lipofection) 10 jiL，以TC-100培养基(FBS Free)将总体积补至50 pL，将A、 B 二管混匀，室温静置30 min后转染Bm-N 细胞。转染第4天，添加G418至终浓度1000jig/mL，筛选培养l个月后，添加G418至终浓度1，500ftg/mL,继续筛选2个月，获转IGF-I细胞系。 9.克隆髙水平表达IGF-1的转基因细胞方法 方法同实施实例一中步骤9。
权利要求
1. 一种提高转基因昆虫细胞表达外源基因水平的方法，包括以下具体步骤(1)构建昆虫细胞内具有活性的启动子X控制外源基因的载体；(2)构建带有增强子元件en的基于piggyBAC转座子的带有报告基因的载体pigA3-en；(3)双酶切步骤(1)所得载体，回收启动子X控制外源基因的片段，克隆进同样双酶切的pigA3-en，得带有增强子en和启动子X控制外源基因的载体；(4)构建昆虫细胞内具有活性的启动子Y控制新霉素抗性基因neo的重组载体；(5)酶切步骤(4)所得载体，回收启动子Y控制新霉素抗性基因的片段Y-Neo，克隆进同样酶切的步骤(3)所得载体，得到带有启动子X控制外源基因表达盒、增强子元件、启动子Y控制新霉素抗性基因、荧光蛋白报告基因的重组转基因载体；(6)将步骤(5)所得重组转基因载体与表达转座酶的辅助质粒混合，转染昆虫细胞系，通过G418的分段筛选获得转基因昆虫细胞。
2. 根据权利要求1所述的一种提髙转基因昆虫细胞表达外源基因水平的 方法，其特征在于所述昆虫细胞为家蚕细胞。
3. 根据权利要求1所述的一种提髙转基因昆虫细胞表达外源基因水平的 方法，其特征在于所述增强子元件选自家蚕丝素蛋白轻链基因第1内含子序 列或杆状病毒的同源区中的一种。
4. 根据权利要求1所述的一种提髙转基因昆虫细胞表达外源基因水平的 方法，其特征在于所述昆虫细胞内具有活性的启动子选自杆状病毒的极早期 基因IE-1启动子，也可以为家蚕肌动蛋白A3启动子、巨细胞病毒的CMV启 动子、昆虫热激蛋白启动子中的一种。
5. 根据权利要求1所述的一种提髙转基因昆虫细胞表达外源基因水平的 方法，其特征在于将步骤(6)所得的转基因昆虫细胞通过细胞克隆技术，结合 外源基因表达水平的实际检测，获得表达外源基因的工程细胞。
全文摘要
本发明公开了一种提高昆虫转基因细胞表达外源基因的方法，将在昆虫细胞内具有活性的启动子控制的新霉素抗性基因表达盒、增强子元件和外源基因表达盒通过基因操作克隆进以转座子piggyBAC因子为基础的带有报告基因的载体，然后与表达转座酶的辅助质粒混合转染昆虫细胞系，通过G418的分段筛选获得转基因昆虫细胞。该转基因细胞通过细胞克隆技术，结合外源基因表达水平的实际检测获得外源基因高水平表达的工程细胞。本发明方法实现了转基因昆虫细胞高水平持续表达外源基因，表达产物无杆状病毒污染，生物安全性高，后加工完善，天然性好。
文档编号C12N5/10GK101270366SQ200810025299
公开日2008年9月24日 申请日期2008年4月30日 优先权日2008年4月30日
发明者周文林, 曹广力, 沈卫德, 薛仁宇, 贡成良 申请人:苏州大学